姚一凡 張伊陽 董仕慧 李 睿 張 蘭 周熳琳喬自林 楊 琨 ，

（1西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

氧氣是動(dòng)物生長發(fā)育必需的條件之一，而低氧是高原動(dòng)物生存所面臨的最大挑戰(zhàn)之一［1］。前人研究發(fā)現(xiàn)，低氧分壓會(huì)導(dǎo)致機(jī)體組織中的氧氣供應(yīng)不足，從而影響動(dòng)物正常的生理功能［2］。與平原地區(qū)動(dòng)物相比，生活在高原極端環(huán)境下的動(dòng)物對(duì)低氧環(huán)境具有獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制［1］。牦牛作為青藏高原上的特有物種，是研究低氧環(huán)境適應(yīng)良好的模式動(dòng)物，具有重要的研究價(jià)值［3］。黑白花牛是中國黃牛和荷蘭荷斯坦牛的雜交品種，長期生活在平原地區(qū)，與牦牛的生活環(huán)境有較大的海拔差異，因此可作為牦牛的對(duì)照模型加以研究。

低氧條件下，動(dòng)物機(jī)體可以通過改變體內(nèi)某些物質(zhì)代謝活性，增強(qiáng)氧氣攝入和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，維持組織間氧氣水平，促進(jìn)其生長、發(fā)育和繁殖，同時(shí)降低缺氧對(duì)機(jī)體的損害［3］。此外，高原動(dòng)物還可通過調(diào)控線粒體氧化代謝相關(guān)的信號(hào)通路，使機(jī)體在組織與細(xì)胞層面發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)，確保動(dòng)物能在缺氧的環(huán)境中正常生活［4］。腎臟作為動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，在高原動(dòng)物適應(yīng)缺氧環(huán)境過程中發(fā)揮重要功能［5］。有研究表明，環(huán)境缺氧和不同疾病引起的腎臟局部缺氧可能導(dǎo)致腎功能嚴(yán)重受損，引起慢性腎炎、慢性間質(zhì)性腎炎、腎病綜合征、無癥狀性蛋白尿等慢性疾?。?-7］。腎臟在這些疾病的發(fā)生過程中，均存在著不同程度因缺氧而產(chǎn)生的腎間質(zhì)細(xì)胞纖維化，因此，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（renal interstitial fibroblasts，RIFs）在低氧所致各類腎源性疾病的腎間質(zhì)纖維化過程中起決定性作用［8］。

丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1）是調(diào)節(jié)線粒體丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）活性的四種PDK 同工酶（PDK1、PDK2、PDK3、PDK4）之一［9］。在糖代謝過程中，PDK1 通過作用于丙酮酸脫氫酶，將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，1ACOH）并進(jìn)入線粒體參加三羧酸循環(huán)［10］。在低氧條件下，低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）對(duì)PDK1有顯著的調(diào)控作用，使其在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)隨氧濃度的變化改變，并通過不同途徑如PDK1/AKT 通路、TGF-β/Smad2 通路等參與到細(xì)胞生長代謝過程，進(jìn)一步調(diào)節(jié)Bcl-2、Caspase3/9 等下游凋亡因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬［11-12］。

目前低氧慢性病相關(guān)研究所采用的動(dòng)物模型主要集中于小鼠和大鼠［13-15］，針對(duì)高原動(dòng)物本身的研究還存在部分空白。為進(jìn)一步探索高原動(dòng)物的低氧適應(yīng)機(jī)制，本研究通過觀察低氧對(duì)PDK1及其下游因子TGF-β/Smad2、Caspase3/9等在牦牛和黑白花牛RIFs中的表達(dá)差異，分析不同海拔牛種RIFs 低氧的應(yīng)激差異，探究牦牛腎臟低氧適應(yīng)機(jī)制，旨在為治療低氧導(dǎo)致的慢性腎病提供治療思路，為高原醫(yī)療提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 牦牛腎組織樣本分離自甘南藏族自治州，黑白花牛腎組織樣本采集自西安市某屠宰場。

