陳秀琳 李琳琳 陳玉鑫 李廣偉

摘要

為研究梨小食心蟲Grapholita?molesta?Busck嗅覺通訊分子機(jī)制，本研究應(yīng)用RTPCR克隆獲得了梨小食心蟲氣味受體基因GmolOR10的完整開放閱讀框，并對其序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析，最后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對GmolOR10在梨小食心蟲成蟲不同組織（觸角、頭、胸、腹、足、翅）與不同發(fā)育階段的表達(dá)模式進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明，GmolOR10編碼區(qū)長1?194?bp，編碼397個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)和相對分子量分別為8.57和46.14?kD，有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示GmolOR10與卷蛾科蘋果蠹蛾Cydia?pomonella?CpomOR18和山毛櫸卷葉蛾Cydia?fagiglandana?CfagOR18的氨基酸序列一致性較高，分別為84.38%和83.38%。GmolOR10在雄成蟲觸角中表達(dá)量較高，極顯著高于雌蟲觸角（P<0.01），在雌、雄成蟲頭部也有較高的表達(dá)量，在成蟲其他組織表達(dá)量很低。不同發(fā)育階段的表達(dá)譜顯示，GmolOR10在梨小食心蟲的不同發(fā)育階段均有表達(dá)，在成蟲期的表達(dá)量最高（在雌雄成蟲中的表達(dá)量均呈現(xiàn)出隨著日齡增加逐漸升高然后下降的趨勢），在其他發(fā)育階段的表達(dá)量相對較低。GmolOR10具有昆蟲氣味受體的結(jié)構(gòu)特征，在雌、雄蟲觸角高表達(dá)，在各發(fā)育階段均有表達(dá)，據(jù)此推測GmolOR10可能與梨小食心蟲覓食、感受及識別性信息素的過程有關(guān)。

關(guān)鍵詞

梨小食心蟲;?氣味受體10;?基因克隆;?實(shí)時(shí)定量PCR;?表達(dá)模式

中圖分類號：

S?433

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022099

Cloning?and?expression?profiling?of?odorant?receptor?gene?GmolOR10?in?Grapholita?molesta?Busck

CHEN?Xiulin*，?LI?Linlin，?CHEN?Yuxin，?LI?Guangwei

（College?of?Life?Science，?Yanan?University，?Shaanxi?Key?Laboratory?of?Chinese?Jujube，?Yanan?716000，?China）

Abstract

In?order?to?investigate?the?molecular?mechanism?of?olfactory?communication?in?Grapholita?molesta?Busck，?GmolOR10?was?cloned?by?RTPCR?in?this?study.?The?sequence?structure?of?GmolOR10?was?analyzed?by?using?bioinformatics?software，?and?then?its?expression?profiles?in?different?adult?tissues?（antenna，?head，?thorax，?abdomen，?leg?and?wing）?and?at?different?developmental?stages?were?measured?by?realtime?quantitative?PCR.?The?results?revealed?that?the?CDS?of?GmolOR10?was?1?194?bp?in?length，?encoding?397?amino?acid?residues，?with?a?predicted?theoretical?isoelectric?point?and?a?relative?molecular?mass?of?8.57?and?46.14?kD，?respectively，?and?seven?transmembrane?domains.?Multiple?sequence?alignment?and?phylogenetic?analysis?indicated?that?GmolOR10?was?closely?related?to?the?odorant?receptor?CpomOR18?from?Cydia?pomonella?and?CfagOR18?from?Cydia?fagiglandana，?with?an?amino?acid?sequence?identity?of?84.38%?and?83.38%，?respectively.?Tissuespecific?expression?profiling?showed?that?abundant?expression?of?GmolOR10?existed?in?the?antenna?of?male，?extremely?higher?than?that?in?the?antenna?of?female?moth?（P<0.01）.?GmolOR10?also?showed?higher?expression?in?the?head?of?both?sexes，?and?displayed?low?expression?level?in?the?other?tissues.?Developmental?stagespecific?expression?profiling?demonstrated?that?GmolOR10?was?expressed?at?different?developmental?stages?of?G.molesta?and?the?expression?level?of?GmolOR10?at?adult?stage?was?higher?（the?expression?levels?in?male?and?female?moths?increased?first?and?then?decreased?with?dayage），?and?relatively?lower?expression?was?detected?at?other?developmental?stages.?Based?on?the?structural?characteristics?and?the?expression?profiling?results?of?GmolOR10，?it?is?speculated?that?GmolOR10?may?be?involved?in?the?process?of?foraging，?feeling?and?recognition?of?sex?pheromones?in?G.molesta.

