陳 楠，李曉月，顧欣雨，吳同鑫，章 汝，李 云，唐香平，戴 勁，易永祥

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院，江蘇 南京 210003；2.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 211166）

橋粒芯蛋白（DSG2）蛋白是一種跨膜蛋白，其在組織中廣泛表達(dá)，它的基因在染色體的18q12.1上［1］。DSG2 是經(jīng)典鈣黏著蛋白家族中的一員，它幫助調(diào)控細(xì)胞之間進(jìn)行連接并促進(jìn)橋粒裝配［2］。橋粒涉及到細(xì)胞黏附連接，而黏附連接對腫瘤發(fā)生、發(fā)展又有重要影響，尤其對癌細(xì)胞遷移及侵襲有明顯影響［3］。愈來愈多證據(jù)顯示DSG2 參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展，如DSG2 就是評判卵巢癌預(yù)后最重要的生物 標(biāo) 志 物 之 一［4］。DSG2 在EGFR/Src/PAK1 通 路中調(diào)節(jié)肺腺癌發(fā)生、發(fā)展，高表達(dá)也會使腫瘤對奧西美替尼耐藥性增強［5，6］。研究發(fā)現(xiàn)，DSG2 過表達(dá)于人宮頸癌細(xì)胞中，并通過介導(dǎo)MAPK 通路活化對宮頸癌細(xì)胞惡性行為產(chǎn)生影響，敲除該基因后能抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲［7］。此外，近年來DSG2 被認(rèn)為是與人55 型腺病毒（HAdV‐55）結(jié)合的主要高親和力受體［8］。HAdV‐55 感染可導(dǎo)致輕、重兩種疾病，臨床表現(xiàn)為高燒、咳嗽、喉嚨痛、支氣管炎和肺炎等癥狀，有時危及生命［9］。在2005 年新加坡軍事訓(xùn)練營發(fā)生了HAdV‐55 感染爆發(fā)，226 人出現(xiàn)了急性呼吸道疾?。?0］；2015 年北京某培訓(xùn)基地12 名青少年因為HAdV‐55 感染出現(xiàn)了急性呼吸道癥狀［9］；2016 年中國四川、云南和西藏軍營三百多人由于HAdV‐55 感染出現(xiàn)急性呼吸道癥狀［11］；2019年中國安徽一名患者因為HAdV‐55 感染而死亡［12］。HAdV‐55 已對公眾造成了潛在威脅。

目前，尚無用于HAdV‐55 的預(yù)防疫苗或抗病毒藥物。腺病毒纖毛蛋白在與其對應(yīng)受體結(jié)合時介導(dǎo)腺病毒黏附靶細(xì)胞并引發(fā)胞吞作用以促進(jìn)腺病毒進(jìn)入細(xì)胞［13］，這是腺病毒感染致病的第一步。針對病毒進(jìn)入的抗病毒藥物可以從源頭上防止病毒感染細(xì)胞，而且還避免了細(xì)胞內(nèi)藥物輸送，防止腺病毒與受體結(jié)合可以有效阻止病毒感染、細(xì)胞損傷和后續(xù)的細(xì)胞因子釋放［14］。因此設(shè)計阻斷腺病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合的抗腺病毒藥物至關(guān)重要。鑒于DSG2 蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和腺病毒感染研究中的重要性，如何高效獲得DSG2 蛋白是研究其蛋白功能及開發(fā)抗腺病毒藥物的關(guān)鍵。本研究通過PCR 擴增DSG2 胞外域片段基因（DSG2ex），在雙酶切和T4 DNA 連接酶的作用下連接到真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV3‐IgG1 中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV3‐DSG2ex‐IgG1。將構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T 細(xì)胞中外分泌表達(dá)DSG2胞外域蛋白，通過Protein A 純化出高純度且具有良好生物活性的可溶性DSG2 胞外域蛋白，建立一種簡單高效的人可溶性DSG2 胞外域蛋白真核表達(dá)及純化方法。一方面表達(dá)純化的DSG2 胞外域融合蛋白可以用于后期蛋白功能的研究；另一方面表達(dá)純化的DSG2 胞外域融合蛋白也可阻斷HAdV55 腺病毒與其天然受體結(jié)合，為抗腺病毒藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和蛋白 pCMV3‐IgG1 質(zhì)粒（含有外分泌信號肽）、pCDNA4To‐DSG2 質(zhì)粒、293T 細(xì)胞、CAR 胞 外 域 蛋 白 和HAdV‐55 腺 病 毒Fiber Knob 蛋白由本實驗室保存，Top10 感受態(tài)細(xì)胞購自昂羽生物。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基購自江蘇凱基生物公司，胰蛋白酶‐EDTA （0.05%）含酚紅，Opti‐MEM 培養(yǎng)基和Freestyle 293 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，EZ Trans 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（高效）購自上海李記生物有限公司，Super Red 核酸染料、Fast Blue 蛋白快速染色液購自南京普諾恩生物技術(shù)有限公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量快速提取試劑盒購自北京君諾德生物技術(shù)有限公司，瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自美基生物，PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自O(shè)mega 公司，Pyrobest DNA 聚合酶，DL2000 Mark‐er、DL15000 Marker 和6×loading buffer 購 自Taka‐ra 公司，蛋白純化儀、Protein A 柱子購自思拓凡公司，Anti‐Human IgG antibody 購 自Abcam 公 司，HRP Goat Anti‐Rabbit IgG（H+L）Antibody 購 自APExBIO 公司，50×TAE、氨芐青霉素溶液（100 mg/mL）購自索萊寶公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗人IgG（H+L）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 在Uniprot 上查找人DSG2 胞外區(qū)的氨基酸序列（50‐609）（Uniprot ID：Q14126），然 后 再NCBI 上 找 到 對 應(yīng) 的DNA 序 列（Gene ID：1829），根據(jù)DSG2 胞外區(qū)DNA 序列和pCMV3‐IgG1 質(zhì)粒圖譜上的多克隆位點AfeⅠ酶和BmtⅠ酶，使用Snapgene 軟件設(shè)計出DSG2 胞外區(qū)上游引物和下游引物，上下游引物交由南京金斯瑞公司合成。

