劉紅艷 楊 拓 王 壹 孫 軒 王 賢 劉振林張國(guó)君 衛(wèi)尊征，

（1河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院/河北省特色園藝種質(zhì)挖掘與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省高校特色園藝植物生物育種應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 秦皇島 066000；2北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所，北京 100097； 3中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京 100193）

馬蹄蓮（Calla lily）是天南星科馬蹄蓮屬（Zantedeschia）的球根花卉，作為主要觀賞部位的佛焰苞形似燃燒的佛焰、狀似彎曲的馬蹄，具有極高的觀賞價(jià)值［1］。然而，馬蹄蓮盛花期后，佛焰花的基部逐漸出現(xiàn)綠色并向上蔓延，在果實(shí)成熟后完全返青［2］，這種現(xiàn)象導(dǎo)致其采后觀賞品質(zhì)下降，經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低。因此，有效解決返青問(wèn)題，有助于維持馬蹄蓮在運(yùn)輸及銷(xiāo)售過(guò)程中的觀賞價(jià)值。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)佛焰苞返青現(xiàn)象的研究，主要集中在生理層面，包括色素含量變化、質(zhì)體發(fā)育以及激素調(diào)控等方面。前人研究表明，馬蹄蓮返青過(guò)程中，組織內(nèi)葉綠素含量隨著佛焰苞外表皮綠色程度的加深而逐步增多［3］，且葉綠體作為積累葉綠素的主要場(chǎng)所，在返青過(guò)程中再次形成［2］。植物生長(zhǎng)發(fā)育受多種激素調(diào)控［4］，乙烯作用于生長(zhǎng)發(fā)育后期主要調(diào)控衰老，然而研究表明佛焰苞返青的過(guò)程不受乙烯調(diào)控［5］；細(xì)胞分裂素和赤霉素主要作用于生長(zhǎng)發(fā)育前期調(diào)控生長(zhǎng)，研究表明外源施用赤霉素能有效延緩返青［6］，與細(xì)胞分裂素有協(xié)同作用［7-8］。綜上可知，目前有關(guān)佛焰苞返青的調(diào)控機(jī)制尚不明晰，有待進(jìn)一步探索。

深入探究佛焰苞返青，需要借助分子手段鑒定相關(guān)的基因功能，從而為后續(xù)基因編輯育種奠定理論基礎(chǔ)。但馬蹄蓮的再生和遺傳轉(zhuǎn)化極其困難［9］，從實(shí)生苗到開(kāi)花需要3～4 年的時(shí)間，對(duì)佛焰苞進(jìn)行相關(guān)的表型鑒定比較困難。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗(yàn)證馬蹄蓮基因功能的方法仍存在瓶頸。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，可引起內(nèi)源mRNA 序列特異性降解［10］。目前VIGS 已成功應(yīng)用在眾多觀賞花卉的相關(guān)研究中，如蝴蝶蘭［11］、長(zhǎng)春花［12］、矮牽牛［13］等。從技術(shù)、材料等方面考慮，利用VIGS 技術(shù)建立馬蹄蓮屬植物基因功能研究的技術(shù)體系，可能是克服馬蹄蓮遺傳轉(zhuǎn)化困難的重要手段。且鑒定葉綠素合成的關(guān)鍵基因，將有助于更好地認(rèn)識(shí)馬蹄蓮佛焰苞的返青過(guò)程，為延長(zhǎng)觀賞期提供有力的科學(xué)依據(jù)。