Key?words

Grapholita?molesta;?odorant?receptor?10;?gene?cloning;?realtime?quantitative?PCR;?expression?profile

梨小食心蟲Grapholita?molesta?Busck隸屬鱗翅目Lepidoptera卷蛾科Tortricidae，是一類世界性的果樹害蟲，給果業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。在國內(nèi)，除西藏尚未見報(bào)道外，其在全國各地均有分布，尤其在北方桃、梨和蘋果產(chǎn)區(qū)發(fā)生最為嚴(yán)重［1］。在國外，梨小食心蟲除分布于亞洲許多國家之外，在歐洲、美洲、非洲北部、澳大利亞與新西蘭也都有發(fā)現(xiàn)［23］。梨小食心蟲有轉(zhuǎn)主為害習(xí)性。春季和夏初主要在桃園蛀食果樹新梢和果實(shí)，夏末和秋初轉(zhuǎn)移至梨園或蘋果園繼續(xù)為害，在桃、梨或桃、蘋果混栽林區(qū)，此種現(xiàn)象尤為嚴(yán)重［4］。目前，對梨小食心蟲的防治仍以噴施化學(xué)農(nóng)藥為主［3］，鑒于其以幼蟲蛀食為害，生活環(huán)境極其隱蔽，成蟲跨園飛行能力極強(qiáng)等特征，化學(xué)防治效果往往不理想，而高劑量、高頻次地噴灑農(nóng)藥勢必引起環(huán)境污染、天敵數(shù)量銳減、害蟲抗藥性增強(qiáng)、果品農(nóng)藥殘留及質(zhì)量下降等一系列問題。因此亟須探索出一種高效、無公害的新方法防治該蟲。

在長達(dá)幾億年的進(jìn)化過程中，昆蟲靈敏的嗅覺系統(tǒng)與其生存、繁衍息息相關(guān)［5］。昆蟲通過復(fù)雜敏銳的嗅覺系統(tǒng)識別環(huán)境中的各類化學(xué)物質(zhì)，將化學(xué)信號轉(zhuǎn)換成電信號最終傳遞給腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng)指導(dǎo)昆蟲做出相應(yīng)的行為反應(yīng)。許多與嗅覺有關(guān)的蛋白參與了昆蟲對外界環(huán)境的識別過程，如化學(xué)感受蛋白（chemosensory?proteins，CSPs）、氣味結(jié)合蛋白（odorant?binding?proteins，OBPs）、氣味受體（odorant?receptors，ORs）、離子型受體（ionotropic?receptors，IRs）、氣味降解酶（odorant?degrading?enzymes，ODEs）、感覺神經(jīng)元膜蛋白（sensory?neuron?membrane?proteins，SNMPs）和尼曼匹克C2型蛋白（NiemannPick?type?C2?protein，NPC2）等［67］。昆蟲對外圍環(huán)境的識別過程中，ORs發(fā)揮了核心作用［5，8］。昆蟲的ORs是一種在嗅覺神經(jīng)元（olfactory?sensory?neurons，OSNs）中表達(dá)的膜蛋白，具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其C端位于細(xì)胞膜外，N端在細(xì)胞內(nèi)［5］。昆蟲ORs可以分為兩類：一類是非典型氣味受體（typical?odor?receptor），也稱作嗅覺受體共受體（odorant?receptor?coreceptor，Orco），一般情況下每種昆蟲中只有一個(gè)Orco，在不同種類的昆蟲中同源性非常高;另一類是典型氣味受體（conventional?odorant?receptor，ORX），數(shù)量眾多，在同種昆蟲和不同種類昆蟲中均高度分化［9］。研究表明Orco一般不單獨(dú)與配體結(jié)合，而是與ORX形成異源二聚體在氣味受體神經(jīng)元（odorant?receptor?neurons，ORNs）樹突膜上共表達(dá)，其主要功能是提高ORX對氣味配體的結(jié)合能力和ORX在神經(jīng)元樹突上定位的準(zhǔn)確性［10］。近年來，隨著高通量測序的普及和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，已經(jīng)從許多農(nóng)林害蟲如蘋果蠹蛾?Cydia?pomonella、桃小食心蟲?Carposina?sasakii、葡萄花翅小卷蛾?Lobesia?botrana、蘋淺褐卷蛾Epiphyas?postvittana、歐洲玉米螟?Ostrinia?nubilalis、棉鈴蟲?Helicoverpa?armigera、星天牛Anoplophora?chinensis、蘋小吉丁Agrilus?mali等200余種昆蟲中鑒定到大量的ORs基因［1116］。