1.1.2 主要設(shè)備及試劑 CCL-170B-8 三氣箱，購自新加坡藝思高科技有限公司；CX31 光學(xué)顯微鏡、IX73倒置熒光顯微鏡，購自奧林巴斯（中國）有限公司；IE1000 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，購自上海睿鈺生物科技有限公司；Multiskan SkyHigh 酶標(biāo)儀，購自美國賽默飛世爾科技公司；CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。新生牛血清（newborn bovine serum，NBS)，購自蘭州民海生物工程有限公司；高糖（DMEM/HIGH GLUCOSE）培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS），購自北京賽澳美技術(shù)有限公司；PDK1、Smad2、Caspase3、Cytokeratin-18 和Vimentin 抗體，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；熒光二抗、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色液（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒采購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；4×蛋白上樣緩沖液、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒（enhanced chemiluminescence，ECL）、細(xì)胞培養(yǎng)用青鏈霉素混合液（100×），購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牦牛、黑白花牛腎原代細(xì)胞分離、培養(yǎng) 將青鏈霉素混合液100倍稀釋后按1∶10比例加入生理鹽水內(nèi)得到10%雙抗生理鹽水，分別取兩種牛完整腎臟浸泡于上述試劑中，由屠宰場運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，噴灑75%酒精消毒后移入超凈臺(tái)。剖開腎臟腎間質(zhì)組織，用含有10%雙抗的PBS 清洗后用眼科剪剪成約1 mm3小塊。每瓶12 塊組織均勻鋪于T25 細(xì)胞瓶底部，將細(xì)胞瓶背面朝上并在每瓶中加入2 mL 含有10%NBS 的DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)基。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置12 h，待組織塊貼壁后翻轉(zhuǎn)細(xì)胞瓶使組織塊浸入培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞從組織塊分裂出并貼壁融合率達(dá)到約90%后，用PBS洗去組織塊后按照1∶4比例傳代或凍存。

1.2.2 牦牛、黑白花牛RIFs 純化 依據(jù)成纖維細(xì)胞貼壁較快的特點(diǎn)，利用差速貼壁法純化細(xì)胞。將細(xì)胞用0.25%胰酶消化制成懸液后按1∶4的比例傳代至新T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3～4 h，觀察細(xì)胞貼壁情況。細(xì)胞貼壁率約70%時(shí)換液，除去未貼壁細(xì)胞后得到純度較高的成纖維細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%左右后傳代或凍存。

1.2.3 牦牛、黑白花牛RIFs 鑒定 在六孔板中鋪設(shè)細(xì)胞爬片，將傳代至第五代的細(xì)胞按每孔5×105個(gè)接種于六孔板中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼爬片生長至約80%后用PBS漂洗；在固定液中固定15 min后再次漂洗，用0.5%曲拉通X-100處理20 min增加細(xì)胞膜通透性；漂洗后滴加正常山羊血清封閉液，室溫封閉1 h；吸干封閉液后分別滴加一抗角蛋白-18（Cytokeratin-18，CK18）和波形蛋白（Vimentin），37 ℃條件下孵育2 h；PBS漂洗后滴加熒光二抗山羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h；PBS 漂洗后滴加DAPI 染液處理細(xì)胞核5 min；清洗并封片后觀察并拍攝熒光照片。

1.2.4 牦牛、黑白花牛RIFs生長曲線測(cè)繪 自第0天起將黑白花牛、牦牛腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞第五代分別以每孔5×103個(gè)的數(shù)量各接種于24 孔板內(nèi)，每種細(xì)胞設(shè)置24 個(gè)復(fù)孔并分為低氧培養(yǎng)（氧濃度1%）和常氧培養(yǎng)（氧濃度21%）兩組，每24 h 每組細(xì)胞消化3 孔計(jì)數(shù)至細(xì)胞生長進(jìn)入平臺(tái)期，繪制增殖曲線并計(jì)算倍增時(shí)間，計(jì)算公式為：

