朱垚龍 王政全 吳春 尹寧娜 劉乃勇

摘要

采用分子生物學(xué)和熒光競爭性結(jié)合測定等技術(shù)，研究了冷杉梢斑螟Dioryctria?abietella雌蟲性腺和雌、雄成蟲足中高表達的化學(xué)感受蛋白DabiCSP8基因的表達特征和功能。定量分析結(jié)果表明，DabiCSP8基因在雌蟲性腺中顯著高表達，表達量分別是雌、雄蟲觸角的1?232.27倍和3?130.64倍;此外，該基因在雌、雄成蟲足中表達量也較高。通過原核表達系統(tǒng)及親和層析技術(shù)獲得了13.64?kD的目的蛋白DabiCSP8。結(jié)合測定結(jié)果表明，DabiCSP8與探針N苯基1萘胺（1NPN）具有強的結(jié)合能力，結(jié)合常數(shù)（K1NPN）為（1.61±0.02）μmol/L。β紫羅蘭酮是DabiCSP8的最佳結(jié)合配基，解離常數(shù)（Kd）為（11.43±0.62）μmol/L。DabiCSP8結(jié)合腔內(nèi)的極性氨基酸精氨酸46（Arg46）能夠與β紫羅蘭酮形成兩個氫鍵，暗示Arg46在該化合物的結(jié)合中起著重要作用。此外，DabiCSP8與部分殺蟲劑具有中等強度的結(jié)合能力。

關(guān)鍵詞

冷杉梢斑螟;?化學(xué)感受蛋白;?結(jié)合測定;?β紫羅蘭酮;?分子對接

中圖分類號：

S?763.3

文獻標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022171

Ligand?binding?property?of?chemosensory?protein?8?（DabiCSP8）?of?Dioryctria?abietella

ZHU?Yaolong，?WANG?Zhengquan，?WU?Chun，?YIN?Ningna，?LIU?Naiyong*

（Key?Laboratory?of?Forest?Disaster?Warning?and?Control?of?Yunnan?Province，?Southwest?Forestry?University，?Kunming?650224，?China）

Abstract

In?this?study，?the?expression?profiles?of?DabiCSP8?and?binding?properties?of?DabiCSP8?enriched?in?female?pheromone?glands?and?female?and?male?legs?of?Dioryctria?abietella?were?characterized?using?molecular?biological?methods?and?fluorescence?competitive?binding?assays.?Quantitative?realtime?PCR?results?revealed?that?the?expression?of?DabiCSP8?was?significantly?higher?in?female?pheromone?glands?compare?to?other?tissues，?which?was?1?232.27?and?3?130.64fold?higher?than?that?in?female?and?male?antennae，?respectively.?In?addition，?the?high?expression?of?DabiCSP8?was?also?detected?in?female?and?male?legs.?By?prokaryotic?recombinant?expression?and?affinity?chromatography，?DabiCSP8?was?expressed?and?purified?with?the?expected?size?of?13.64?kD.?Binding?assays?showed?that?DabiCSP8?could?strongly?bind?to?Nphenyl1naphthylamine?（1NPN）?with?a?binding?constant?（K1NPN）?of?（1.61±0.02）μmol/L.?Among?the?100?tested?compounds，?βionone?was?the?best?ligand?for?DabiCSP8?with?a?dissociation?constant?（Kd）?of?（11.43±0.62）μmol/L.?In?the?binding?cavity?of?DabiCSP8，?the?polar?amino?acid?residue?arginine?46?（Arg46）?was?able?to?form?two?hydrogen?bonds?with?βionone，?suggesting?the?importance?of?Arg46?in?the?binding?of?DabiCSP8?to?βionone.?In?addition，?DaciCSP8?exhibited?moderate?binding?affinities?to?some?insecticides.