目前，對梨小食心蟲嗅覺相關(guān)基因的研究主要集中在OBPs、CSPs、信息素結(jié)合蛋白（pheromone?binding?proteins，PBPs）與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione?Stransferase，GSTs），通過雌蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測序、基因克隆、組織表達(dá)譜和與寄主植物氣味配體的結(jié)合試驗(yàn)，對相關(guān)基因的功能進(jìn)行了研究［1719］。對梨小食心蟲ORs基因的研究較少。開展對梨小食心蟲氣味受體的研究有助于了解其嗅覺識別特點(diǎn)，還可為科學(xué)防控該蟲提供理論參考。前期通過對梨小食心蟲雌蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得了GmolOR10的編碼區(qū)（coding?regions，CDS），本研究通過常規(guī)分子克隆方法獲得了GmolOR10完整的開放閱讀框（open?reading?frame，ORF），對其序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，最后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析GmolOR10在梨小食心蟲雌、雄成蟲不同組織及不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，以期為將來更加深入研究該氣味受體的功能奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試?yán)ハx

2008年春末在陜西省楊凌示范區(qū)郊區(qū)桃園采集梨小食心蟲幼蟲，已在實(shí)驗(yàn)室人工喂養(yǎng)100多代，每年春末和夏初從桃園采集野生幼蟲種群復(fù)壯。在人工氣候培養(yǎng)箱中，幼蟲用人工飼料和蘋果混合喂養(yǎng)［20］，成蟲用5%的白砂糖水或蜂蜜水喂養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度（25±1）℃，相對濕度（65±5）%，光周期L∥D=15?h∥9?h。

1.2?主要試劑

總RNA提取試劑TRIzol、DNA?2000?Marker、10×?Loading?Buffer、克隆載體pMD19T、SYBR?Premix?Ex?TaqTM?（Perfect?Real?Time）購自TaKaRa公司;First?Strand?cDNA?Synthesis?Kit購自西安熱默爾生物科技有限公司;高保真DNA?Polymerase購自南京諾唯贊生物科技有限公司;DH5α感受態(tài)細(xì)胞與瓊脂糖DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;引物合成與測序均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.3?不同組織和不同發(fā)育階段梨小食心蟲總RNA提取及第一鏈cDNA的合成

收集3日齡梨小食心蟲雌、雄成蟲觸角各200根，頭（去掉觸角）各50個(gè)、胸各10個(gè)、腹各5個(gè)、各100頭蟲的足、各100頭蟲的翅;卵約400粒、1齡和2齡幼蟲各50頭、3齡幼蟲30頭、4?齡幼蟲10頭、5齡幼蟲5頭、蛹2個(gè)、不同日齡（1、3、5、7日齡）的雌、雄成蟲各2頭。將以上樣品分別置入1.5?mL無RNA酶離心管中，在液氮中速凍后保存在－80℃冰箱備用。上述的每個(gè)樣品為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

參照TRIzol試劑盒說明，將上述樣品在無RNA酶離心管內(nèi)研磨后提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。核酸蛋白濃度測定儀（SimpliNano，GE）檢測RNA質(zhì)量和濃度，檢測合格的樣品用DNaseⅠ去除基因組DNA，然后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成第一鏈cDNA，保存于－80℃冰箱備用。

1.4?引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)梨小食心蟲雌蟲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得GmolOR10序列［17］，使用Primer?6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增該基因完整的開放閱讀框;利用Primer?3在線軟件（https：∥primer3.ut.ee/#?PRIMER_SEQUENCE_INPUT）?設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（表1）。選用梨小食心蟲的EF1α基因?yàn)閮?nèi)參基因（GenBank登錄號：?KT363835.1）［21］。

1.5?GmolOR10基因克隆、測序與鑒定

以梨小食心蟲雌蟲觸角cDNA為模板（100?ng/μL），擴(kuò)增GmolOR10的開放閱讀框。PCR?擴(kuò)增體系：DNA?聚合酶12.5?μL，10?μmol/L上、下游引物各1.5?μL，cDNA模板1.5?μL，ddH2O?8.0?μL，充分混勻、短暫離心。PCR反應(yīng)條件：95℃?5?min;95℃?30?s，58℃?45?s，72℃?90?s，循環(huán)40次;72℃延伸10?min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠檢測后純化目的條帶。將純化后的PCR產(chǎn)物連接至克隆載體pMD19T，再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR檢測后將陽性克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.6?GmolOR10和其他昆蟲相關(guān)序列的多序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過在線軟件ORF?Finder?（http：∥bioinf.ibun.unal.edu.co/servicios/sms/orf_find.html）預(yù)測梨小食心蟲GmolOR10基因的開放閱讀框，利用軟件BioEdit將核酸序列翻譯成氨基酸序列，用http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/預(yù)測GmolOR10的跨膜結(jié)構(gòu)域和蛋白分子量。用在線軟件https：∥web.expasy.org/compute_pi/預(yù)測理論等電點(diǎn);使用軟件DNAMAN對GmolOR10和其他昆蟲的ORX氨基酸序列一致性進(jìn)行分析，使用MEGA?6.0?軟件中的鄰接法（neighborjoining?method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（bootstrap：?1?000次）。

