姜明 譚明琪 王丹 張丹丹 陳捷胤

摘要

大麗輪枝菌Verticillium?dahliae引起的黃萎病是一種傳播迅速且為害廣泛的土傳維管束真菌病害。大麗輪枝菌分泌的水解酶在侵染中發(fā)揮重要作用，尤其是纖維素酶和果膠酶。大麗輪枝菌果膠裂解酶包括PL1、PL3、PL4、PL9和PL11?5個家族，其中PL1家族成員數(shù)目最多，但對該家族的致病功能還未見系統(tǒng)研究。本研究明確大麗輪枝菌PL1家族共包含17個成員，且多數(shù)成員在侵染早期上調(diào)表達，其中VdPL14和VdPL18在侵染早期強烈誘導表達。挑選VdPL14構(gòu)建缺失突變體，發(fā)現(xiàn)VdPL14缺失后菌株對棉花的致病力顯著下降，對復雜碳源（果膠、羧甲基纖維素、淀粉）的利用能力受限，該基因回補后菌株的毒力和碳源利用能力均得以恢復。信號肽介導的分泌活性驗證表明VdPL14為分泌蛋白。以上研究表明，VdPL14是重要毒力因子，研究結(jié)果為后續(xù)系統(tǒng)解析果膠裂解酶在病原致病過程中發(fā)揮的作用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞

大麗輪枝菌;?果膠裂解酶;?PL1家族;?毒力

中圖分類號：

S?423.23

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022105

Functional?analyses?of?pectate?lyase?family?1?gene?VdPL14?in?the?pathogenicity?of?Verticillium?dahliae

JIANG?Ming1#，?TAN?Mingqi1，2#，?WANG?Dan2，?ZHANG?Dandan2，?CHEN?Jieyin2*

（1.?College?of?Life?Sciences?and?Technology，?Mudanjiang?Normal?University，?Mudanjiang?157012，?China;

2.?Institute?of?Plant?Protection，?Chinese?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Beijing?100193，?China）

Abstract

Verticillium?wilt?caused?by?Verticillium?dahliae?is?a?rapidly?spreading?soilborne?vascular?fungal?disease.?Hydrolytic?enzymes，?especially?cellulases?and?pectases?produced?by?V.dahliae，?play?an?important?role?during?infection.?Pectate?lyases?in?V.dahliae?comprise?PL1，?PL3，?PL4，?PL9，?and?PL11?families.?Among?them，?the?PL1?family?has?the?largest?number?of?proteins，?but?there?is?no?systematic?understanding?of?the?pathogenic?function?of?this?family.?This?study?showed?that?the?pectate?lyase?of?PL1?family?from?V.dahliae?contained?17?members，?and?most?of?them?showed?up?regulation?of?expression?in?the?early?stage?of?infection.?The?expressions?of?VdPL14?and?VdPL18?were?strongly?induced?in?the?early?stages?of?infection.?VdPL14?was?selected?to?construct?deletion?mutants，?and?it?was?found?that?the?growth?of?the?deletion?mutants?of?VdPL14?was?inhibited?on?different?complex?carbon?sources?（pectin，?carboxymethyl?cellulose，?starch）?and?they?were?significantly?less?virulent.?The?virulence?and?carbon?utilization?capacity?of?the?complementary?strains?were?restored?to?the?levels?of?the?wild?type?strain.?Verification?of?secretory?activity?mediated?by?signal?peptide?showed?that?VdPL14?was?secretory?protein.?The?gene?VdPL14?is?therefore?an?important?virulence?factor?in?V.dahliae，?and?this?study?provides?a?strong?theoretical?basis?for?the?subsequent?systematic?analysis?of?the?roles?of?the?pectate?lyase?genes?of?PL1?family?in?V.dahliae?pathogenesis.