因此，本研究以彩色馬蹄蓮黃色品種Florex Gold為對(duì)象，依據(jù)北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所馬蹄蓮課題組（本課題組）前期所構(gòu)建的佛焰苞返青轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定與葉綠素合成途徑的兩個(gè)關(guān)鍵基因ZhGluTR和ZhChlH轉(zhuǎn)錄本序列，之后進(jìn)一步利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增非結(jié)構(gòu)域的部分編碼區(qū)并基于同源重組法構(gòu)建VIGS瞬時(shí)沉默載體，以期為解析馬蹄蓮佛焰苞返青現(xiàn)象的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為彩色馬蹄蓮黃色栽培品種Florex Gold，栽植于北京市農(nóng)林科學(xué)院延慶農(nóng)場(chǎng)［14］，試驗(yàn)于2022 年3—5 月進(jìn)行。依據(jù)返青過(guò)程中外表皮顏色的差異，選擇外表皮呈黃色的盛花期（S1）、外表皮呈淺綠色的返青初期（S2），以及外表皮呈深綠色的返青后期（S3）分別取樣作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 彩色馬蹄蓮返青典型時(shí)期的植物學(xué)性狀觀察 取佛焰苞S1、S2和S3期的新鮮樣本。利用透明膠帶將兩片重疊且濕潤(rùn)的雙面刀片中部粘合，沿佛焰苞中部著色均勻部位的脈絡(luò)垂直方向快速切下，毛筆蘸取置于滴有清水的載玻片上，蓋上蓋玻片完成徒手切片制作，在顯微鏡下觀察比較呈色細(xì)胞的分布［15］。

1.2.2 色素含量測(cè)定 以S1、S2 和S3 期佛焰苞為材料，每個(gè)時(shí)期選取15朵花作為重復(fù)，取樣中部著色均勻部位液氮研磨至粉末狀。稱取0.1 g迅速轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，加入10 mL 提取液，提取液為80%丙酮與95%乙醇的等比混合液。反復(fù)顛倒離心管3～5次，4 ℃避光提取10 min，隨后用MG-1650 臺(tái)式高速離心機(jī)（美瑞克，深圳）7 340 r·min-1離心15 min 后取上清，用UV2500 紫外分光光度計(jì)（天美，上海）測(cè)定663、645 和440 nm 波長(zhǎng)處的吸光值［16］。計(jì)算相應(yīng)的葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量［17］。VIGS侵染后的孔片每個(gè)試驗(yàn)組分別選取30片，重復(fù)上述操作。

1.2.3 色差值測(cè)定 以S1、S2和S3期佛焰苞為材料，使用NR60CP 手提式多功能色差儀（三恩馳，深圳）進(jìn)行色差參數(shù)測(cè)定。每個(gè)時(shí)期分別選取15 朵花作為重復(fù)，避開(kāi)主脈，對(duì)每朵花測(cè)定中部對(duì)稱的2個(gè)位置。將獲取的平均值作為該時(shí)期的花色參數(shù)L*、C和h值（L*值表示亮度，C值表示色飽和度，h值表示色調(diào)角）。VIGS 侵染后的孔片每個(gè)試驗(yàn)組分別選取30 片，重復(fù)上述操作。

1.2.4 基因靶片段克隆與載體構(gòu)建 利用EASY spin Plus 多糖多酚/復(fù)雜植物RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取返青初期佛焰苞總RNA。使用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）反轉(zhuǎn)RNA 為cDNA作為PCR模板。

本課題組在前期研究中，利用Hiseq2500 平臺(tái)針對(duì)黃色品種Florex Gold 的上述三個(gè)典型時(shí)期的佛焰苞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，原始數(shù)據(jù)登錄在中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所（國(guó)家生物信息中心）的組學(xué)原始數(shù)據(jù)歸檔庫(kù)（Genome Sequence Archive），登錄號(hào)為CRA000209。本研究利用上述數(shù)據(jù)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)，并從中查找在佛焰苞返青過(guò)程中表達(dá)量不斷增加的兩個(gè)葉綠素合成途徑關(guān)鍵基因ZhGluTR（OP076741）和ZhChlH（OP076742）的轉(zhuǎn)錄本序列。通過(guò)ORFfinder網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析轉(zhuǎn)錄本的開(kāi)放閱讀框，將完整的編碼區(qū)輸入CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域，利用Primer 5.0 軟件在非保守結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)設(shè)計(jì)靶片段的上、下游引物擴(kuò)增片段，利用限制性內(nèi)切酶EcoRI 和XhoI 得到煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV2）的線性載體，通過(guò)同源重組試劑盒ClonExpress II One Step Cloning Kit（南京諾唯贊生物科技有限公司）將片段分別與線性TRV2 連接，完成VIGS瞬時(shí)沉默載體構(gòu)建。擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。