1.7?RTqPCR檢測GmolOR10的相對表達(dá)量

以1.3中獲得的cDNA（稀釋至200?ng/μL）為模板，以梨小食心蟲的延伸因子1α?（GmolEF1α）為內(nèi)參基因，利用相對定量法分析GmolOR10在成蟲不同組織、不同發(fā)育階段和成蟲不同日齡的表達(dá)狀況。反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀CFX96（BioRad）中進(jìn)行。qPCR反應(yīng)體系：cDNA模板2?μL，10?μmol/L的正、反向引物各1?μL，SYBRPremix?Ex?TaqTM?10?μL，DEPC水補(bǔ)足至20?μL，以加DEPC水為陰性對照組。qPCR反應(yīng)程序：95℃?30?s;?95℃?10?s，59℃?30?s，72℃?30?s，40個(gè)循環(huán);59～95℃記錄熔解曲線。每個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)，用2－△△Ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量［22］。

1.8?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS?19.0軟件對GmolOR10在成蟲不同組織、不同發(fā)育階段的表達(dá)差異進(jìn)行單因素方差分析（Tukey檢驗(yàn)），GmolOR10在雌雄成蟲同一組織間的表達(dá)差異進(jìn)行獨(dú)立樣本t測驗(yàn)（independent?samples?ttest），用GraphPad?Prism?6.0軟件繪制圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?GmolOR10基因的克隆和序列分析

通過基因克隆獲得到梨小食心蟲GmolOR10的完整編碼區(qū)（GenBank登錄號：URZ86304.1）。GmolOR10的開放閱讀框（open?reading?frame，ORF）全長1?194?bp，編碼397個(gè)氨基酸（圖1），預(yù)測的蛋白等電點(diǎn)和分子量分別為8.57與46.14?kD。經(jīng)TMHMM?2.0軟件分析發(fā)現(xiàn)GmolOR10有7個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane?domain），跨膜區(qū)分別位于第4－27、39－61、71－90、123－145、184－206、269－291、296－318氨基酸之間，該蛋白N端位于細(xì)胞內(nèi)，C端位于細(xì)胞膜外（圖1）。

2.2?GmolOR10與其他昆蟲相關(guān)序列的多序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化分析

經(jīng)BLAST同源搜索和序列比對發(fā)現(xiàn)，昆蟲種間的ORX相對于Orco序列相似度較低。相對N端，GmolOR10與其他昆蟲的ORX的C端保守性更高一些（圖2）。GmolOR10與蘋果蠹蛾Cydia?pomonella?CpomOR18的氨基酸序列一致性最高，為84.38%;與山毛櫸卷葉蛾?C.fagiglandana?CfagOR18的氨基酸序列一致性也較高，為83.38%;?與棉鈴蟲H.armigera?HarmOR10、二點(diǎn)委夜蛾Athetis?lepigone?AlepOR8?和煙草夜蛾Manduca?sexta?MsexOR31的氨基酸序列一致性較低，分別為76%，75%和74%。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，所選擇的昆蟲ORs分化成了2個(gè)大的分支，即所有昆蟲的嗅覺受體共

受體（Orco）聚于一個(gè)分支上，典型氣味受體（ORX）聚到另一個(gè)大分支。GmolOR10與ORX聚為一支，并且與卷蛾科的蘋果蠹蛾（CpomOR18）、山毛櫸卷葉蛾（CfagOR18）、葡萄花翅小卷蛾?L.?botrana?（LbotOR18）等鱗翅目卷蛾科昆蟲的ORX聚到了一小分支，說明它們的遺傳距離近，一致性相對較高，親緣關(guān)系更近，此結(jié)果與多序列比對結(jié)果一致（圖3）。

2.3?GmolOR10的表達(dá)譜分析

以梨小食心蟲雌蟲足中的GmolOR10?mRNA表達(dá)量為基準(zhǔn)，對其在不同組織中的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析（圖4）。結(jié)果表明，GmolOR10在雌雄蟲不同組織中均有表達(dá)，其表達(dá)量表現(xiàn)出性別差異。GmolOR10在雄蟲觸角中的表達(dá)量最高，極顯著高于雌蟲觸角中的表達(dá)量（P＜0.01），是其在雌蟲觸角中表達(dá)量的3倍;在雄蟲頭部（去除觸角）表達(dá)量也較高，顯著高于其在雌蟲頭部的表達(dá)量（P＜0.05），是其在雌蟲頭部表達(dá)量的2.2倍。GmolOR10在雌雄成蟲的胸、腹、足和翅中的表達(dá)量很低，其中在雄蟲腹、足、翅中的表達(dá)量均比雌蟲高。