式中，X為細(xì)胞接種密度，Y為細(xì)胞生長峰值前一天的細(xì)胞密度，T為計(jì)數(shù)時(shí)間點(diǎn)。

1.2.5HIF-1α、PDK1、AKT1、Smad2、Caspase3、Caspase9基因表達(dá)水平檢測(cè) 取低氧（1%）和常氧（21%）組細(xì)胞，用Trizol 法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR），引物序列見表1。反應(yīng)體系共20 μL：2× Universal SYBR Green Fast qPCR MIX 10 μL、cDNA 模板0.2 μL、正向引物和反向引物各0.4 μL，ddH2O 9 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火32 s，45 個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。用2-△△CT法計(jì)算基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Primer information of qRT-PCR

1.2.6 PDK1、Smad2、Caspase3 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 取低氧和常氧組細(xì)胞在冰上用放射免疫沉淀試驗(yàn)（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液進(jìn)行蛋白裂解，將提取的蛋白定量后按照3∶1 的比例加入4×loading buffer，恒溫金屬浴100 ℃中10 min 至變性。取10 μL 蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide glue，SDSPAGE），用濕轉(zhuǎn)法將其蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，5%脫脂奶粉配置封閉液并室溫封閉2 h，HIF-1α（1∶1 000）、Smad2（1：250）、Caspase3（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）稀釋于脫脂奶粉、4 ℃條件下孵育過夜。二抗（1∶1 000）稀釋于脫脂奶粉室溫孵育1 h，滴加ECL（enhanced chemi-luminescene）化學(xué)發(fā)光液用于顯影。每組重復(fù)測(cè)定3 次，Image J 1.0 軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值測(cè)量并以內(nèi)參蛋白為參照進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0軟件的ANOVA分析法對(duì)不同組別的基因和蛋白表達(dá)差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并使用Graphpad8.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞分離、純化與培養(yǎng)

植塊法處理牦牛和黑白花牛腎組織后第4 天，可見細(xì)胞從組織中分裂出并貼壁（圖1-A、B），黑白花牛、牦牛腎原代細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察可見原代細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形或梭形，完全融合后部分呈漩渦狀，部分呈鋪路石狀。經(jīng)差速貼壁法純化后得到純度較高的梭形，漩渦狀生長的成纖維細(xì)胞（圖1-C、D）。

圖1 牦牛、黑白花牛RIFs分離、純化與培養(yǎng)（40×）Fig.1 Isolation，purification and culture of RIFS from yak and Holstein （40 ×）

2.2 細(xì)胞鑒定

上皮類細(xì)胞特異性蛋白標(biāo)志物CK-18 在純化后的牦牛和黑白花牛細(xì)胞表達(dá)均為陰性（圖2-A、B），波形蛋白（vimentin）為成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)志物，在兩種細(xì)胞內(nèi)均呈陽性表達(dá)且熒光信號(hào)較強(qiáng)（圖2-C、D）。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)的細(xì)胞為牦牛和黑白花牛腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞且純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 牦牛、黑白花牛RIFs免疫熒光染色鑒定Fig.2 Identification of RIFS in yak and Holstein by immunofluorescence staining

2.3 牦牛、黑白花牛RIFs生長曲線

細(xì)胞生長曲線測(cè)定結(jié)果顯示，牦牛腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞在第5～第6天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第6天之后進(jìn)入平臺(tái)期，潛伏期（第1～第4天）低氧與常氧細(xì)胞增殖速度無明顯差異，對(duì)數(shù)生長期常氧組增殖能力較強(qiáng)（圖3-A）。低氧和常氧培養(yǎng)的黑白花牛RIFs均在第5天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第6天進(jìn)入平臺(tái)期，潛伏期（第1～第4 天）兩組細(xì)胞增殖速度無明顯差異，對(duì)數(shù)生長期過程中常氧組細(xì)胞生長速度明顯高于低氧組（圖3-B）。根據(jù)細(xì)胞生長曲線測(cè)得細(xì)胞生長峰值數(shù)量代入1.2.4 中公式計(jì)算得到：潛伏期內(nèi)牦牛細(xì)胞低氧組倍增所需時(shí)間約為48 h，黑白花牛細(xì)胞低氧組倍增時(shí)間約為44 h，牦牛RIFs在低氧條件下生長速度明顯低于黑白花牛。