Key?words

Dioryctria?abietella;?chemosensory?protein;?binding?assay;?βionone;?molecular?docking

梢斑螟屬Dioryctria害蟲多以幼蟲鉆蛀針葉樹球果和嫩梢為害，造成枝梢枯死和種子減產(chǎn)，嚴(yán)重影響林木的生長和木材質(zhì)量。近年來，該屬害蟲呈擴散和為害加重的趨勢，已由一般害蟲逐步上升為松科重要害蟲，在局部地區(qū)造成巨大損失。目前，國內(nèi)梢斑螟類害蟲的防治主要以化學(xué)防治和營林技術(shù)為主，生物防治和物理防治為輔。由于梢斑螟屬害蟲個體小、鉆蛀性強、生活隱蔽、成蟲飛翔能力強以及松樹植株樹勢高等特點，導(dǎo)致此類害蟲的防治難度較大［12］。針對蛾類昆蟲的生理和行為特點，研發(fā)基于嗅覺的行為調(diào)控劑是監(jiān)測和防治梢斑螟屬害蟲的一種重要策略［34］。

化學(xué)感受蛋白（chemosensory?proteins，?CSPs）是一類在昆蟲嗅覺感受過程中起重要作用的蛋白，在雌雄蟲觸角、足、跗節(jié)、胸、腹、翅和雌蟲性腺等多個組織中均有表達，暗示昆蟲CSPs具有多種功能［5］。在梨小食心蟲Grapholita?molesta中，成蟲觸角和翅中高表達的GmolCSP8與1己醇具有較強的結(jié)合能力［6］。類似地，CSPs參與嗅覺感受在其他鱗翅目昆蟲中也有報道，如黏蟲Mythimna?separata的MsepCSP8和MsepCSP14［78］、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis?medinalis的CmedCSP33［9］、家蠶Bombyx?mori的BmorCSP1和BmorCSP2［10］。除能夠結(jié)合普通氣味分子外，昆蟲CSP還能通過結(jié)合殺蟲劑來提高害蟲的抗藥能力。岡比亞按蚊Anopheles?gambiae足中高表達的AgamSAP2（sensory?appendage?protein?2）被證實能與擬除蟲菊酯類殺蟲劑結(jié)合，提高蚊子的抗性［11］。在鱗翅目昆蟲中，SlitCSP18能提高斜紋夜蛾Spodoptera?litura對毒死蜱的抗性［12］;用阿維菌素處理家蠶后，多個CSP基因在雌蟲觸角、足、腸道、脂肪體、性腺等組織中的表達水平顯著上調(diào)或下調(diào)［13］。此外，研究發(fā)現(xiàn)鱗翅目昆蟲CSP基因在雌蟲性腺中有表達，很可能參與性信息素的轉(zhuǎn)運和釋放。然而，目前對雌蟲性腺中高表達CSPs的功能研究仍較少。甘藍夜蛾Mamestra?brassicae雌蟲性腺中高表達的MbraCSPA和MbraCSPB能夠與性信息素組分順11十六碳烯乙酸酯和順11十八碳烯乙酸酯結(jié)合，并將其釋放到環(huán)境中［14］。

冷杉梢斑螟Dioryctria?abietella是一種為害松科植物球果和嫩梢的鉆蛀性害蟲;與梢斑螟屬其他昆蟲類似，防治該種害蟲的各種方法不易實施［12］。先前，冷杉梢斑螟的性信息素組分已被鑒定，分別為順9，反11十四碳二烯乙酸酯（Z9，E11tetradecadienyl?acetate，?Z9，E1114：OAc）和（Z3，Z6，Z9，Z12，Z15）pentacosapentaene［1516］?；谛孕畔⑺睾图闹髦参飺]發(fā)物在冷杉梢斑螟生理和行為中的重要性，采用以性信息素或植物揮發(fā)物為誘芯或驅(qū)避劑的方法可以很好地監(jiān)測和控制害蟲種群，提高防治效果和降低防治成本。然而，冷杉梢斑螟雌雄蟲間、其與寄主或非寄主植物間互作的分子機制研究仍較少。本研究以冷杉梢斑螟為對象，采用分子生物學(xué)、結(jié)合測定和分子對接等技術(shù)研究了雌蟲性腺和雌雄成蟲足中高表達DabiCSP8的功能，初步明確了與冷杉梢斑螟DabiCSP8結(jié)合能力較強的配基，旨在為后續(xù)該種害蟲引誘劑或驅(qū)避劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?昆蟲和組織收集