DSG2ex上 游 引 物：5′‐GCCGAGCGCT‐GCCTGGATCACCGCCCC‐3′

（下劃線部分為AfeⅠ酶切位點）

DSG2ex下 游 引 物：5′‐ATCGGCTAGC‐GCCCACATAGGAGTCATGC‐3′

（下劃線部分為BmtⅠ酶切位點）

1.2.2 真 核 表 達(dá) 載 體 的 構(gòu) 建 以 pCD‐NA4To‐DSG2 質(zhì)粒為模板、使用上下游引物，Py‐robest DNA 聚合酶通過PCR 擴增得到DSG2 胞外區(qū)片段，擴增條件：95 ℃ 5 min，98 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30 個循環(huán)，72 ℃終延伸2 min，冷卻至12 ℃。使用AfeⅠ酶和BmtⅠ酶將pC‐MV3‐IgG1 載體和DSG2 胞外區(qū)片段雙酶切之后，在T4 DNA 連接酶的作用下構(gòu)建真核表達(dá)載體pC‐MV3‐DSG2ex‐IgG1（圖1）。將 該 載 體 轉(zhuǎn) 化 至Top10 感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)氨芐抗性標(biāo)記篩選得到的陽性克隆菌落PCR 鑒定之后，交由南京斯普金公司進(jìn)行測序。利用SnapGene 和DNAMAN 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 質(zhì)粒的大量提取 取10 ng 重組質(zhì)粒加入冰上融化的Top10 感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置25 min、42 ℃熱激45 s、冰上靜置2 min 后，加入1 mL LB 液體培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫?fù)u床上以200 r/min 搖晃1 h使其復(fù)蘇；然后將菌液以5 000 r/min 在小型離心機上離心1 min，留100 μL 上清吹打混勻之后將其涂布在LB 固體培養(yǎng)板（含氨芐青霉素）上，37 ℃細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱中靜置過夜培養(yǎng)。挑取PCR 出目的片段的單克隆菌加入到含有5 mL LB 液體培養(yǎng)基的搖菌管中，再加入至5 μL 氨芐青霉素溶液，將搖菌管放在37 ℃的恒溫?fù)u床上以200 r/min 搖晃6～8 h，再以1∶1 000 的比例轉(zhuǎn)接至150 mL 氨芐抗性（終濃度1%）的LB 液體培養(yǎng)基中在37 ℃的恒溫?fù)u床上以200 r/min 培養(yǎng)過夜，第二天收集菌液，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，根據(jù)無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒說明書的要求提取質(zhì)粒。