圖3 黑白花牛、牦牛低氧和常氧組生長曲線Fig.3 Growth curves of Holstein and yak in hypoxia and normoxia groups

2.4 HIF-1α、PDK1、AKT1、Smad2、Caspase3、Caspase9基因表達(dá)水平檢測(cè)

細(xì)胞生長曲線測(cè)得牦牛和黑白花牛RIFs 倍增時(shí)間約為44～48 h，故選擇細(xì)胞分裂周期48 h、中點(diǎn)24 h以及第二個(gè)分裂周期中點(diǎn)72 h，這3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)制備基因和蛋白樣品。qRT-PCR 結(jié)果表明，兩種牛RIFs 的HIF-1α、PDK1、Smad2基因在低氧培養(yǎng)條件下對(duì)比常氧組均存在顯著或極顯著上調(diào)（圖4-A～C）。其中黑白花牛PDK1基因隨低氧培養(yǎng)時(shí)間增加而上調(diào)，24 h時(shí)與0 h 相比無顯著差異，48 h 時(shí)差異顯著（P＜0.05），培養(yǎng)72 h 時(shí)差異極顯著（P＜0.001）；而牦牛RIFs 中的PDK1則在24～72 h 時(shí)均極顯著上調(diào)（P＜0.001），在24 h 時(shí)達(dá)到峰值（圖4-B）。黑白花牛的HIF-1α和Smad2在低氧培養(yǎng)至72 h 時(shí)極顯著上調(diào)，而牦牛則在24 h 達(dá)到峰值，隨后下調(diào)至與對(duì)照無顯著差異。AKT1基因在黑白花牛RIFs 低氧培養(yǎng)至48 h 時(shí)表達(dá)量有顯著下調(diào)，在牦牛中則在低氧培養(yǎng)24 h 時(shí)顯著上調(diào)（圖4-D）。此外，凋亡因子Caspase3在黑白花牛和牦牛RIFs 的不同低氧培養(yǎng)時(shí)間均有極顯著上調(diào)，其中黑白花牛為72 h，牦牛為24 h（圖4-E）。另一種凋亡因子Caspase9在低氧培養(yǎng)至48 和72 h 時(shí)均極顯著上調(diào)，但不同的是48 h時(shí)牦牛的上調(diào)倍數(shù)比黑白花牛更高（圖4-F）。綜上，牦牛HIF-1α、PDK1、Smad2及Caspase3、AKT1基因整體上于24 h顯著上調(diào)，之后下調(diào)，而黑白花牛基因則整體上隨時(shí)間呈遞增趨勢(shì)。

圖4 PDK1相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)Fig.4 Expression detection of PDK1 related genes

2.5 PDK1、Smad2和Caspase3蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示在低氧誘導(dǎo)條件下，黑白花牛和牦牛RIFs 中PDK1 蛋白表達(dá)量均極顯著上調(diào)，其中黑白花牛PDK1 蛋白表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間延長而增加，牦牛的PDK1 蛋白前48 h 也隨培養(yǎng)時(shí)間延長而增加，但在72 h 時(shí)比48 h 有所下降（圖5-B）。黑白花牛RIFs 的Smad2 蛋白僅在被低氧培養(yǎng)至72 h時(shí)顯著上調(diào)，牦牛中則在整個(gè)低氧培養(yǎng)過程中（24～72 h）均有顯著上調(diào)（P＜0.01）（圖5-C）。兩種牛RIFs內(nèi)的Caspase3 蛋白均上調(diào)，但黑白花牛的Caspase3 上調(diào)倍數(shù)高于牦牛（圖5-D）。

圖5 PDK1相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)Fig.5 Detection of PDK1 related protein expression

