余永婷 李水根 方獻(xiàn)平 張昊 安海山 張學(xué)英 張麗勍

摘要

果生炭疽菌Colletotrichum?fructicola侵染引起的草莓炭疽病是草莓生產(chǎn)中的重要病害。前期研究發(fā)現(xiàn)一個在果生炭疽菌侵染階段高表達(dá)的含LysM結(jié)構(gòu)域的候選效應(yīng)子CfLysM2。為進(jìn)一步研究CfLysM2的致病功能，運(yùn)用同源重組方法構(gòu)建CfLysM2缺失突變株ΔCfLysM2和回補(bǔ)菌株CfLysM2c。致病力測定結(jié)果表明，接種后15?d，ΔCfLysM2接種的草莓葉片病情指數(shù)顯著下降。熒光定量PCR分析表明CfLysM2基因在果生炭疽菌接種草莓葉片后24?h相對表達(dá)量最高。利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對野生型菌株（wildtype?strain，?WT）和ΔCfLysM2接種后24?h的草莓葉片樣品進(jìn)行比較分析，獲得差異表達(dá)基因109個。CfLysM2的缺失導(dǎo)致宿主代謝途徑尤其是次生代謝物生物合成通路的激活，說明CfLysM2可能在果生炭疽菌侵染草莓過程中通過靶向黃酮醇合成酶等代謝相關(guān)基因，抑制植物次生代謝產(chǎn)物合成及其介導(dǎo)的抗真菌免疫，保證其順利侵染。該研究為揭示CfLysM2機(jī)理及對果生炭疽菌和草莓互作研究奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

果生炭疽菌;?LysM?結(jié)構(gòu)域;?致病性;?轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號：

S?436.68

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022074

Functional?analysis?of?the?LysM?effector?CfLysM2?in?the?pathogenicity?of?Colletotrichum?fructicola?on?strawberry

YU?Yongting1，?LI?Shuigen1，?FANG?Xianping1，?ZHANG?Hao2，?AN?Haishan1，

ZHANG?Xueying1*，?ZHANG?Liqing1*

（1.?Forest?&?Fruit?Tree?Research?Institute，?Shanghai?Academy?of?Agriculture?Sciences，?Shanghai?Key?Laboratory

of?Protected?Horticultural?Technology，?Shanghai?201403，?China;?2.?Institute?of?Plant?Protection，

Chinese?Academy?of?Agriculture?Sciences，?Beijing?100193，?China）

Abstract

Strawberry?anthracnose?caused?by?Colletotrichum?fructicola?is?an?important?disease?in?strawberry?production.?A?candidate?effector?CfLysM2?containing?LysM?domain?highly?expressed?during?the?infection?of?Colletotrichum?fructicola?was?identified?in?the?previous?study.?To?further?study?the?pathogenic?function?of?CfLysM2，?a?CfLysM2?deletion?mutant?ΔCfLysM2?and?a?complementary?strain?CfLysM2c?were?constructed?by?homologous?recombination.?The?results?of?pathogenicity?assay?showed?that?the?disease?index?decreased?significantly?15?days?post?inoculation?with?the?mutant?strain.?Realtime?quantitative?PCR?analysis?showed?that?the?relative?expression?of?CfLysM2?was?the?highest?24?h?post?infection?by?C.fructicola?in?strawberry?leaves.?The?transcriptome?technology?was?used?to?compare?and?analyze?strawberry?leaf?samples?24?h?after?inoculation?of?wildtype?strain?and?mutant?strain?ΔCfLysM2，?respectively.?The?results?showed?that?there?were?109?differentially?expressed?genes.?Knockout?of?CfLysM2?led?to?the?activation?of?host?metabolic?pathways，?especially?the?biosynthetic?pathway?of?secondary?metabolites，?indicating?that?CfLysM2?might?inhibit?the?synthesis?of?plant?secondary?metabolites

and?metabolitemediated?antifungal?immunity?to?ensure?its?successful?infection?by?targeting?metabolismrelated?genes?such?as?flavonol?synthase?during?infection.??This?study?lays?a?theoretical?foundation?for?revealing?the?functional?mechanism?of?CfLysM2?and?for?the?study?of?the?interaction?between?C.fructicola?and?strawberry.