以梨小食心蟲卵中的GmolOR10?mRNA含量為標(biāo)準(zhǔn)，對不同發(fā)育階段的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析。由結(jié)果（圖5）可知，GmolOR10在梨小食心蟲的不同發(fā)育階段均有表達(dá)，在成蟲階段的表達(dá)量最高，其次是卵、1日齡蛹和5日齡蛹。GmolOR10在成蟲階段的表達(dá)量以3日齡最高，隨后出現(xiàn)下降趨勢;其在3日齡雄蟲中的表達(dá)量是雌蟲的1.62倍（P<0.05）;在1日齡和3日齡雄蟲中的表達(dá)量也高于其在同日齡雌蟲中的表達(dá)量，分別是雌蟲中表達(dá)量的1.20倍和1.46倍;在幼蟲期的表達(dá)量相對較低。

3?結(jié)論與討論

靈敏的嗅覺系統(tǒng)在昆蟲覓食、尋偶、定位產(chǎn)卵場所等生命活動過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，嗅覺受體是昆蟲觸角外周嗅覺系統(tǒng)識別外界環(huán)境中氣味分子的關(guān)鍵蛋白，它們的序列結(jié)構(gòu)相似［17，34］。本研究基于梨小食心蟲雌蟲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過常規(guī)分子克隆方法獲得了GmolOR10完整的開放閱讀框，利用在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)GmolOR10有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其N端位于細(xì)胞膜內(nèi)，C端位于細(xì)胞膜外，跨膜結(jié)構(gòu)域的數(shù)量與拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)均符合昆蟲嗅覺受體的典型特征，這種結(jié)構(gòu)與昆蟲的傳統(tǒng)氣味受體可能具有4～8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域相一致［7，23］。多序列比對結(jié)果顯示，相對于易變異的N端，C端比較保守，據(jù)此推測同源性較低的N端可能是不同昆蟲ORX識別不同氣味物質(zhì)的緣由。梨小食心蟲GmolOR10與

卷蛾科的蘋果蠹蛾CpomOR18和葡萄花翅小卷蛾LbotOR18的序列一致性較高，可能是直系同源基因。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示GmolOR10與卷蛾科的一些昆蟲的典型氣味受體聚集為一個(gè)小的分支，說明GmolOR10是典型氣味受體，且與卷蛾科昆蟲的親緣關(guān)系較近，進(jìn)一步證實(shí)昆蟲的嗅覺受體雖然經(jīng)歷了長達(dá)幾億年漫長的進(jìn)化，但同科昆蟲的ORX聚在了一個(gè)分支，此結(jié)果與分類的結(jié)果一致。

在鱗翅目昆蟲中，不同的OR基因在表達(dá)模式上存在差異，表達(dá)模式與其功能緊密相關(guān)［2425］。如家蠶Bombyx?mori?BmorOR19與甜菜夜蛾Spodoptera?exigua?SexiOR18主要在雌雄蟲觸角中表達(dá)，在雌蟲觸角中的表達(dá)量顯著高于雄蟲，在其他組織中表達(dá)量低或不表達(dá)，推測其主要參與了雌蟲尋找產(chǎn)卵場所的特異性行為［2627］。小菜蛾P(guān)lutella?xylostella?PxylOR16、PxylOR17、PxylOR18和斜紋夜蛾Spodoptera?litura?SlituOR12均在雌雄蟲觸角中大量表達(dá)，但差異不顯著，在其他組織如頭、腹部也有一定的表達(dá)，推測其可能參與了雌雄蟲的共同生命活動過程如定位寄主植物和取食等［2829］。除此以外，棉鈴蟲H.armigera?HarmOR3、HarmOR13與煙青蟲Helicoverpa?assulta?HassOR11在雄蟲觸角中大量表達(dá)，其表達(dá)量顯著高于在雌蟲觸角中的表達(dá)量，推測其可能涉及雄蟲尋偶行為［30］。本研究獲得的GmolOR10在雌雄成蟲觸角中表達(dá)量較高，在雄蟲觸角的表達(dá)量顯著高于雌蟲。此外，在雌雄蟲頭部也有一定的表達(dá)，推測其可能參與了雌、雄蟲尋找和定位寄主植物的過程。