3 討論

成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)常用方法包括植塊法、胰酶消化法、流式細(xì)胞分選法以及免疫磁珠法等［16-17］。本試驗(yàn)選用了對(duì)細(xì)胞損傷最小的植塊法［18］對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離，所得原代細(xì)胞中成纖維細(xì)胞比例約占總數(shù)的80%，雜細(xì)胞約占總量20%。為獲得更純凈的成纖維細(xì)胞，利用成纖維細(xì)胞貼壁較快的特性［19］，通過差速貼壁的方式，待細(xì)胞貼壁率約70%時(shí)舍棄剩余的大部分雜細(xì)胞和小部分成纖維細(xì)胞獲得純度較高的成纖維細(xì)胞。細(xì)胞免疫熒光染色鑒定所得結(jié)果證明本研究選用的原代細(xì)胞分離與純化方法體系可行。本研究選用高糖型DMEM 培養(yǎng)基添加10%新生牛血清進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)驗(yàn)證，差速貼壁法純化后的RIFs在10代之前的細(xì)胞凍存復(fù)蘇后仍能保持較好的增殖能力，可用于功能驗(yàn)證。

在低氧對(duì)糖尿病小鼠模型的研究中，Zheng 等［20］發(fā)現(xiàn)低氧會(huì)增加糖尿病動(dòng)物的循環(huán)活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）含量；HIF-1α 在糖尿病動(dòng)物腎臟及其他缺氧細(xì)胞中表達(dá)受到抑制。此時(shí)，受抑制的HIF-1α 通過下調(diào)PDK1 間接調(diào)控線粒體呼吸反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體ROS 減少，對(duì)糖尿病動(dòng)物起到腎臟保護(hù)和抗細(xì)胞凋亡作用［21］。這說明HIF-1α 可通過調(diào)控PDK1活性，參與細(xì)胞增殖和凋亡過程［1，22］。已有證據(jù)表明PDK1、Smad2和Casp3在小鼠和人的信號(hào)通路中有直接調(diào)控關(guān)系并在表型驗(yàn)證中起主要作用［23-24］，且本研究結(jié)果中相應(yīng)基因在牦牛RIFs 和黑白花牛RIFs 間表達(dá)差異具有顯著性，故本試驗(yàn)選擇PDK1、Smad2和Casp3作為主要蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行下一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)下牦牛PDK1 的基因和蛋白表達(dá)均有顯著上調(diào)，且上調(diào)程度均大于黑白花牛；基因?qū)用?，牦牛RIFs 低氧處理24 h 時(shí)達(dá)到峰值，隨后顯著下調(diào)，而黑白花牛則隨時(shí)間呈遞增趨勢(shì)。不僅證實(shí)了低氧對(duì)HIF-1α 和PDK1 的上調(diào)作用，也證明兩種牛對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)性存在差異。