Key?words

Colletotrichum?fructicola;?LysM?domain;?pathogenicity;?transcriptome

草莓Fragaria×ananassa?Duch.屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)的優(yōu)秀果品之一［1］。然而，草莓病害一直制約草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，草莓炭疽病在我國乃至世界各地的草莓主產(chǎn)區(qū)一直是制約草莓產(chǎn)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的主要瓶頸。草莓炭疽病指由炭疽菌屬Colletotrichum?spp.真菌引起的草莓病害。在我國草莓生產(chǎn)中，炭疽病危害嚴(yán)重的年份直接導(dǎo)致草莓減產(chǎn)50%～80%，甚至絕產(chǎn)［2］。團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明果生炭疽菌?Colletotrichum?fructicola為華東地區(qū)草莓炭疽病菌的優(yōu)勢種［3］。

細(xì)胞溶解酶基序（lysin?motif，?LysM）最初在芽胞桿菌噬菌體的溶菌酶中發(fā)現(xiàn)［4］。LysM結(jié)構(gòu)域存在于原核生物和真核生物的蛋白質(zhì)中［5］，由大約?40個氨基酸殘基組成［6］。在真核生物的?LysM?結(jié)構(gòu)域中存在多個半胱氨酸殘基和二硫鍵，以維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［7］。迄今為止，已在真菌中鑒定出783種含LysM的蛋白［8］。

效應(yīng)子是病原菌分泌的，通過干擾寄主植物細(xì)胞的活動來促進(jìn)病原菌成功侵染和定殖的一類外泌型蛋白分子［9］。含有LysM結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子被稱為LysM效應(yīng)子。幾丁質(zhì)?（chitin）?是真菌細(xì)胞壁的重要組分之一，病原真菌在侵染寄主植物過程中釋放的幾丁質(zhì)寡糖是重要的病原相關(guān)分子模式（pathogenassociated?molecular?patterns），能夠被寄主植物細(xì)胞膜表面的受體識別并激發(fā)寄主植物的先天免疫反應(yīng)。病原真菌則分泌LysM效應(yīng)子，通過競爭性結(jié)合游離幾丁質(zhì)寡糖，阻斷其與寄主植物受體結(jié)合等手段，抑制幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的寄主植物免疫反應(yīng)［1011］。該機(jī)制在番茄葉霉Cladosporium?fulvum中已經(jīng)得到了充分的研究：番茄葉霉在侵染過程中分泌具有無脊椎動物幾丁質(zhì)結(jié)合域?（CBM14）?的效應(yīng)子?Avr4，結(jié)合番茄葉霉自身細(xì)胞壁幾丁質(zhì)，從而保護(hù)菌絲免受番茄幾丁質(zhì)酶的水解［12］。此外，番茄葉霉分泌的效應(yīng)子Ecp6含有3個?LysM結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合幾丁質(zhì)抑制其誘導(dǎo)的植物免疫。Ecp6?的晶體結(jié)構(gòu)顯示其3個?LysM?結(jié)構(gòu)域中的2個通過底物誘導(dǎo)的內(nèi)鏈二聚化（intrachain?dimerization）建立了具有超高幾丁質(zhì)結(jié)合親和力的凹槽，使?Ecp6?能夠與植物受體競爭結(jié)合幾丁質(zhì)［13］。此外，LysM?效應(yīng)子也被證明是病原真菌致病過程中的關(guān)鍵因素。不同真菌中LysM效應(yīng)子的功能也不盡相同。小麥殼針孢葉枯菌?Mycosphaerella?graminicola?LysM效應(yīng)子在病原菌的定殖過程中發(fā)揮作用［14］。希金斯炭疽菌Colletotrichum?higginsianum?LysM效應(yīng)子ChELP1和ChELP2能夠控制附著胞的形成［15］。大麗輪枝菌Verticillium?dahliae?VdLs17菌株中的LysM?效應(yīng)子基因VDAG_05180的缺失能夠?qū)е戮陮Ψ训闹虏×︼@著下降［16］。

目前對果生炭疽菌致病相關(guān)基因已有研究，但其致病機(jī)理仍不清楚，尚未見果生炭疽菌LysM效應(yīng)子的相關(guān)報(bào)道。研究組在前期工作的基礎(chǔ)上篩選獲得一個在果生炭疽菌侵染階段高表達(dá)的候選效應(yīng)子CfLysM2［17］。本研究擬以CfLysM2基因?yàn)檠芯繉ο?，通過構(gòu)建CfLysM2缺失突變菌株（ΔCfLysM2），比較分析了野生型菌株（wildtype?strain，?WT）和ΔCfLysM2侵染的草莓葉片的轉(zhuǎn)錄組，觀察二者侵染后草莓葉片在代謝途徑和防御反應(yīng)上的差異，旨在揭示果生炭疽菌侵染宿主過程中，CfLysM2通過何種途徑影響果生炭疽菌草莓互作，進(jìn)一步影響果生炭疽菌致病性的機(jī)制。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