表1 本研究所用引物序列相關(guān)信息Table 1 Primer lists and related information used in this study

1.2.5 佛焰苞離體VIGS體系建立 設(shè)計(jì)完全隨機(jī)試驗(yàn)，以佛焰苞中脈為軸，用14 mm打孔器取樣中部及上部孔片作為侵染材料（圖1），分別以3 和5 min 作為真空抽吸時(shí)間，共設(shè)4個(gè)試驗(yàn)組（5上、5中、3上、3中）進(jìn)行。將病毒載體以及VIGS 瞬時(shí)沉默載體轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，放置28 ℃搖床，加入終濃度50 mg·L-1卡那霉素與25 mg·L-1利福平的液體LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基，200 r·min-1中過(guò)夜震蕩培養(yǎng)，6 000 r·min-1離心菌液6 min 后棄上清，加入終濃度10 mmol·L-1氯化鎂（MgCl2）、10 mmol·L-12-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）與200 μmol·L-1乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）的侵染緩沖液重懸菌體［18］。調(diào)整菌液在600 nm 波長(zhǎng)處的光密度（optical density，OD）濃度為0.8［19］。將TRV1 菌液分別與TRV2、TRV2-ZhGluTR和TRV2-ZhChlH菌液等比混合后暗靜置3～4 h［20］。將中部與上部組織分別浸沒(méi)在混合菌液中，抽真空至0.08 MPa［21］，負(fù)壓分別處理3 和5 min 后緩慢放氣，重復(fù)3 次。隨后用蒸餾水反復(fù)沖洗孔片，無(wú)菌濾紙吸干水分，將孔片背面向上置于0.4%瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)保持濕潤(rùn)［22］，4 ℃暗置共培養(yǎng)3 d 后轉(zhuǎn)移至21 ℃正常光照下培養(yǎng)。每個(gè)試驗(yàn)組放置30個(gè)孔片，重復(fù)3次。共培養(yǎng)結(jié)束后記為0 dpi，對(duì)上述4個(gè)試驗(yàn)組在0、3、6、9 dpi 分別取樣品放置于液氮中速凍，存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 彩色馬蹄蓮佛焰苞取樣位置示意圖Fig.1 Sampling position diagram on sapthe of Zantedeschia hybrida Florex Gold

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證 完全隨機(jī)試驗(yàn)中選取效果最好的試驗(yàn)組進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）驗(yàn)證。上述3 種菌液侵染后的孔片各選10 片，利用EASY spin Plus 多糖多酚/復(fù)雜植物RNA 快速提取試劑盒提取該組樣品總RNA，利用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)為RNA 為cDNA 作為qRT-PCR 的模板。以ZhActin作為內(nèi)參基因［23］，ZhGluTR和ZhChlH作為目的基因，通過(guò)Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1），使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。將得到的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法計(jì)算［24］。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 色差值、色素值以及qRT-PCR 測(cè)定數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行圖片制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 彩色馬蹄蓮返青過(guò)程中的表型、色差以及相應(yīng)的色素含量及分布情況

通過(guò)徒手切片觀察佛焰苞S1、S2和S3時(shí)期的色素分布，并測(cè)定相應(yīng)時(shí)期的色差值和色素含量。

結(jié)果表明，盛花期時(shí)表型為黃色，切片觀察組織背面含有黃色的類(lèi)胡蘿卜素；返青初期時(shí)表型為淺綠色，切片觀察組織背面開(kāi)始出現(xiàn)葉綠素積累；返青后期時(shí)表型為綠色，切片觀察組織背面葉綠素積累增多（圖2）。