冷杉梢斑螟幼蟲和蛹采自云南省楚雄市紫溪山風(fēng)景區(qū)（101°22′E，25°00′N）。將被冷杉梢斑螟為害的華山松球果帶回實驗室，用尼龍網(wǎng)套住。在成蟲羽化當(dāng)天將其全部移出，根據(jù)腹部外生殖器特征鑒別雌雄成蟲，并將其分別放入不同的飼養(yǎng)籠中，飼以10%的蜂蜜水。飼養(yǎng)溫度為（25±1）℃，相對濕度為（60±5）%，光周期為L∥D=12?h∥12?h。

為了研究冷杉梢斑螟DabiCSP8基因的表達譜，分別收集3日齡雌雄成蟲觸角（30頭）、喙（50頭）、頭（不含觸角和喙，10頭）、胸（4頭）、腹（雌蟲不含性腺、雄蟲不含味刷，4頭）、足（20頭）、翅（30頭）、雄蟲味刷（30頭）和雌蟲性腺（含產(chǎn)卵器，30頭），每個組織收集3套生物學(xué)模板，液氮速凍后保存于-80℃用于RNA的提取。

1.2?總RNA提取和cDNA的合成

采用TRIzol試劑（TaKaRa，?大連，?中國）提取各組織總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和NanoPhotometer分光光度計（IMPLEN，?美國）檢測RNA質(zhì)量和濃度后，采用PrimeScriptTM?RT?Reagent?Kit?with?gDNA?Eraser（TaKaRa，?大連，?中國）合成cDNA。其中，RNA樣品中的基因組DNA用試劑盒中的gDNA?Eraser去除，反應(yīng)程序為：42℃孵育2?min。cDNA儲存于-20℃。

1.3?DabiCSP8基因的表達譜分析

根據(jù)已發(fā)表的DabiCSP8基因的核苷酸序列［17］設(shè)計特異引物（上游引物：5′TGGAGAGGACACATAACAG3′;下游引物：5′GCCTTCAGGGTCATACTT3′）。采用實時熒光定量PCR研究DabiCSP8基因在不同組織中的相對表達量。反應(yīng)體系為20?μL，包括Bestar?SybrGreen?qPCR?Mastermix（DBI?Bioscience，?德國）10?μL，cDNA?2?μL，10?μmol/L上、下游引物各0.5?μL，?ddH2O?7?μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性2?min;95℃變性10?s，58℃退火31?s，72℃延伸30?s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后采集循環(huán)閾值（cycle?threshold，?Ct）。利用QGene法計算DabiCSP8基因在不同組織的相對表達量［1819］。以冷杉梢斑螟核糖體蛋白S4（ribosomal?protein?S4，?DabiRPS4）和L8（DabiRPL8）作為內(nèi)參基因［17］。定量分析中每個組織采用3套生物學(xué)模板，每套模板3次重復(fù)。

采用IBM?SPSS?Statistics?21.0（SPSS?Inc.，?美國）軟件中的Fisher最小顯著差異檢驗（Fishers?least?significant?difference?test，?LSD）比較基因在不同組織間的表達水平。當(dāng)P?

1.4?DabiCSP8表達載體的構(gòu)建

基于DabiCSP8基因的開放閱讀框，首先利用SignalP?4.1預(yù)測DabiCSP8的信號肽序列［20］。其次，根據(jù)預(yù)測結(jié)果移除DabiCSP8的N端前18個氨基酸的信號肽序列，設(shè)計基因特異性引物，并在引物5′端加入酶切位點和保護堿基（上游引物：5′CGGGATCCCTCCCTAAGGAGTACTACACAGACA3′;下游引物：5′CCCAAGCTTTTAGGAGCTACCGGTGAAGAGT3′，其中下劃線分別為上游引物BamHⅠ和下游引物Hind?Ⅲ的酶切位點）。第三，以雌蟲性腺cDNA為模板，采用高保真酶PrimeSTAR?Max?DNA聚合酶（TaKaRa，?大連，?中國）擴增DabiCSP8基因，程序為：98℃預(yù)變性2?min;98℃變性10?s，60℃退火10?s，72℃延伸50?s，35個循環(huán);?72℃延伸10?min。最后，采用HiPure?Gel?Pure?DNA?Mini?Kit（Magen，?廣州，?中國）純化目的基因的PCR產(chǎn)物。