果生炭疽菌Colletotrichum?fructicola?野生型菌株SH01由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所保存。構(gòu)建敲除載體和回補(bǔ)載體的pKHKO和pKN質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所張昊副研究員惠贈。植物材料為草莓栽培品種‘紅顏。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯?200?g，葡萄糖?20?g，瓊脂粉?20?g，定容到?1?L。CMC?培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉15?g，磷酸二氫鉀?1?g，七水合硫酸鎂?0.5?g，硝酸銨?1?g，酵母提取物?1?g，加蒸餾水到?1?L。TB3?培養(yǎng)基：酵母提取物?3?g，酪氨酸水解蛋白?3?g，蔗糖?200?g，加蒸餾水到?1?L。以上培養(yǎng)基均經(jīng)高壓滅菌，室溫保存。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?CfLysM2基因序列分析

利用SMART（http：∥smart.emblheidelberg.de/）在線生物信息學(xué)工具對CfLysM2效應(yīng)子的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。通過UNIPROT（https：∥www.uniprot.org/）在線網(wǎng)站中的BLAST工具獲得其他病原真菌的LysM效應(yīng)子的氨基酸序列。利用MEGA?7.0.26軟件中的鄰接法（neighborjoining?method，?NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2?CfLysM2基因的敲除與回補(bǔ)

利用E.Z.N.A.Fungal?DNA?Kit（Omega，美國）提取果生炭疽菌基因組DNA。以果生炭疽菌菌株的?DNA?為模板采用上游序列擴(kuò)增引物（L2UF/L2UR），下游序列擴(kuò)增引物（L2DF/L2DR），分別擴(kuò)增出900?bp?的上游片段和?900?bp?的下游片段。引物序列見表1。在?USER?酶的作用下，將上游片段連接到敲除載體?pKHKO?的?BamH?Ⅰ/EcoR?Ⅰ位點(diǎn)上，下游片段連接到?pKHKO?質(zhì)粒的?Xho?Ⅰ/Kpn?Ⅰ位點(diǎn)上。從而得到CfLysM2基因的敲除載體。將敲除載體用內(nèi)切酶線性化，轉(zhuǎn)化至果生炭疽菌野生型菌株的原生質(zhì)體中。原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化參照Desmond等［18］的方法。轉(zhuǎn)化子在潮霉素濃度為100?μg/mL?的PDA培養(yǎng)基上篩選。提取抗性轉(zhuǎn)化子基因組DNA，分別用引物?CfL2OF/CfL2OR檢測目的基因CfLysM2;引物?H850/H852檢測替代CfLysM2基因的潮霉素基因（Hph）?;引物CfL2TF/H850檢測重組左臂;引物?H852/CfL2TR檢測重組右臂。

分析CfLysM2?基因序列，設(shè)計(jì)引物CfL2F/CfL2R（表1），以野生型菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR?擴(kuò)增，獲得帶有?KpnⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)的3?309?bp的片段，其中510?bp為CfLysM2基因的ORF序列。

PCR?產(chǎn)物純化后用KpnⅠ/BamHⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物連接到同樣經(jīng)KpnⅠ/BamHⅠ?雙酶切的pKN?中，獲得CfLysM2的回補(bǔ)載體。將回補(bǔ)載體用內(nèi)切酶線性化后轉(zhuǎn)化到由CfLysM2?敲除突變體制備的原生質(zhì)體中，利用G418抗性PDA培養(yǎng)基篩選，以抗性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板，用引物?CfL2OF/CfL2OR進(jìn)行?PCR?驗(yàn)證，能擴(kuò)增出CfLysM2完整ORF的抗性轉(zhuǎn)化子為回補(bǔ)菌株CfLysM2c。