1.2.4 293T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 將293T 細(xì)胞接種于6 孔板中（5×105個/孔），置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12～16 h，使細(xì)胞密度在80%左右，按EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（高效）操作說明，將大量提取的質(zhì)粒pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 和EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑以1∶3比例（推薦比例），3 μg 質(zhì)粒和9 μL 轉(zhuǎn)染試劑混合轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，6 h 后換成Freestyle 293 培養(yǎng)基，分別于轉(zhuǎn)染后48 h、72 h 和96 h 收集培養(yǎng)上清。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物檢測 分別收集轉(zhuǎn)染后48 h、72 h、96 h 和120 h 的上清，12 000 r/min，離心5 min 去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，取等量的48 h、72 h、96 h 和120 h上清放置在ELISA 板子中，用PBS（pH 7.4）稀釋，每孔的量保持100 μL，4 ℃包被過夜。次日倒掉抗原，甩干，每孔加入200 μL PBS 在搖床上洗滌3 次，每孔加入250 μL 的5%脫脂奶粉‐PBST，37 ℃封閉1 h。每孔加入200 μL PBST，3 min/次，洗3 次。每孔 中 加 入100 μL 用5% 脫 脂 奶 粉‐PBST 稀 釋 的HRP‐山羊抗人IgG 抗體（1∶250 稀釋）37 ℃孵育1 h。每孔加入200 μL PBST，3 min/次，洗5 次。每孔加入100 μL 酶反應(yīng)底物TMB，室溫放置5～10 min（避光），每孔加入50 μL ELISA 終止液終止反應(yīng)。將ELISA 板子放在酶標(biāo)儀上在450 nm 波長處測定其OD450值。

1.2.6 DSG2 胞外域蛋白純化 將293T 細(xì)胞接種于10 個10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12～16 h，使細(xì)胞密度在80%左右，按EZ Trans 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（高效）操作說明，將大量提取的 質(zhì) 粒pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 和EZ Trans 轉(zhuǎn) 染 試劑以1∶3 比例（推薦比例），12 μg 質(zhì)粒和36 μL 轉(zhuǎn)染試劑混合轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，6 h 后換成Freestyle 293培養(yǎng)基，于轉(zhuǎn)染后96 h 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清，于10 000 r/min，4 ℃離心15 min去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。將離心之后的上清再用0.45 μm 的濾膜過濾，將過濾之后的上清以2 mL/min 與HiTrap Protein A HP 5 mL 預(yù)裝柱結(jié)合，用6倍柱體積的PBS 緩沖液（pH 7.4）洗滌預(yù)裝柱，然后用3 倍柱體積的0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液（pH 3.5）洗脫目的蛋白至含450 μL 1 mol/L Tris‐HCl 緩沖液（pH 9.0）的收集管中，根據(jù)洗脫出峰位置得到3管純化產(chǎn)物，取20 μL 產(chǎn)物加5 μL 蛋白Loading buf‐fer，在100 ℃水浴鍋中5 min 使其完全變性，用10%SDS‐PAGE 分析其純度。

1.2.7 DSG2 胞外域蛋白的鑒定 將收集的3 管純化產(chǎn)物經(jīng)超濾管濃縮之后，用BCA 試劑盒測定其濃度，對濃縮產(chǎn)物進(jìn)Western Blotting 分析，一抗為1∶10 000 稀釋的兔Anti‐Human IgG antibody，二抗為1∶5 000 稀釋的山羊抗兔IgG（H+L）HRP，特超敏ECL 化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.8 DSG2 胞外域蛋白生物活性檢測 蛋白包被：將純化后的DSG2 胞外域蛋白以及CAR 胞外域蛋白按照400 ng/孔劑量加入 96 孔 ELISA 板中，4 ℃包被過夜。

洗板：第二天倒掉抗原，用PBS 洗3 次。

封閉：加入5 %脫脂奶粉‐PBST，每孔250 μL，37 ℃封閉1 h。

洗 板：每 孔 加 入200 μL PBST，3 min/次，洗3 次。

蛋白孵育：將 Fiber Knob 蛋白按1 ng/孔，0.5 ng/孔，0.25 ng/孔，0.125 ng /孔加至包被有DSG2胞外域蛋白和 Fiber Knob 蛋白的孔中，置于37 ℃溫箱孵育2 h，使蛋白充分結(jié)合。

洗 板：每 孔 加 入200 μL PBST，3 min/次，洗5 次。

結(jié)合第二抗體：每孔加入100 μL 適當(dāng)稀釋度His Tag Antibody（HRP），37 ℃孵育1 h。（用封閉液稀釋）

洗 板：每 孔 加 入200 μL PBST，3 min/次，洗5 次。

顯色：每孔加入100 μL 酶反應(yīng)底物TMB，室溫放置5～10 min。

終止反應(yīng)：加入50 μL ELISA 終止液終止反應(yīng)。

結(jié)果測定：用酶標(biāo)儀檢測OD450值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果均采用GraphPad Prism 9.4.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用（±s）表示，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重 組 表 達(dá) 質(zhì) 粒pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 的 構(gòu) 建及鑒定