分別用BamH?Ⅰ和Hind?Ⅲ酶切純化的PCR產(chǎn)物和原核表達載體pET30a?（+），在16℃，用T4?DNA連接酶連接30?min構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a?（+）/DabiCSP8，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，LB固體平板培養(yǎng)基涂板，挑取單克隆進行測序驗證。

1.5?DabiCSP8的表達和純化

將測序驗證正確的重組質(zhì)粒pET30a?（+）/DabiCSP8轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。挑取單克隆至LB液體培養(yǎng)基（Kan+，?50?μg/mL）中，37℃，200?r/min振蕩培養(yǎng)過夜;將活化的菌液按1∶50的比例接入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)（1?L），當(dāng)OD600?≈?0.6時，加入終濃度為1?mmol/L異丙基βD硫代半乳糖苷（isopropyβDthiogalactoside，?IPTG）繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6～7?h。取1?mL誘導(dǎo)菌液，采用全自動樣品快速研磨儀進行機械破碎，破碎3次，每次5?min，破碎結(jié)束后離心取上清和沉淀，用SDSPAGE電泳檢測目的蛋白的可溶性表達情況，剩余誘導(dǎo)菌液用于目的蛋白的純化。

根據(jù)電泳檢測結(jié)果，DabiCSP8主要以包涵體的形式表達，因此采用蛋白變性和復(fù)性的方法純化蛋白。首先，根據(jù)Ni?Sepharose?High?Performance（GE?Healthcare）說明書，采用親和層析技術(shù)純化重組蛋白。其次，利用尿素濃度梯度遞減的緩沖液（6、4、3、2、1、0?mol/L）進行透析復(fù)性。而后，采用腸激酶切除重組蛋白的His標(biāo)簽，再次利用親和層析技術(shù)純化目的蛋白。最后，目的蛋白經(jīng)透析除鹽，濃縮至合適濃度后存于-80℃。

1.6?DabiCSP8與不同化合物的結(jié)合測定

用于結(jié)合測定的熒光探針N苯基1萘胺（Nphenyl1naphthylamine，?1NPN）、植物源揮發(fā)物、性信息素和殺蟲劑購自Aladdin或SigmaAldrich公司，為分析標(biāo)準(zhǔn)品或純度大于90%。所有化合物均用色譜級甲醇溶解，配成100?mmol/L的儲存液，保存于-20℃，待使用時稀釋至1?mmol/L。

為了確定1NPN是否能夠用于DabiCSP8的熒光競爭性結(jié)合測定，在比色皿中加入20?mmol/L的TrisHCl緩沖液（pH?7.4）和終濃度為2?μmol/L的1NPN，檢測發(fā)射波長460?nm附近的熒光峰值。然后，加入終濃度為2?μmol/L純化的DabiCSP8，觀察熒光峰值的變化情況。如果熒光峰發(fā)生藍移，且熒光強度成倍增加，說明1NPN能夠與DabiCSP8結(jié)合。在結(jié)合測定中，首先測定DabiCSP8與1NPN的結(jié)合情況，即在20?mmol/L的TrisHCl緩沖液（pH?7.4）和終濃度為2?μmol/L的目的蛋白混合液中分別加入不同終濃度的1NPN（2、4、5、8、12、16?μmol/L）。如果1NPN與目的蛋白的結(jié)合具有飽和效應(yīng)，則可用于后續(xù)的熒光競爭性結(jié)合試驗。參數(shù)設(shè)定：激發(fā)光波長Ex=337?nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為3?nm和5?nm，發(fā)射光波長?Em=350～500?nm。