1.2.3?果生炭疽菌對草莓的致病性測定

參照柯智健等［19］的方法配制孢子懸浮液，將濃度為106個/mL的果生炭疽菌野生型菌株SH01、突變菌株ΔCfLysM2和回補(bǔ)菌株CfLysM2c的分生孢子懸浮液（含0.05%?tween20）用噴霧器均勻噴灑到草莓植株‘紅顏葉片上，直至霧滴滴下為止，各菌株分別接種10株，3次重復(fù)。以含有0.05%?tween20的無菌水為對照。覆膜黑暗28℃保濕24?h后于光周期L∥D=12h∥12h，相對濕度大于80%的條件下培養(yǎng)。接種后15?d調(diào)查葉片的發(fā)病情況。病情分級參考Wang等［20］（表2）。

病情指數(shù)（DI）=［∑（各級發(fā)病株數(shù)×病級值）／（最高發(fā)病級值×調(diào)查株數(shù)）］×100。

利用Excel?2016和SAS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總、處理和分析，通過單因素方差分析和LSD法比較草莓植株接種野生型菌株、ΔCfLysM2和CfLysM2c后病情指數(shù)的差異，結(jié)果用Excel?2016作圖。

1.2.4?病原菌侵染過程中CfLysM2基因表達(dá)量變化

以果生炭疽菌野生型菌株接種草莓‘紅顏葉片，采集接種后0、6、12、24、48?h和72?h葉片組織，液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆?。利用植物總RNA提取試劑盒（天根，中國）提取葉片總RNA，用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金，中國）反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為熒光定量PCR模板。依據(jù)基因CDS區(qū)序列，利用軟件Primer?5.0設(shè)計(jì)引物CfLysM2F/CfLysM2R（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以果生炭疽菌βactin基因?yàn)閮?nèi)參基因，按照SYBR?Premix?Ex?Taq?Kit?（TaKaRa，中國）說明書進(jìn)行熒光定量PCR，用相對閾值法（2-ΔΔCt）計(jì)算侵染后不同時(shí)期組（6、12、24、48?h和72?h）與對照組（0?h）中CfLysM2基因表達(dá)差異，使用軟件GraphPad?Prism?5分析并作圖。

1.2.5?樣品準(zhǔn)備

用果生炭疽菌野生型菌株及ΔCfLysM2的分生孢子懸浮液（106個/mL）分別接種草莓植株各10株，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。分別采集接種后24?h的草莓葉片，液氮速凍后保存于-80℃，用于轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達(dá)基因的驗(yàn)證。

1.2.6?RNA提取及文庫構(gòu)建和測序

采用TRIzol法（Invitrogen?公司）分別提取1.2.5準(zhǔn)備的草莓葉片樣本總RNA。利用Nanodrop?2000檢測RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Agilent?2100測定RIN值。文庫構(gòu)建及測序工作均委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。使用美吉生物云平臺完成數(shù)據(jù)分析。

1.2.7?轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控及序列比對分析

對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)（clean?data）。使用TopHat2?軟件（http;∥tophat.cbcb.umd.edu/）［21］將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)，即clean?data（reads）與草莓參考基因組（https：∥www.rosaceae.org/species/fragaria_x_ananassa/genome_v1.0.a1）進(jìn)行比對分析，獲得用于后續(xù)分析的mapped?data（reads），同時(shí)對本次測序的比對結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評估。

1.2.8?差異基因篩選

利用軟件RSEM對轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量進(jìn)行分析，定量指標(biāo)為TPM（transcripts?per?million）值，以轉(zhuǎn)錄本的條數(shù)為計(jì)算單位。同組重復(fù)樣本的最終表達(dá)量為所有重復(fù)樣本數(shù)據(jù)的平均值。

使用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq2軟件進(jìn)行分析，以|fold?change|≥2和Padj＜0.05為篩選條件得到差異表達(dá)基因（differentially?expressed?genes，?DEGs）。

1.2.9?功能注釋和富集分析

采用軟件?Goatools（https：∥github.com/tanghaibao/GOatools）［22］對差異基因進(jìn)行GO富集分析，使用Fisher?精確檢驗(yàn)得到P值，采用BH檢驗(yàn)進(jìn)行較正，當(dāng)經(jīng)過校正的?P?值（Padj）＜0.05時(shí)，認(rèn)為此GO功能存在顯著富集情況。

將差異基因與?KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，默認(rèn)當(dāng)P值（P?value_uncorrected）＜0.05時(shí)，?認(rèn)為此KEGG通路存在顯著富集情況。