Key?words

Verticillium?dahliae;?pectate?lyase;?PL1?family;?virulence

果膠是一種結(jié)構(gòu)復雜的天然植物多糖，大量存在于果皮以及植物細胞壁中，其合成需要糖基轉(zhuǎn)移酶、甲基轉(zhuǎn)移酶等多種酶類參與［12］。果膠包括同型半乳糖醛酸聚糖（HG）、木糖半乳糖醛酸聚糖（XGA）和兩種鼠李半乳糖醛酸聚糖（RGⅠ和RGⅡ）等［3］。果膠是植物初生細胞壁的主要非纖維素成分，在大多數(shù)高等植物細胞壁中含量超過30%，對細胞間黏附和維持細胞壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要作用［4］。果膠酶分為原果膠酶（protopectinase）、多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase）、果膠裂解酶（pectate?lyase）和果膠酯酶等（pectinesterase），通過不同機制降解果膠基質(zhì)［5］。果膠裂解酶通過β消除反應切割α1，4糖苷鍵，降解去甲酯化果膠，以此來保持細胞壁的完整性和凝聚力［6］。

在微生物與植物互作過程中，病原微生物分泌的果膠裂解酶在降解植物細胞壁中發(fā)揮重要作用，其通常于侵染植物早期分泌，是一種潛在的毒力因子。如蘋果輪紋病菌Botryosphaeria?dothidea果膠裂解酶Bdpl1參與寄主果膠類物質(zhì)的降解［7］;球炭疽菌Colletotrichum?coccodes中果膠裂解酶基因CcpelA過表達后其致病性增強［8］;辣椒疫霉Phytophthora?capsici果膠裂解酶PcPL1、PcPL15、PcPL16和PcPL20在辣椒葉中瞬時表達后引起寄主細胞死亡［9］;菜豆炭疽病菌Colletotrichum?lindemuthianum果膠裂解酶基因pecCl1的失活減輕了炭疽病的癥狀［10］。這些研究結(jié)果揭示了病原菌能夠利用自身外泌的果膠裂解酶參與致病過程。

作物黃萎病是由大麗輪枝菌Verticillium?dahliae引起的一種土傳性維管束病害。大麗輪枝菌寄主十分廣泛，能夠侵染600余種雙子葉植物，其中包括180余種農(nóng)作物［1112］。大麗輪枝菌通過微菌核發(fā)育形成菌絲與根部接觸，菌絲突破根的皮層進入導管定殖，隨著植物蒸騰作用，菌絲和孢子沿著導管系統(tǒng)向寄主組織頂端擴散，最終引起植物黃化萎蔫［13］。比較基因組學分析發(fā)現(xiàn)，相較其他葉部病原真菌，大麗輪枝菌編碼的碳水化合物酶類更多，尤其是纖維素酶和果膠酶，推測這兩種酶可能對大麗輪枝菌在寄主導管中定殖和擴繁發(fā)揮重要作用［1415］。大麗輪枝菌果膠裂解酶VdPL3.1和?VdPL3.3?參與植物細胞壁降解，在其致病過程中發(fā)揮重要作用［16］。VdPEL1可誘導多種植物葉片壞死，激發(fā)煙草和棉花植株的抗性防御反應［17］。轉(zhuǎn)錄因子VdFTF1則通過調(diào)控細胞壁降解功能基因的表達參與致病過程，其調(diào)控的PL1家族基因VEDA_09651敲除后大麗輪枝菌對寄主棉花的致病力顯著下降［18］。

比較基因組學研究發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌的基因組編碼豐富的果膠裂解酶，主要包括PL1、PL3、PL4、PL9和PL11?5個家族，其中PL1家族的蛋白數(shù)目最多［14］，但目前對其致病功能尚未開展系統(tǒng)研究。因此，本研究擬系統(tǒng)梳理大麗輪枝菌PL1家族成員概況及寄主誘導下該家族基因的表達特性，并通過對代表基因VdPL14敲除突變體和回補轉(zhuǎn)化株開展碳源利用、致病力鑒定及蛋白信號肽外泌活性檢測等試驗，明確VdPL14在大麗輪枝菌侵染和致病過程中的作用。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌株和質(zhì)粒

菌株：大麗輪枝菌野生型菌株Vd991、酵母菌株YTK12、YTK12SPAvr1b為本實驗室保存;根癌農(nóng)桿菌AGL1購自上海唯地生物技術(shù)有限公司，用于遺傳轉(zhuǎn)化;大腸桿菌DH5α購自諾唯贊生物科技股份有限公司，用于遺傳轉(zhuǎn)化。