GmolOR10在雌雄成蟲期的表達(dá)量均呈現(xiàn)出隨日齡增加先增加后減少的趨勢，相同日齡下在雄蟲中的表達(dá)量均高于雌蟲。在3日齡雌雄成蟲的中的表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后呈現(xiàn)逐漸降低趨勢。說明成蟲在羽化3?d后GmolOR10的表達(dá)量逐漸降低，此結(jié)果與中紅側(cè)溝繭蜂Microplitis?mediator?MmedOR2在雌、雄蜂羽化第3天表達(dá)量達(dá)到峰值隨后降低，梨小食心蟲G.molesta?GmolOR20在3日齡成蟲的表達(dá)量最高等結(jié)果［3132］相似。據(jù)報(bào)道梨小食心蟲在羽化后3?d，其交配與產(chǎn)卵行為最為活躍［33］，說明3日齡是梨小食心蟲成蟲定位寄主植物、覓食、釋放性信息素、尋偶、交配繁殖最為活躍的階段，需要非常精確地辨析周圍復(fù)雜環(huán)境中各種氣味物質(zhì)，而此時(shí)GmolOR10在雌雄蟲中的表達(dá)量也達(dá)到峰值，意味著GmolOR10可能涉及雄蟲感受性信息素、及雌雄蟲覓食行為。

昆蟲典型氣味受體只在嗅覺神經(jīng)元中有選擇地表達(dá)［34］，表達(dá)豐度分析表明，大部分昆蟲的ORX基因在各發(fā)育階段中的每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片（fragments?per?kilobase?million，F(xiàn)PKM）值都較低［35］，屬于低表達(dá)基因。近年來對昆蟲相關(guān)基因嗅覺的研究表明，氣味受體亦在卵或者蛹中有較多的表達(dá)。溝眶象Eucryptorrhynchus?scrobiculatus?EscrOR50、臭椿溝眶象E.brandti?EbraOR47和舞毒蛾Lymantria?dispar?LdisOR2在蛹期的表達(dá)量都較高，EbraOR46和LdisOR2在卵期擁有最高表達(dá)量［3536］，推測這些ORs可能在發(fā)育的早期階段就已發(fā)揮功能。本研究中GmolOR10除在成蟲期高表達(dá)外，在卵和蛹期也有表達(dá)。說明GmolOR10除了參與尋偶行為外，還可能參與成蟲尋覓寄主植物和幼蟲取食行為等相關(guān)生命活動過程。

本研究用常規(guī)克隆方法，獲得GmolOR10完整的編碼區(qū)，通過生物信息分析軟件對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，并利用定量的方法初步明確了此基因在梨小食心蟲不同組織與不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，推測其可能參與了性信息素和寄主揮發(fā)物的識別過程。GmolOR10在梨小食心蟲感受外界環(huán)境過程中識別何種氣味物質(zhì)，后期將通過RNA干擾、真核表達(dá)該基因后利用雙電極電壓鉗試驗(yàn)等對其具體功能進(jìn)行驗(yàn)證。本研究為將來研究梨小食心蟲其他氣味受體和進(jìn)一步研究其蛋白嗅覺識別機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為今后利用嗅覺受體作為分子靶標(biāo)來干擾昆蟲識別外界環(huán)境氣味物質(zhì)提供參考，以期達(dá)到無公害防治該蟲的目的。

參考文獻(xiàn)

［1］?鄭燕，?徐德坤，?胡海燕，?等.?不同果園梨小食心蟲性信息素微膠囊迷向效果初探［J］.?中國植保導(dǎo)刊，?2020，?40（6）：?6264.

［2］?ROTHSCHILD?G?H?L，?VICKERS?R?A.?Biology，?ecology?and?control?of?the?oriental?fruit?moth?［M］∥VAN?DER?GEEST?L?P?S，?EVENHUIS?H?H.?Tortricid?pests：?Their?biology，?natural?enemies，?and?control.?Amsterdam：?Elsevier?Science?Publishers，?1991：?389412.

［3］?NAJARRODRIGUEZ?A，?BELLUTTI?N，?DORN?S.?Larval?performance?of?the?oriental?fruit?moth?across?fruits?from?primary?and?secondary?hosts?［J］.?Physiological?Entomology，?2013，?38：?6370.

［4］?PIERO?J，?DORN?S.?Synergism?between?aromatic?compounds?and?green?leaf?volatiles?derived?from?the?host?plant?underlies?female?attraction?in?the?oriental?fruit?moth?［J］.?Entomologia?Experimentalis?et?Applicata，?2007，?125（2）：?185194.

［5］?杜立嘯，?劉楊，?王桂榮.?昆蟲外周嗅覺系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究進(jìn)展［J］.?中國科學(xué)：?生命科學(xué)，?2016，?46（5）：?573583.