圖2 彩色馬蹄蓮Florex Gold返青過(guò)程中的表型與相應(yīng)色素分布Fig.2 Changes of spathe phenotype and corresponding pigment distribution of Zantedeschia hybrida Florex Gold

在佛焰苞發(fā)育過(guò)程中，h值與總?cè)~綠素含量持續(xù)上升，L*值與C 值持續(xù)下降，且各階段之間差異顯著（P＜0.05）；總類(lèi)胡蘿卜素含量在S1 至S2 時(shí)顯著下降（P＜0.05），S2至S3時(shí)有所下降，但差異不顯著（圖3）。

圖3 彩色馬蹄蓮Florex Gold返青過(guò)程中的花色參數(shù)（A）以及色素含量（B）變化Fig.3 Changes of spathe flower color parameter（A），and pigment content（B）in Zantedeschia hybrida Florex Gold during regreening

2.2 ZhGluTR 和ZhChlH 的結(jié)構(gòu)域分析以及沉默片段的克隆和VIGS瞬時(shí)沉默載體構(gòu)建

由圖4 可知，ZhGluTR 和ZhChlH 的編碼區(qū)都具有較長(zhǎng)的保守結(jié)構(gòu)域，位于編碼區(qū)非結(jié)構(gòu)域部分的片段被成功克隆，長(zhǎng)度分別為412 和400 bp。通過(guò)凝膠電泳確定沉默片段大小，并利用Sanger 測(cè)序確定序列的準(zhǔn)確性。通過(guò)同源重組法將TRV2 載體與沉默片段分別相連，通過(guò)凝膠電泳確定重組片段大小，并利用Sanger 測(cè)序確定序列的準(zhǔn)確性，成功構(gòu)建了VIGS 瞬時(shí)沉默載體TRV2-ZhGluTR和TRV2-ZhChlH。

圖4 ZhGluTR和ZhChlH結(jié)構(gòu)域分析（A）、沉默片段克?。˙）和VIGS瞬時(shí)沉默載體構(gòu)建（C）Fig.4 Domain analysis of ZhGluTR and ZhChlH （A），silent fragment clones（B）and VIGS transient silencing vector construction（C）

2.3 ZhGluTR 和ZhChlH 基因沉默對(duì)彩色馬蹄蓮佛焰苞的影響

在0、3、6 和9 dpi分別取經(jīng)上述3 種菌液浸染后的孔片，進(jìn)行表型、色差值和色素含量測(cè)定，結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照侵染的佛焰苞孔片相比，TRV2-ZhGluTR和TRV2-ZhChlH侵染的佛焰苞孔片返青現(xiàn)象出現(xiàn)得較晚。TRV 侵染的佛焰苞孔片在3 dpi 時(shí)由黃逐漸變綠，出現(xiàn)返青現(xiàn)象，隨后在9 dpi 完全返青。TRV2-ZhChlH侵染的佛焰苞孔片在6 dpi 后出現(xiàn)輕微返青，此時(shí)4種處理方法的色調(diào)角h值與對(duì)照相比均顯著降低（P＜0.05）；TRV2-ZhGluTR侵染的佛焰苞孔片在9 dpi后出現(xiàn)輕微返青，此時(shí)4種處理方法的h值與對(duì)照相比均顯著降低（P＜0.05）。并且h值的變化趨勢(shì)與侵染后孔片的顏色變化相符，即孔片表現(xiàn)綠色程度越深，相應(yīng)的h值越大。

圖5 VIGS侵染后各處理組的表型（A）和色調(diào)角（B）變化Fig.5 Phenotype（A），hue angle（B）of each treatment group after VIGS infection