在競爭性結(jié)合測定中，將20?mmol/L的TrisHCl緩沖液（pH?7.4），終濃度分別為2?μmol/L?DabiCSP8和1NPN加入比色皿中混合均勻。然后，分別加入不同濃度的供試化合物使其終濃度為2、4、5、8、12、16、20?μmol/L，記錄發(fā)射波長在398?nm處的熒光峰值變化。在化合物終濃度為20?μmol/L?時，對于熒光取代率［熒光取代率=（1-熒光下降值/起始熒光值）×100%］在45%以上的化合物，試驗重復(fù)3次。DabiCSP8與1NPN的結(jié)合常數(shù)（binding?constant，?K1NPN）采用GraphPad?Prism?7.0進行計算。然后，根據(jù)IC50（替換50%的1NPN時競爭化合物的濃度）計算DabiCSP8與化合物的解離常數(shù)（dissociation?constant，?Kd）。Kd=IC50/（1+［1NPN］/K1NPN），其中［1NPN］為游離的1NPN濃度［21］。

1.7?DabiCSP8的同源模擬和分子對接

DabiCSP8的三級結(jié)構(gòu)建模采用SWISSMODEL在線軟件（https：∥swissmodel.expasy.org/）完成。首先，用去除信號肽的DabiCSP8氨基酸序列搜索同源建模的晶體模板，發(fā)現(xiàn)其與沙漠蝗Schistocerca?gregaria的SgreCSP4序列具有較高的氨基酸一致性。然后，以SgreCSP4的晶體結(jié)構(gòu)作為模板（PDB?ID：2GVS）［22］，構(gòu)建DabiCSP8的三級結(jié)構(gòu)。采用AutoDock?Vina?1.1.2軟件進行DabiCSP8與化合物的分子對接［23］。三級結(jié)構(gòu)的可視化和編輯采用PyMOL?1.7.2.1軟件完成（https：∥pymol.org/2/）。

2?結(jié)果與分析

2.1?DabiCSP8基因的組織表達譜分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的FPKM（fragments?per?kilobase?of?transcript?sequence?per?millions?base?pairs?sequenced）值和化感基因半定量的結(jié)果，DabiCSP8基因在雌蟲性腺中表達量最高，其次是雌蟲足，2個組織間FPKM值相差5.65倍［17］。本研究中定量分析表明，DabiCSP8基因在雌蟲性腺中顯著高表達，表達量分別是雄蟲足、雌蟲足、雄蟲喙、雄蟲味刷和雌蟲喙的5.77、6.14、54.30、61.50倍和83.94倍。與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致。此外，該基因在雌雄蟲觸角和其他組織中也有微弱表達，且在雌蟲觸角的表達量顯著高于雄蟲，但雌、雄蟲觸角表達量分別僅為雌蟲性腺的1/1?250和3/10?000。在雌雄蟲足、喙、頭、胸或腹間，DabiCSP8基因的表達水平無顯著差異;而在雄蟲翅中的表達量顯著高于雌蟲（圖1）。

2.2?DabiCSP8的表達和純化

SDSPAGE分析結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組蛋白pET30a?（+）/DabiCSP8在約20?kD處具有一條明顯加粗的條帶，與預(yù)測的分子量大?。?9.64?kD）一致。對IPTG誘導(dǎo)后的菌液機械破碎后發(fā)現(xiàn)DabiCSP8主要以包涵體的形式表達。對重組蛋白進行純化和切除His標(biāo)簽后，得到13.64?kD的單一目的蛋白條帶（圖2）。

2.3?DabiCSP8與不同化合物的結(jié)合特性

1NPN能夠很好地與DabiCSP8結(jié)合，結(jié)合常數(shù)K1NPN為（1.61±0.02）μmol/L（圖3a）。隨著1NPN濃度的增加，DabiCSP8與其結(jié)合接近飽和，采用Scatchard線性化后發(fā)現(xiàn)DabiCSP8蛋白與1NPN的結(jié)合具有較好的線性關(guān)系（圖3a，3b）。