質(zhì)粒：pGKO2Hyg用于基因敲除，pSUC2用于酵母信號肽活性驗證，pCOM用于回補載體構(gòu)建。均在本實驗室保存。

1.1.2?主要試劑和儀器

試劑：卡那霉素、乙酰丁香酮，Coolaber公司;頭孢霉素，生工生物工程（上海）股份有限公司;F2dU，北京索萊寶科技有限公司;潮霉素，上海羅氏制藥有限公司;以上均用于加入培養(yǎng)基作抗生素使用。新型植物DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司;?RNA提取試劑盒，Aidlab?Biotechnologies公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司;AxyPrep?DNA凝膠回收試劑盒，Vazyme公司。

儀器：小型高速離心機，德國艾本德;PCR擴增儀、熒光定量PCR儀，BioRad公司;恒溫金屬浴，天根生化科技（北京）有限公司;pH計，梅特勒托利多公司;生物顯微鏡，Olympus?Corporation。

1.1.3?培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10?g/L、酵母提取物5?g/L、NaCl?10?g/L、瓊脂15?g/L;PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200?g/L、葡萄糖20?g/L、瓊脂20?g/L;CM培養(yǎng)基（complete?medium）：酵母提取物6?g/L、酸水解酪蛋白?6?g/L、蔗糖10?g/L;查氏培養(yǎng)基（CzapekDox?medium）：NaNO3?2?g/L、KCl?0.5?g/L、FeSO4·H2O?0.001?8?g/L、K2HPO4·3H2O?1.31?g/L、MgSO4·7H2O?0.5?g/L、蔗糖30?g/L、瓊脂15?g/L;不同碳源培養(yǎng)基：將查氏培養(yǎng)基中30?g/L蔗糖分別替換為17?g/L淀粉、10?g/L果膠或10?g/L羧甲基纖維素;MM培養(yǎng)基（minimal?medium）：200?g/L?K2HPO4與145?g/L?KH2PO4混合后以10?mL/L的量加入，30?g/L?MgSO4·7H2O與15?g/L?NaCl混合后以20?mL/L的量加入，1%?CaCl2·2H2O?1?mL/L，葡萄糖2?g/L，0.01%?FeSO4?10?mL/L，ZnSO4·7H2O?0.1?g/L、CuSO4·5H2O?0.1?g/L、硼酸0.1?g/L、0.1?g/L?MnSO4·7H2O與0.1?g/L鉬酸鈉混合后以5?mL/L的量加入，20?g?NH4NO3和100?mL蒸餾水混合后以2.5?mL/L的量加入，最后將pH調(diào)至7.0。IM培養(yǎng)基（induction?medium）：配方與MM培養(yǎng)基相似，除需添加上述藥品外還需添加2（N嗎啉）乙磺酸一水物8.53?g/L與甘油25?mL/L，將pH調(diào)至6.0。

CMDW培養(yǎng)基：無氨基酸酵母氮源6.7?g/L，?Tryptophan?dropout?supplement?0.75?g/L，?蔗糖20?g/L，葡萄糖1?g/L;YPRAA培養(yǎng)基：酵母提取物10?g/L，蛋白胨20?g/L，棉子糖20?g/L。

1.1.4?PL1家族基因生物信息學分析

PL1家族基因信息來源于大麗輪枝菌菌株Vd991基因組測序信息，包括其GeneID、CDS序列、PEP序列等。利用SMART（http：∥smart.emblheidelberg.de/）對PL1家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)進行預測。用BioEdit進行多序列比對，采用MEGA?6使用最大似然法構(gòu)建（參數(shù)1?000，JonesTaylorThornton模型）系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2?PL1家族基因表達特性分析

孢子懸浮液制備：將大麗輪枝菌菌株Vd991接入CM培養(yǎng)基中，于25℃，150?r/min培養(yǎng)3～4?d后用無菌濾布過濾菌絲，調(diào)整孢子濃度至5×106個/mL，獲得孢子懸浮液。

將表面消毒的棉花種子種入無菌土（蛭石∶營養(yǎng)土=2∶3）中，于25℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（L∥D=16?h∥8?h）。待棉花幼苗第一片真葉伸展后，將棉花幼苗拔出，將根部浸于250?mL濃度為5×106個/mL?的Vd991孢子懸浮液中，30?min后移栽至無菌土中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0、1、2、3、5、7、9?d時收取棉花根部樣品（0?d收集樣品作為基因表達的對照，將其相對表達量當作1），提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用RTqPCR定量分析PL1家族基因在侵染過程中的表達情況。