以pCDNA4To‐DSG2 質(zhì) 粒 為 模 板，PCR 擴 增出DSG2 胞外域片段，通過0.7%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，擴增片段約為1 680 bp 左右，與理論序列大小位置一致（圖2）。使用AfeⅠ酶和BmtⅠ酶將pCMV3‐IgG1 載體雙酶切經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測到一條7 500 bp 左右的條帶，與空質(zhì)粒pC‐MV3‐IgG1 大小相符合（圖2）。重組表達(dá)質(zhì)粒pC‐MV3‐DSG2ex‐IgG1 經(jīng)AfeⅠ酶 和BmtⅠ酶 雙 酶切，可見約1 680 bp 的目的基因條帶，大小位置和理論一致（圖2），表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。測序結(jié)果顯示，獲得的基因序列與目的基因序列完全一致。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 的構(gòu)建及鑒定圖Fig 2 Construction and identification of recombinant ex-pression plasmid pCMV3-DSG2ex-IgG1

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的檢測

ELISA 結(jié)果顯示，48 h 能檢測上清中有分泌的DSG2 胞外域蛋白（DSG2ex‐IgG1）表達(dá)，與pCMV3‐IgG1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比較，pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 轉(zhuǎn)染后隨著時間的增加上清中DSG2 胞外域蛋白（DSG2ex‐IgG1）表達(dá)量逐漸增加（P<0.000 1），96 h上清中表達(dá)量最高，120 h 上清中蛋白表達(dá)量比96 h略 低。表 明pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 染 成 功并表達(dá)出來了DSG2 胞外域蛋白（DSG2ex‐IgG1），選擇轉(zhuǎn)染96 h 后細(xì)胞上清收集進(jìn)行后續(xù)大量純化蛋白。見圖3 和表1。

表1 DSG2胞外域蛋白不同時間段含量檢測（n=3，±s）Tab 1 Detection of DSG2 extracellular domain protein con-tent at different time periods（n=3，±s）

表1 DSG2胞外域蛋白不同時間段含量檢測（n=3，±s）Tab 1 Detection of DSG2 extracellular domain protein con-tent at different time periods（n=3，±s）

時間（h）t P 48 72 96 120 pC‐MV3‐DSG2ex‐IgG1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染0.585±0.001 2.070±0.000 2.560±0.002 2.520±0.006 pC‐MV3‐IgG1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染0.080±0 0.322±0 0.380±0 0.440±0 27.23 261.90 77.05 43.82<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1

圖3 DSG2 胞外域蛋白不同時間段含量檢測Fig 3 Detection of DSG2 extracellular domain protein content at different time periods

2.3 DSG2 胞外域蛋白（DSG2ex‐IgG1）Protein A親和層析結(jié)果

轉(zhuǎn)染96 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)過Protein A 親和層析結(jié)果如圖4，相對分子質(zhì)量在100～130 kDa 之間出現(xiàn)條帶，與預(yù)期大小一致，純化的融合蛋白經(jīng)SDS‐PAGE 分析，可見其純度達(dá)90%以上。

圖4 DSG2 胞外域蛋白Protein A 親和層析結(jié)果Fig 4 DSG2 extracellular domain protein Protein A affin-ity chromatography results

2.4 DSG2 胞外域蛋白Western blotting 鑒定

Western Blotting 分 析 顯 示，純 化 的DSG2 胞 外域 蛋 白 可 與 兔Anti‐Human IgG antibody 特 異 性 結(jié)合，相對分子質(zhì)量在100～130 kDa 檢測到特異性條帶，與預(yù)期大小一致，見圖5。超濾管濃縮之后BCA測蛋白濃度為0.8 mg/mL。

圖5 純化的DSG2 胞外域蛋白Western Blotting 鑒定Fig 5 Western Blotting identification of purified DSG2 extracellular domain protein

2.5 純化的DSG2 胞外域蛋白生物學(xué)活性檢測

ELISA 結(jié) 果 顯 示：將400 ng 的DSG2 胞 外 域 蛋白包被在ELISA 板中，用不同濃度的Fiber Knob 蛋白與之孵育。與陰性蛋白比較，結(jié)果表明Fiber Knob 蛋白與DSG2 胞外域蛋白之間存在直接的相互作用，并且這種相互作用是劑量依賴性的（P<0.000 1）。表明制備純化的DSG2 胞外域蛋白具有明顯結(jié)合Fiber Knob 蛋白的活性。見圖6 和表2。