已有研究表明，PDK1通過調(diào)控TGF-β可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌纖維細(xì)胞［25］。此外，在低氧細(xì)胞培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，低氧通過誘導(dǎo)線粒體中蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的積累和磷酸化，激活A(yù)KTPDK1信號(hào)，促進(jìn)PDK1的磷酸化，并上調(diào)Smad表達(dá)，從而促進(jìn)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響TGF-β的表達(dá)［14］。同時(shí)，PDK1 與TGF-β 之間存在中間信號(hào)分子絲氨酸-蘇氨酸激酶受體相關(guān)蛋白（serine-threonine kinase receptor-associated protein，STRAP），可與PDK1 形成體內(nèi)復(fù)合物，進(jìn)而穩(wěn)定TGF-β/Smad 信號(hào)［26］。TGF-β 調(diào)控Bcl-2 的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，繼而使細(xì)胞進(jìn)一步活化、增殖與遷移，活化的細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）［27］。本研究通過檢測(cè)黑白花牛和牦牛RIFs內(nèi)Smad2和AKT1基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，這兩種基因在低氧培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)均呈上調(diào)趨勢(shì)，與前期研究一致［26］，牦牛RIFs 于24 h 達(dá)到峰值后下調(diào)，黑白花牛RIFs 隨時(shí)間延長呈遞增趨勢(shì)，進(jìn)一步證明低氧對(duì)牦牛的各因子的誘導(dǎo)作用與平原牛種存在種屬差異。此外，兩牛種細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Caspase3/9 因子的表達(dá)差異也符合以上理論，牦牛RIFs 于24～48 h 達(dá)到峰值后下調(diào)，證明其在短期應(yīng)激后適應(yīng)了低氧環(huán)境，未出現(xiàn)明顯的凋亡趨勢(shì)，而黑白花牛RIFs 則隨低氧培養(yǎng)逐漸上調(diào)，出現(xiàn)了明顯的凋亡趨勢(shì)。Zou等［28］通過藥物抑制大鼠TGF-β1通路，發(fā)現(xiàn)其腎纖維化程度因TGF-β1/Smad3通路的抑制而減輕。此外，前期研究表明，低氧引起的HIF-1α 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上調(diào)可誘導(dǎo)TGF-β 激活［29］。結(jié)合本研究中PDK1 和Smad2 在基因和蛋白水平上隨低氧而產(chǎn)生的調(diào)節(jié)預(yù)測(cè)，低氧誘導(dǎo)的PDK1/TGF-β/Smad2通路激活可能是促使黑白花牛腎纖維化程度加深，引發(fā)其腎源性高原疾病的主要原因之一。

Chen 等［23］發(fā)現(xiàn)，沉默PDK1 和AKT 等因子會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的增殖能力降低，Shi 等［30］和Ikushima 等［31］也分別從不同層面證明了TGF-β/Smad 通路在成纖維細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用呈正相關(guān)。低氧上調(diào)HIF-1α 和PDK1，進(jìn)而上調(diào)下游因子TGF-β/Smad2和AKT1基因的表達(dá)量，從而促進(jìn)了RIFs 增殖能力提高。牦牛在物種進(jìn)化過程中已產(chǎn)生對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)性，故其腎臟在低氧下的纖維化程度較平原牛更輕［8］，本研究中牦牛RIFs 增殖速度在低氧下比常氧低，可能是腎臟為適應(yīng)低氧環(huán)境對(duì)纖維化加深產(chǎn)生抵抗所致。此外，低氧培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后牦牛和黑白花牛RIFs的增殖能力遠(yuǎn)低于常氧，推測(cè)其主要原因是1%濃度的極端低氧啟動(dòng)了TGF-β下游的凋亡相關(guān)因子［24，28］，導(dǎo)致Caspase3/9顯著上調(diào)，打破了低氧下細(xì)胞增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)RIFs 細(xì)胞大量凋亡并引起增殖緩慢。同一因子在mRNA 和蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)不一致可能是由于mRNA 與蛋白半衰期不同，低氧應(yīng)激造成基因?qū)用嫠矔r(shí)變化且在指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成過程中有其他轉(zhuǎn)錄因子的參與，從而影響蛋白的最終表達(dá)。牦牛和黑白花牛RIFs 的低氧下增殖能力的不同證實(shí)了兩物種對(duì)高原環(huán)境的適應(yīng)性存在差異。但低氧通過以上因子在牛RIFs 內(nèi)對(duì)增殖能力和凋亡等表型的產(chǎn)生差異性作用的原因和具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

低氧下黑白花牛和牦牛RIFs 中HIF-1α、PDK1、AKT1、Smad2和Caspase3/9基因和PDK1、Smad2、Caspase3蛋白表達(dá)相較于常氧組存在顯著上調(diào)，且牦牛RIFs 于低氧24～48 h 達(dá)到峰值后下調(diào)，黑白花牛則隨低氧培養(yǎng)時(shí)間增長而逐漸上調(diào)，黑白花牛RIFs 低氧下增殖能力明顯高于牦牛，以上可能是引起低海拔動(dòng)物低氧腎纖維化程度加重的原因之一，同時(shí)也證明了牦牛對(duì)低氧環(huán)境具有更好的適應(yīng)性。