［6］?ZHENG?Yao，?WANG?Shanning，?PENG?Yong，?et?al.?Functional?characterization?of?a?NiemannPick?type?C2?protein?in?the?parasitoid?wasp?Microplitis?mediator?［J］.?Insect?Science，?2018，?25（5）：?765777.

［7］?莫建初，?王成盼，?尉吉乾.?昆蟲外周嗅覺系統(tǒng)研究進(jìn)展［J］.?江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，?2019，?41（1）：?5057.

［8］?LEAL?W?S，?CHEN?A?M，?ISHIDA?Y.?Kinetics?and?molecular?properties?of?pheromone?binding?and?release?［J］.?Proceeding?of?the?National?Academy?of?Sciences?of?the?United?States?of?America，?2005，?102（15）：?53865391.

［9］?WICHER?D.?Tuning?insect?odorant?receptors?［J/OL］.?Frontiers?in?Cellular?Neuroscience，?2018，?12：?94.?DOI：?10.3389/fncel.2018.00094.

［10］WANNER?K?W，?NICHOLS?A?S，?WALDEN?K?K，?et?al.?A?honey?bee?odorant?receptor?for?the?queen?substance?9oxo2decenoic?acid?［J］.?Proceeding?of?the?National?Academy?of?Sciences?of?the?United?States?of?America，?2007，?104（36）：?1438314388.

［11］JORDAN?M?D，?ANDERSON?A，?BEGUM?D，?et?al.?Odorant?receptors?from?the?light?brown?apple?moth?（Epiphyas?postvittana）?recognize?important?volatile?compounds?produced?by?plants?［J］.?Chemical?Senses，?2019，?34（5）：?383394.

［12］LIU?Yang，?GU?Shaohua，?ZHANG?Yongjun，?et?al.?Candidate?olfaction?genes?identified?within?the?Helicoverpa?armigera?antennal?transcriptome?［J/OL］.?PLoS?ONE，?2012，?7（10）：?e48260.?DOI：?10.1371/journal.pone.0048260.

［13］WANG?Jingzhen，?HU?Ping，?GAO?Peng，?et?al.?Antennal?transcriptome?analysis?and?expression?profiles?of?olfactory?genes?in?Anoplophora?chinensis?［J/OL］.?Scientific?Reports，?2017，?7（1）：?15470.?DOI：?10.1038/S41598017154252.

［14］TIAN?Zhiqiang，?SUN?Lina，?LI?Yanyan，?et?al.?Antennal?transcriptome?analysis?of?the?chemosensory?gene?families?in?Carposina?sasakii?（Lepidoptera：?Carposinidae）?［J/OL］.?BMC?Genomics，?2018，?19（1）：?544.?DOI：?10.1186/S128640184900X.

［15］ROJAS?V，?JIMNEZ?H，?PALMA?M?R，?et?al.?Analysis?of?the?grapevine?moth?Lobesia?botrana?antennal?transcriptome?and?expression?of?odorantbinding?and?chemosensory?proteins?［J］.?Comparative?Biochemistry?and?Physiology?Part?D：?Genomics?and?Proteomics，?2018，?27：?112.

［16］CUI?Xiaoning，?LIU?Deguang，?SUN?Keke，?et?al.?Expression?profiles?and?functional?characterization?of?two?odorantbinding?proteins?from?the?apple?buprestid?beetle?Agrilus?mali?（Coleoptera：?Buprestidae）?［J］.?Journal?of?Economic?Entomology，?2018，?111（3）：?14201432.

［17］LI?Guangwei，?DU?Juan，?LI?Yiping，?et?al.?Identification?of?putative?olfactory?genes?from?the?oriental?fruit?moth?Grapholita?molesta?via?an?antennal?transcriptome?analysis?［J/OL］.?PLoS?ONE，?2015，?10（11）：?e0142193.?DOI：?10.1371/journal.pone.0142193.

［18］李帥，?蘇麗，?李伯遼，?等.?梨小食心蟲谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶GmolGST6?的基因克隆、原核表達(dá)和酶學(xué)特征［J］.?昆蟲學(xué)報(bào)，?2018，?61（4）：?398409.

［19］CHEN?Xiulin，?SU?Li，?LI?Boliao，?et?al.?Molecular?and?functional?characterization?of?three?odorant?binding?proteins?from?the?oriental?fruit?moth?Grapholita?molesta?Busck?（Lepidoptera：?Tortricide）?［J/OL］.?Archives?of?Insect?Biochemistry?and?Physiology，?2018，?98（2）：?e21456.?DOI：?10.1002/arch.21456.