1.2.10?差異表達(dá)基因的RTqPCR驗(yàn)證

以1.2.5準(zhǔn)備的草莓葉片為材料提取RNA，選取6個差異表達(dá)基因進(jìn)行RTqPCR驗(yàn)證，包括2個顯著差異表達(dá)的次生代謝相關(guān)基因，黃酮醇合成酶基因

（FLS）和過氧化物酶12基因（POX12）。用目的基因ID檢索薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫GDR（https：∥www.rosaceae.org/），獲得目的基因序列。草莓a(chǎn)ctin基因作為內(nèi)參基因。引物設(shè)計(jì)及RTqPCR方法同1.2.4。每份樣品3次生物學(xué)重復(fù)。使用軟件GraphPad?Prism?5分析并作圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?CfLysM2生物信息學(xué)分析

利用SMART網(wǎng)站預(yù)測CfLysM2的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其在N端（第51至95位，122至166位）具有2個典型的LysM結(jié)構(gòu)域（圖1a）。對CfLysM2?的氨基酸序列

及其同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，?LysM2在炭疽菌屬內(nèi)相對保守，與同屬的膠孢炭疽菌C.gloeosporioides?Cg14?LysM2氨基酸序列的一致性為99%，與同屬的楊柳炭疽菌C.salicis、瓜類炭疽菌C.orbiculare、油茶炭疽病菌C.fioriniae、大豆炭疽

2.2?CfLysM2基因的敲除及回補(bǔ)

CfLysM2敲除、回補(bǔ)菌株構(gòu)建策略如圖2a所示，野生型菌株僅能擴(kuò)增出CfLysM2基因，以左右臂和Hph基因引物擴(kuò)增無法獲得目的條帶（圖2b）;將敲除載體線性化后轉(zhuǎn)入以果生炭疽菌野生型菌株制備的原生質(zhì)體中，共獲得40個轉(zhuǎn)化子，其中27號轉(zhuǎn)化子利用引物CfL2OF/CfL2OR不能擴(kuò)增出CfLysM2基因目的條帶，而利用引物CfL2TF/H850、?H852/CfL2TR和H850/H852能夠分別擴(kuò)增出目的條帶（圖2c）。由此確定第27號轉(zhuǎn)化子為敲除突變體，并將其命名為ΔCfLysM2。將回補(bǔ)載體pKNCfLysM2轉(zhuǎn)化到以敲除突變體ΔCfLysM2制得的原生質(zhì)體中，經(jīng)潮霉素培養(yǎng)篩選后，共得到20個轉(zhuǎn)化子。利用CfL2OF/CfL2OR引物對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，其中3號轉(zhuǎn)化子可以擴(kuò)增出CfLysM2的ORF片段510?bp（圖2d），由此證明回補(bǔ)菌株構(gòu)建成功，并將其命名為CfLysM2c。

2.3?CfLysM2基因的缺失影響果生炭疽菌的致病性

將野生型菌株、突變菌株ΔCfLysM2和回補(bǔ)菌株CfLysM2c采用噴霧法分別接種至草莓植株，接種后15?d，ΔCfLysM2的致病力明顯減弱，病情指數(shù)顯著低于野生型菌株和CfLysM2c（P

2.4?CfLysM2基因的表達(dá)分析

采用RTqPCR研究CfLysM2基因在接種后0、6、12、24、48?h和72?h的表達(dá)水平。?結(jié)果（圖4）顯示，CfLysM2基因在接種后24?h表達(dá)量達(dá)到最高，24?h后開始下調(diào)。因此選取野生型菌株和突變菌株ΔCfLysM2接種草莓葉片后24?h的樣本進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序。

2.5?轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

通過RNAseq技術(shù)對果生炭疽菌野生型菌株

和ΔCfLysM2分別接種草莓葉片后24?h的6個樣品（WT1，WT2，WT3和LM21，LM22，?LM23）進(jìn)行分析。各樣品用于組裝的測序數(shù)據(jù)Q30均高于94%。本次轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可滿足后續(xù)組裝分析

的質(zhì)量要求。將序列進(jìn)行拼接和分析，與參考基因組比對，獲得用于后續(xù)表達(dá)量計(jì)算等的?mapped?data（reads）（表3），與6大數(shù)據(jù)庫（NR、