本試驗(yàn)中被浸染的所有孔片隨時(shí)間增長(zhǎng)而發(fā)生的共同變化為葉綠素含量增多，類(lèi)胡蘿卜素含量降低。相較而言，兩個(gè)沉默組中葉綠素含量顯著增多的時(shí)間節(jié)點(diǎn)位于對(duì)照之后，類(lèi)胡蘿卜素含量顯著減少的時(shí)間節(jié)點(diǎn)位于對(duì)照之前。除此以外，4 個(gè)處理組中，對(duì)中部孔片真空侵染5 min 的處理方法使得返青現(xiàn)象出現(xiàn)得最遲，葉綠素含量積累以及類(lèi)胡蘿卜素減少相對(duì)緩慢（圖6）。

圖6 VIGS侵染后各處理組的色素含量變化Fig.6 Pigment content of each treatment group after VIGS infection

綜上所述，沉默ZhGluTR和ZhChlH會(huì)延遲返青現(xiàn)象，對(duì)中部孔片真空侵染5 min的處理方式延遲返青效果最好，推測(cè)ZhGluTR和ZhChlH可能正向調(diào)控馬蹄蓮中葉綠素的合成。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

選取VIGS 體系中延緩返青效果最好的處理組（5中）進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證，結(jié)果如圖7 所示。與對(duì)照相比，TRV2-ZhGluTR和TRV2-ZhChlH侵染的佛焰苞孔片中，ZhGluTR和ZhChlH基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05）。表明佛焰苞離體VIGS體系構(gòu)建成功。

圖7 VIGS侵染后ZhGluTR（A）和ZhChlH（B）的相對(duì)表達(dá)量變化Fig.7 Changes of relative expression levels of ZhGluTR（A）and ZhChlHB（B）after VIGS infection

3 討論

在自然界中，植物返青現(xiàn)象并不罕見(jiàn)。除馬蹄蓮?fù)?，還出現(xiàn)于夏橙［25］、蝴蝶蘭［26］、白掌［27］等植物中。前人研究表明，彩色馬蹄蓮黃色品種Best Gold 返青過(guò)程中，佛焰苞內(nèi)的質(zhì)體形態(tài)逐步發(fā)生變化，即有色體逐步轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苋~綠體［6］；與此同時(shí)，佛焰苞外緣綠色程度加深、葉綠素含量增多以及類(lèi)胡蘿卜素含量降低［3］。這與本研究黃色品種Florex Gold 返青過(guò)程中的生理變化一致。究其原因，可能是由于黃色品種Florex Gold在盛花期（S1）時(shí)，佛焰苞內(nèi)的質(zhì)體以有色體為主，有色體內(nèi)含有大量類(lèi)胡蘿卜素，使佛焰苞呈現(xiàn)黃色表型；返青初期（S2）時(shí)，佛焰苞內(nèi)的有色體開(kāi)始向葉綠體轉(zhuǎn)變，此時(shí)有色體減少，類(lèi)胡蘿卜素含量降低，葉綠體增加，葉綠素含量升高，使佛焰苞由黃色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色；返青后期（S3）時(shí)，佛焰苞內(nèi)的質(zhì)體以葉綠體為主，葉綠體內(nèi)含有大量葉綠素，使佛焰苞呈現(xiàn)綠色表型。綜上，本研究結(jié)果從表型方面闡述了佛焰苞返青現(xiàn)象產(chǎn)生的原因。