［20］杜娟，?王艷蓉，?仵均祥.?不同飼料配方對梨小食心蟲生長發(fā)育及繁殖的影響［J］.?山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，?2010，?30（3）：?228231.

［21］CAO?Jinjun，?LIU?Yichen，?YANG?Yuhui，?et?al.?Molecular?characterization?and?functional?analysis?of?the?ultraspiracle?（USP）?in?the?oriental?fruit?moth?Grapholita?molesta?（Lepidoptera：?Olethreutidae）?［J］.?Comparative?Biochemistry?and?Physiology?Part?B：?Biochemistry?and?Molecular?Biology，?2015，?190：?5462.

［22］LIVAK?K?J，?SCHMITTGEN?T?D.?Analysis?of?relative?gene?expression?data?using?realtime?quantitative?PCR?and?the?2-△△CT?methods?［J］.?Methods，?2001，?25（4）：?402408.

［23］CHEN?Xiulin，?LI?Boliao，?CHEN?Yuxin，?et?al.?Functional?analysis?of?the?odorant?receptor?coreceptor?in?odor?detection?in?Grapholita?molesta?（Lepidoptera：?Tortricidae）?［J/OL］.?Archives?of?Insect?Biochemistry?and?Physiology，?2021，?108（2）：?e21837.?DOI：?10.1002/arch.21837.

［24］LEAL?W?S.?Odorant?reception?in?insects：?roles?of?receptors，?binding?proteins，?and?degrading?enzymes?［J］.?Annual?Review?of?Entomology，?2013，?58：?373391.

［25］LEGEAI?F，?MALPEL?S，?MONTAGN?N，?et?al.?An?expressed?sequence?tag?collection?from?the?male?antennae?of?the?Noctuid?moth?Spodoptera?littoralis：?a?resource?for?olfactory?and?pheromone?detection?research?［J/OL］.?BMC?Genomics，?2011，?12（1）：?86.?DOI：?10.1186/147121641286.

［26］ANDERSON?A?R，?WANNER?K?W，?TROWELL?S?C，?et?al.?Molecular?basis?of?femalespecific?odorant?responses?in?Bombyx?mori?［J］.?Insect?Biochemistry?and?Molecular?Biology，?2009，?39（3）：?189197.

［27］劉程程，?劉楊，?張進(jìn)，?等.?甜菜夜蛾觸角氣味受體基因OR18?的克隆和表達(dá)定位［J］.?中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，?2013，?46（20）：?42634271.

［28］ZHANG?Jin，?LIU?Chengcheng，?YAN?Shuwen，?et?al.?An?odorant?receptor?from?the?common?cutworm?（Spodoptera?litura）?exclusively?tuned?to?the?important?plant?volatile?cis3hexenyl?acetate?［J］.?Insect?Molecular?Biology，?2013，?22（4）：?424432.

［29］孔暢儀，?王桂榮，?劉楊，?等.?小菜蛾三個(gè)普通氣味受體基因的克隆及表達(dá)譜［J］.?中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，?2014，?47（9）：?17351742.

［30］張帥，?張永軍，?蘇宏華，?等.?棉鈴蟲氣味受體的克隆與組織特異性表達(dá)［J］.?昆蟲學(xué)報(bào)，?2009，?52（7）：?728735.

［31］馬龍，?王山寧，?路子云，?等.?中紅側(cè)溝繭蜂嗅覺受體MmedOr2基因的克隆及組織表達(dá)譜［J］.?中國生物防治學(xué)報(bào)，?2014，?30（1）：?1319.

［32］陳麗慧，?李梅梅，?陳秀琳，?等.?梨小食心蟲普通氣味受體基因GmolOR20的克隆及表達(dá)分析［J］.?昆蟲學(xué)報(bào)，?2019，?62（4）：?418427.

［33］張國輝，?仵均祥.?梨小食心蟲成蟲行為節(jié)律研究［J］.?西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），?2012，?40（12）：?131135.

［34］白鵬華，?王冰，?張仙紅，?等.?昆蟲氣味受體的研究方法與進(jìn)展［J］.?昆蟲學(xué)報(bào)，?2022，?65（3）：?364385.

［35］路藝，?王倩，?溫俊寶.?基于溝眶象屬兩近緣種不同蟲態(tài)轉(zhuǎn)錄組的氣味受體基因鑒定及表達(dá)分析［J］.?昆蟲學(xué)報(bào)，?2021，?64（6）：?655665.

［36］王建國，?王建軍，?曹傳旺，?等.?舞毒蛾LdOR2基因克隆及對CO2?脅迫下的行為反應(yīng)［J］.?北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).?2021，?43（9）：?101110.

（責(zé)任編輯：楊明麗）