競爭性結(jié)合測定結(jié)果表明，DabiCSP8與大部分化合物的結(jié)合能力較低。在測試的100種化合物中，β紫羅蘭酮是DabiCSP8的最佳配基，解離常數(shù)Kd為（11.43±0.62）μmol/L;而其他化合物的熒光取代率均在50%以下（圖3c，表1）。在測試的7類化合物中，酯類化合物中2，4癸二烯酸乙酯與DabiCSP8結(jié)合能力最強，熒光取代率為30.61%;醇類化合物中3甲基2丁烯1醇和庚醇的熒光取代率分別為38.53%和32.30%;醛類化合物中丁香醛和十二醛的熒光取代率在30%以上;而烯烴類和烷烴類化合物與DabiCSP8結(jié)合能力均較弱（熒光取代率小于30%）;此外，DabiCSP8與殺蟲劑辛硫磷和毒死蜱的結(jié)合能力較強，熒光取代率分別為47.74%和37.87%（圖3d，表1）。

2.4?DabiCSP8與β紫羅蘭酮互作的關(guān)鍵位點預(yù)測

同源搜索結(jié)果表明，冷杉梢斑螟DabiCSP8與沙漠蝗的SgreCSP4的氨基酸一致性最高，為47.71%。DabiCSP8的二級結(jié)構(gòu)主要由6個α螺旋組成：α1（位點15-20）、α2（位點22-33）、α3（位點40-54）、α4（位點62-78）、α5（位點80-90）和α6（位點97-103），其中兩個CSP間α1高度保守，除絲氨酸（S）外，其余氨基酸完全一致;α2、α5和α6的一致性也較高，分別為50.00%、63.64%和60.00%;剩余的兩個α螺旋一致性在50%以下，其中α4的一致性僅為35.29%（圖4a）。

根據(jù)結(jié)合測定結(jié)果，選取與DabiCSP8結(jié)合能力最好的配基β紫羅蘭酮進行分子對接，鑒定與該化合物結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。結(jié)果表明，DabiCSP8結(jié)合腔4?內(nèi)有9個氨基酸與β紫羅蘭酮結(jié)合，包括8個非極性氨基酸：異亮氨酸29（Ile29）、色氨酸45（Trp45）、Ile49、Ile72、甲硫氨酸75（Met75）、Trp83、Ile86和Trp90;1個極性氨基酸：精氨酸46（Arg46）。其中，β紫羅蘭酮的氧（O）能夠與Arg46形成兩個氫鍵，氫鍵距離分別為3.08和3.15（圖4b）。

3?結(jié)論與討論

冷杉梢斑螟是松屬植物上一種重要的鉆蛀性害蟲，雌蟲常將卵產(chǎn)于寄主植物球果鱗片上或嫩梢處，卵孵化成幼蟲后鉆蛀球果，對種子和木材質(zhì)量造成較大影響［2，?24］。在鱗翅目昆蟲的成蟲中，雌蟲的性腺和雌雄蟲的跗節(jié)是感受和識別各種化合物的重要器官，其表達的化學(xué)感受相關(guān)蛋白（如CSP）在蛾類的生存和繁衍中具有重要作用［5，?25］?；谝谚b定的冷杉梢斑螟CSP基因及其表達譜結(jié)果［17］，本研究選取在雌蟲性腺和雌雄成蟲足中高表達的DabiCSP8基因，研究了它與100種化合物的結(jié)合特性，探討了DabiCSP8與最佳結(jié)合配基β紫羅蘭酮的結(jié)合機制。研究結(jié)果明確了DabiCSP8的氣味結(jié)合譜，可為后續(xù)冷杉梢斑螟行為調(diào)控劑的研究提供借鑒。