SwissProt、Pfam、EggNOG、GO和KEGG）進(jìn)行比對，獲得基因的注釋信息。

2.6?差異表達(dá)基因的GO分析結(jié)果

比較野生型菌株和ΔCfLysM2侵染草莓葉片轉(zhuǎn)錄本，共篩選出109個差異表達(dá)基因。以接種野生型菌株24?h后的草莓葉片為對照，其中上調(diào)表達(dá)基因的有79個（其中上調(diào)倍數(shù)最多的達(dá)233倍），下調(diào)表達(dá)的基因有30個（其中下調(diào)倍數(shù)最多的達(dá)167倍）。將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類，本研究中野生型菌株和ΔCfLysM2接種草莓葉片后24?h差異表達(dá)基因按GO功能分類歸為3類基因集：生物過程（biological?process）、分子功能（molecular?function）、細(xì)胞組分（cellular?component）（圖5）。在所有類別中，催化活性、代謝過程和結(jié)合3個類別是含有差異表達(dá)基因最多的3類。在各個類別中，生物過程方面主要富集在代謝過程、細(xì)胞過程、定位;細(xì)胞組分方面主要富集在細(xì)胞組分、膜組分;分子功能方面主要富集在催化活性、結(jié)合等功能類別。

2.7?差異表達(dá)基因的KEGG分析結(jié)果

對差異表達(dá)基因進(jìn)行?KEGG功能分類，野生型菌株和ΔCfLysM2分別接種草莓葉片后24?h的差異表達(dá)基因中，共47個差異表達(dá)基因注釋到10個KEGG通路。KEGG總共有3類基因集，分別描述基因參與的代謝（metabolism）、遺傳信息處理（genetic?information?processing）和生物系統(tǒng)（organismal?systems）（圖6）。與野生型菌株相比，ΔCfLysM2侵染草莓葉片后，上調(diào)基因占所有差異表達(dá)基因的87%（41/47），在所有上調(diào)基因中，代謝相關(guān)基因占所有差異表達(dá)基因的93%（38/41），說明果生炭疽菌侵染草莓葉片后，CfLysM2廣泛抑制了宿主的代謝途徑。在所有上調(diào)的代謝基因中，次生代謝途徑中的其他次生代謝物生物合成（biosynthesis?of?other?secondary?metabolites），萜類和聚酮類化合物代謝（metabolism?of?terpenoids?and?polyketides）是包含差異表達(dá)基因最多的兩大類別，占所有上調(diào)基因的54%（22/41）。除此之外，氨基酸代謝（amino?acids?metabolism）和其他氨基酸代謝（metabolism?of?other?amino?acids）中富集的差異表達(dá)基因僅次于次生代謝類別，占所有上調(diào)基因的24%（10/41）。另外，與野生型菌株相比，ΔCfLysM2侵染草莓葉片后，下調(diào)基因僅占所有差異表達(dá)基因的13%（6/47），分別在環(huán)境適應(yīng)、翻譯、輔助因子和維生素代謝、聚糖生物合成和代謝類別中富集，其中，聚糖生物合成和代謝僅富集到下調(diào)基因，說明CfLysM2在果生炭疽菌侵染過程中除了廣泛抑制次生代謝、氨基酸代謝之外，還能一定程度上激活特異性次生代謝通路。

2.8?差異基因熒光定量PCR驗(yàn)證

選取6個差異表達(dá)基因?qū)D(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行RTqPCR驗(yàn)證，包括2個顯著差異表達(dá)的次生代謝

相關(guān)基因FLS和POX12。其他4個基因分別為：β1，3葡聚糖酶基因（βGlu），是一種主要存在于植物

中的水解酶，能催化真菌細(xì)胞壁的重要成分葡聚糖的水解;WRKY70和WRKY53是WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，在植物抗病免疫的茉莉酸和水楊酸信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用;CYP（71B34like）是細(xì)胞色素P450酶超家族成員之一，細(xì)胞色素P450酶廣泛存在于哺乳動物、植物、真菌等中，參與多種代謝途徑，合成的許多次生代謝物能夠保護(hù)植物應(yīng)對各種生物和非生物脅迫。結(jié)果（圖7）顯示，選取的6個差異基因的表達(dá)情況與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，說明轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果可靠。