表2 真核表達(dá)純化的DSG2 胞外域蛋白生物學(xué)活性檢測（n=3，±s）Tab 2 Detection of biological activity of eukaryotic expressed and purified DSG2 Ectodomain protein （n=3，±s）

表2 真核表達(dá)純化的DSG2 胞外域蛋白生物學(xué)活性檢測（n=3，±s）Tab 2 Detection of biological activity of eukaryotic expressed and purified DSG2 Ectodomain protein （n=3，±s）

濃度（ng/孔）DSG2 胞外 域蛋白‐Fiber Knob 蛋 白CAR 胞外域蛋白‐Fiber Knob 蛋白（陰性對照組）t P 1 0.5 0.25 0.125 1.820±0.005 1.200±0.001 0.720±0.002 0.430±0.001 0.057±0.000 0.056±0.000 0.056±0.000 0.056±0.000 43.21 76.64 27.80 25.87<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1

圖6 真核表達(dá)純化的DSG2 胞外域蛋白生物學(xué)活性檢測Fig 6 Detection of biological activity of eukaryotic ex-pressed and purified DSG2 Ectodomain protein

3 討論

近些年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)DSG2 與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此關(guān)于DSG2 蛋白功能的研究非常重要。近幾年關(guān)于HAdV‐55 引起的急性呼吸道疾病報道逐漸增多。HAdV‐55 正成為社區(qū)特別是軍營暴發(fā)急性呼吸道疾病的主要原因。但是尚無HAdV‐55 感染治療的特效藥物及預(yù)防疫苗。DSG2 蛋白是HAdV‐55 結(jié)合的主要高親和力受體，所以DSG2 蛋白成為抗腺病毒藥物研究的一個重要方向。如何高效獲得DSG2 蛋白是研究其蛋白功能及開發(fā)抗腺病毒藥物的關(guān)鍵。

本 研 究 成 功 構(gòu) 建 了pCMV3‐DSG2ex‐IgG1 真核表達(dá)載體，通過其轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞成功表達(dá)了DSG2 胞外域蛋白，并通過信號肽的作用成功將胞外域蛋白分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中，不需要對細(xì)胞進(jìn)行裂解來提取蛋白，節(jié)省了時間和成本，而且真核表達(dá)可使蛋白產(chǎn)物適當(dāng)折疊以增加可溶性并避免原核表達(dá)中蛋白不能正確折疊而導(dǎo)致包涵體生成的麻煩。另外，整合人IgG Fc 標(biāo)簽對構(gòu)建重組載體和蛋白構(gòu)象穩(wěn)定等方面都具有重要影響，可提高抗原的清除率和加強純化蛋白的半衰期［15］，同時也能促使融合蛋白以異二聚體的形式存在［16］。融合人Fc片段所制備的抗體是一種全人源化單克隆，能顯著降低融合蛋白對人體的免疫原性［17］。

本研究中當(dāng)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑以1∶3 比例轉(zhuǎn)染時，DSG2 胞外域蛋白表達(dá)含量在96 h 達(dá)到最高，120 h 蛋白表達(dá)含量比96 h 略低，且隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，細(xì)胞狀態(tài)也越來越差并且時間久蛋白也會降解影響其后續(xù)的活性。所以本研究中選擇96 h 收集細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)蛋白純化。但是質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的比例也可能導(dǎo)致蛋白量表達(dá)發(fā)生變化，所以這也是一個值得需要優(yōu)化的條件。

綜上所述，本研究成功建立了一種簡單高效的人可溶性DSG2 胞外域蛋白真核表達(dá)及純化的方法，且純化出具有生物活性的DSG2 胞外域蛋白，為后期其蛋白功能研究及抗腺病毒藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

陳楠：進(jìn)行研究構(gòu)思、實驗操作、數(shù)據(jù)分析、文稿起草；李曉月、顧欣雨：參與質(zhì)粒構(gòu)建和ELISA 實驗；吳同鑫、章汝：參與細(xì)胞培養(yǎng)與蛋白純化；唐香平、李云、戴勁：參與West‐ern blotting 實驗和數(shù)據(jù)分析；易永祥：研究經(jīng)費支出和文章修正。

所有作者聲明不存在利益沖突。