在定量分析中，DabiCSP8基因的定量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序得到的FPKM值結(jié)果一致，即該基因在雌蟲性腺中顯著高表達，是性腺中具有最高FPKM值的CSP基因，其中雌蟲性腺與雌蟲足、雌蟲性腺與雌蟲觸角間的表達量差異倍數(shù)與已發(fā)表結(jié)果基本一致［17］。Xing等［26］對冷杉梢斑螟雌蟲性腺進行了轉(zhuǎn)錄組測序，但是僅鑒定到1個CSP基因（DabiCSP1），未發(fā)現(xiàn)本研究中的DabiCSP8基因。綜合已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組測序和半定量結(jié)果［17］以及本研究中定量PCR結(jié)果，認為DabiCSP8基因在雌蟲性腺中有表達。而Xing等［26］的雌蟲性腺轉(zhuǎn)錄組未鑒定到該基因很可能是由于組裝錯誤或者鑒定遺漏導(dǎo)致。為了驗證以上猜測，我們用DabiCSP8基因的核苷酸序列作為靶標(biāo)，采用MEGA?BLAST同源搜索的方法在NCBI?SRA（national?center?for?biotechnology?information?sequence?read?archive）序列數(shù)據(jù)庫搜索冷杉梢斑螟的雌蟲性腺轉(zhuǎn)錄組（登錄號：SRX4329669）［26］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該轉(zhuǎn)錄組中有DabiCSP8基因的核苷酸序列，證實了該性腺轉(zhuǎn)錄組中DabiCSP8基因組裝錯誤或者鑒定遺漏的假設(shè)。

蛾類雌蟲的性腺是產(chǎn)生性信息素的重要器官，研究發(fā)現(xiàn)雌蟲性腺中的CSP蛋白可能參與性信息素的轉(zhuǎn)運和釋放，是雌蟲性腺中一類重要的運載蛋白［3，?14］。本研究中DabiCSP8與雌蟲性信息素組分Z9，E1114：OAc的結(jié)合能力很弱（在20?μmol/L時的熒光取代率為11.70%），說明DabiCSP8可能結(jié)合其他性信息素，如（Z3，Z6，Z9，Z12，Z15）pentacosapentaene［16］。DabiCSP8與多種殺蟲劑的結(jié)合測定顯示，辛硫磷和毒死蜱與該蛋白的親和力最高。在禾谷縊管蚜Rhopalosiphum?padi中，RpadCSP5和RpadCSP10基因的沉默導(dǎo)致了吡蟲啉處理的蚜蟲死亡率顯著增加;RpadCSP4和RpadCSP6基因的沉默則同時引起吡蟲啉和高效氯氰菊酯處理的蚜蟲死亡率顯著增加［27］。棉蚜Aphis?gossypii的AgosCSP5?［28］、中華蜜蜂Apis?cerana的AcerCSP1?［29］和小菜蛾P(guān)lutella?xyllostella的PxylCSP8?［30］基因與其對吡蟲啉的抗性有關(guān)。除吡蟲啉外，其他有機磷類殺蟲劑也與化學(xué)感受相關(guān)蛋白具有較強的結(jié)合能力，如二點委夜蛾Athetis?lepigone的AlepGOBP2、AlepPBP2和AlepPBP3與毒死蜱和辛硫磷［3132］。而岡比亞按蚊足中高表達的一個CSP基因（AgamSAP2）被證實與其對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性有關(guān)［11］。根據(jù)DabiCSP8基因在足中高表達，并且其與有機磷類殺蟲劑的結(jié)合能力較強，推測冷杉梢斑螟可能通過足高表達DabiCSP8降低害蟲對殺蟲劑的敏感性。

在測定的化合物中，β紫羅蘭酮是DabiCSP8的最佳配基，說明該種化合物可能在冷杉梢斑螟的行為調(diào)控中起作用。β紫羅蘭酮是植物花分泌的重要揮發(fā)性成分，中華蜜蜂的AcerCSP3與該化合物具有強結(jié)合能力，說明其可能在蜜蜂尋找蜜源的過程中發(fā)揮重要作用［3334］。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測到云南松及其近緣種中含有β紫羅蘭酮［35］。鑒于本研究在收集雌蟲性腺時也包含了產(chǎn)卵器，加之雌蟲產(chǎn)卵器上具有嗅覺感受器及化學(xué)感受相關(guān)的基因［3637］，冷杉梢斑螟雌蟲產(chǎn)卵器中是否存在DabiCSP8基因以及其在感受β紫羅蘭酮中的作用值得深入研究。

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