3?結(jié)論與討論

本研究在前期工作基礎(chǔ)上，研究了果生炭疽菌侵染草莓過程中上調(diào)表達(dá)的候選效應(yīng)子CfLysM2的致病功能。CfLysM2效應(yīng)子具有典型的信號肽序列和2個LysM保守結(jié)構(gòu)域，不含任何跨膜結(jié)構(gòu)域。同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，不同病原菌中的LysM具有一定的同源性，但差異較大。CfLysM2與同屬的膠孢炭疽菌的LysM的一致性最高，為99%，與不同種屬LysM一致性相對較低，僅有60.1%～64.4%。根據(jù)同源重組成功獲得了CfLysM2的突變菌株ΔCfLysM2及回補(bǔ)菌株CfLysM2c。致病性測定結(jié)果表明，ΔCfLysM2的致病力與野生型菌株和回補(bǔ)菌株CfLysM2c相比明顯減弱。RTqPCR檢測結(jié)果顯示，該基因在果生炭疽菌侵染草莓葉片后的24?h相對表達(dá)量最高，推測CfLysM2可能在果生炭疽菌侵染的早期階段發(fā)揮作用。取野生型菌株和ΔCfLysM2接種草莓葉片后24?h的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共篩選出109個差異表達(dá)基因。GO分析顯示，差異基因顯著富集在催化活性、代謝過程和結(jié)合3個類別，其中，次生代謝物生物合成和氨基酸代謝通路中上調(diào)基因顯著富集。

植物次生代謝由初生代謝衍生而來，初生代謝合成碳水化合物、核酸、?蛋白質(zhì)等初生代謝產(chǎn)物。初生代謝產(chǎn)物在特定酶的作用下轉(zhuǎn)化為次生代謝產(chǎn)物，這一過程被稱為次生代謝。次生代謝產(chǎn)物多是分子結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的化合物，如萜類化合物、抗生素、生物堿等［23］。盡管次生代謝產(chǎn)物是植物非必需小分子化合物，但其是植物與環(huán)境中生物和非生物因素長期共存進(jìn)化的結(jié)果。在應(yīng)對環(huán)境脅迫、病原微生物侵染等過程中起重要作用［2425］。本研究中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)KEGG分析結(jié)果顯示，CfLysM2基因敲除后次生代謝物質(zhì)的生物合成、萜類和聚酮類化合物代謝是上調(diào)轉(zhuǎn)錄本最多的兩大類別，說明CfLysM2可能在抑制植物次生代謝生物合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

在所有植物次生代謝產(chǎn)物中，黃酮類化合物是植物抵御外界惡劣環(huán)境、微生物侵害等過程中形成的一大類次生代謝產(chǎn)物，目前已發(fā)現(xiàn)4?000多種黃酮類化合物，分為黃酮醇、黃酮、異黃酮和花色素苷［26］。其中，黃酮醇的生物合成過程中需要苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4羥化酶（C4H）、4香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、查爾酮合成酶（CHs）、黃酮醇合成酶（FLS）等多個酶的共同參與。FLS是黃酮醇生物合成最后一步的關(guān)鍵限速酶［27］。本研究中，轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因中上調(diào)倍數(shù)最高的是黃酮醇合成酶基因（233倍），表現(xiàn)為極其顯著上調(diào)，說明CfLysM2可能通過抑制黃酮醇合成酶活性，抑制次生代謝產(chǎn)物黃酮醇的合成，幫助真菌侵染。

除了次生代謝相關(guān)基因之外，植物過氧化物酶（peroxidase，POX）也被廣泛認(rèn)為在植物應(yīng)對病原侵染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，POX是病原菌侵染寄主植物后誘導(dǎo)的一類病原相關(guān)（pathogenesisrelated，PR）蛋白，除此之外，POX還在激素調(diào)節(jié)、活性氧代謝、細(xì)胞壁形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［28］。本研究鑒定到的差異表達(dá)基因中除了黃酮醇合成酶，還鑒定到POX12基因顯著上調(diào)（191倍），由于POX在細(xì)胞中發(fā)揮多種功能，因此CfLysM2調(diào)控POX的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，對野生型菌株和突變菌株ΔCfLysM2分別侵染后草莓葉片的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CfLysM2的敲除導(dǎo)致宿主代謝途徑，尤其是次生代謝物生物合成通路的激活，說明CfLysM2可能在果生炭疽菌侵染草莓過程中通過靶向黃酮醇合成酶、7甲基黃嘌呤合成酶等基因，抑制植物次級代謝產(chǎn)物合成及其介導(dǎo)的抗真菌免疫，保證其順利侵染。該結(jié)果為揭示CfLysM2機(jī)理及對果生炭疽菌和草莓互作研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）