前人研究表明，彩色馬蹄蓮黃色品種Best Gold 佛焰苞的返青現(xiàn)象開(kāi)始于S1 期后的2～3 d［3］，這與本研究中黃色品種Florex Gold 佛焰苞離體孔片的返青過(guò)程一致。處于S1 期的馬蹄蓮佛焰苞外表皮著色均勻，尚未出現(xiàn)綠色，與S2、S3期相比，葉綠素含量最少。由S1向S2轉(zhuǎn)變的時(shí)期是葉綠素生物合成的關(guān)鍵時(shí)期，以S1期的佛焰苞作為侵染材料，選用葉綠素合成關(guān)鍵基因作為構(gòu)建馬蹄蓮佛焰苞VIGS體系的指示基因，最容易觀測(cè)到沉默后表型顏色的變化情況。理論上沉默后可以暫時(shí)抑制葉綠素的合成與積累，達(dá)到延緩綠色表型出現(xiàn)的效果［28］，本研究所得結(jié)果與理論一致。

VIGS 在園藝植物中被廣泛應(yīng)用，侵染材料常選擇種球和幼苗等植物組織。例如，利用種球作為侵染材料的唐菖蒲（Gladiolus hybridus）［29］，以及利用7 周齡幼苗作為侵染材料的罌粟（California poppy）［30］。除上述植物組織外，還可以采用切花甚至瓣片等離體植物組織作為侵染材料。例如，瓜葉菊（Senecio cruentus）采用切花作為浸染材料，通過(guò)花葶注射和真空浸潤(rùn)頭狀花序成功沉默花青素途徑基因ScANS使花色改變［28］；玫瑰（Rosa hybrida）采用切花和瓣片作為浸染材料，通過(guò)真空法成功沉默與花衰老有關(guān)的基因RhWRKY33，使植株延緩衰老［31］。

采用切花或瓣片進(jìn)行VIGS體系構(gòu)建，相較于種球或幼苗而言，材料更易獲取，并且見(jiàn)效更快，能夠有效避免侵染種球或幼苗后成花過(guò)程太久導(dǎo)致的病毒失效問(wèn)題，同時(shí)便于發(fā)現(xiàn)問(wèn)題并及時(shí)優(yōu)化體系。前人研究發(fā)現(xiàn)，佛焰苞的切花與瓣片在返青過(guò)程中外表皮均由黃轉(zhuǎn)綠，變化趨勢(shì)一致［7］，因此本研究選取了體積更小更易操作的佛焰苞瓣片為試驗(yàn)材料，利用14 mm 打孔器保證取材的均一以及規(guī)整。在同一時(shí)空內(nèi)，植物葉片尖端的衰老先于基部［32］，衰老部位的細(xì)胞分裂和代謝能力較差。彩色馬蹄蓮的佛焰苞本質(zhì)是變態(tài)葉，本研究中對(duì)佛焰苞中部孔片的延緩返青效果高于上部孔片，推測(cè)可能是由于較上部而言，中部組織更幼嫩，細(xì)胞活力更強(qiáng)。在特定范圍內(nèi)，真空條件下侵染植物組織時(shí)間越長(zhǎng)，沉默效果越好。例如，小麥幼苗和玉米幼苗在無(wú)真空條件下侵染的沉默效率低于真空條件下侵染的沉默效率［33］。本研究中佛焰苞孔片在真空5 min條件下的侵染效率高于3 min，與上述結(jié)論相符。

本研究驗(yàn)證了彩色馬蹄蓮葉綠素合成關(guān)鍵基因的功能，成功構(gòu)建了馬蹄蓮的離體VIGS 體系，為進(jìn)一步探索彩色馬蹄蓮佛焰苞返青基因的功能提供了技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)彩色馬蹄蓮現(xiàn)有穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系不成熟，無(wú)法驗(yàn)證基因功能等問(wèn)題，采用優(yōu)化的試驗(yàn)體系對(duì)葉綠素合成關(guān)鍵基因ZhGluTR和ZhChlH進(jìn)行沉默，構(gòu)建彩色馬蹄蓮佛焰苞離體VIGS 技術(shù)體系；測(cè)定3 種菌液侵染后各個(gè)試驗(yàn)組中孔片的表型、色差值以及色素含量。綜合得出最佳處理方式為對(duì)佛焰苞中部真空處理5 min，即該方式延遲返青的效果最好。