采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。反應條件：95℃預變性3?min;95℃變性20?s，60℃退火20?s;72℃延伸20?s，40個循環(huán)。定量檢測引物見表1。

1.3?基因敲除和回補載體的構(gòu)建

敲除載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化：根據(jù)VdPL14基因的側(cè)翼序列分別設計上、下游片段擴增引物（表2），并以Vd991基因組DNA為模板擴增獲得分別約1?kb的上、下游片段。使用EcoRⅠ對敲除載體pGKO2Hyg進行酶切得到線性載體，利用同源重組法將VdPL14基因的上游片段克隆至pGKO2Hyg上，并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行PCR驗證，選取陽性菌落擴繁并提取質(zhì)粒。利用XbaⅠ對連接上游片段的重組質(zhì)粒進行酶切得到線性質(zhì)粒，通過同源重組法將下游片段克隆至含上游片段的重組質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，PCR驗證得到陽性菌落。將得到的重組質(zhì)粒pGKO2VdPL14upHygVdPL14down轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1中備用。上、下游片段擴增條件：95℃預變性5?min;95℃變性30?s，58℃退火30?s;72℃延伸1?min?10?s，28個循環(huán);72℃延伸10?min。

回補載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化：以Vd991基因組DNA為模板，采用ECVdPL14F/R引物（表2）擴增VdPL14基因的全長序列（包含啟動區(qū)、基因序列及終止區(qū)），利用EcoRⅠ和XbaⅠ對pCOM質(zhì)粒（含遺傳霉素抗性標記基因）進行線性化，通過同源重組技術(shù)將VdPL14基因全長序列克隆至pCOM載體上，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞并對單菌落進行PCR驗證，將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1備用。擴增條件：95℃預變性5?min;95℃變性30?s，58℃退火30?s;72℃延伸3?min，28個循環(huán);72℃延伸10?min。

1.4?農(nóng)桿菌介導的大麗輪枝菌遺傳轉(zhuǎn)化及陽性轉(zhuǎn)化子篩選

農(nóng)桿菌的制備：將含有重組質(zhì)粒（基因敲除載體或回補載體）的農(nóng)桿菌接種于10?mL?MM培養(yǎng)基中，28℃?200?r/min振蕩培養(yǎng)2?d，離心5?min棄上清，用IM培養(yǎng)基重懸，重復上述操作兩次后用1?mL?IM培養(yǎng)基（含200?μg/mL乙酰丁香酮）重懸菌體，稀釋至OD600為0.15～0.20，于28℃，200?r/min振蕩培養(yǎng)。待菌液OD600為0.5～0.7時取出備用。

大麗輪枝菌孢子懸浮液的準備：經(jīng)活化的大麗輪枝菌野生型菌株Vd991于25℃培養(yǎng)7?d后切小塊菌餅置于CM培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3?d，收集孢子，將孢子濃度調(diào)至5×106個/mL備用。

共培養(yǎng)：將上述制備好的農(nóng)桿菌與Vd991孢子懸浮液按1∶1（V/V）比例混勻，取100?μL涂布于IM平板（含200?μg/ml乙酰丁香酮）中的微孔濾膜上，25℃恒溫暗培養(yǎng)2?d后將微孔濾膜轉(zhuǎn)移至含有抗生素的PDA平板（含200?μg/mL頭孢霉素;30?mg/mL潮霉素;100?μg/mL卡那霉素;50?μmol/L的F2dU）上培養(yǎng)7?d左右，挑取單菌落在上述PDA平板上連續(xù)進行3代單孢分離，分別利用基因內(nèi)部檢測引物（VdPL14InF/R）、潮霉素抗性基因檢測引物（HygF/R）及基因側(cè)翼外部引物（VdPL14OutF/R）進行PCR，篩選敲除突變體陽性轉(zhuǎn)化子。

利用基因內(nèi)部檢測引物（VdPL14InF/R）和遺傳霉素抗性基因檢測引物（G418testF/R）進行PCR，篩選回補轉(zhuǎn)化子。

所需引物見表3。

1.5?VdPL14敲除突變體及回補轉(zhuǎn)化株碳源利用測定

野生型菌株Vd991、敲除突變體ΔVdPL14及回補菌株ECVdPL14分別于CM培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)4?d，制備成5×106個/mL孢子懸浮液。吸取1?μL孢子懸浮液接種在不同碳源培養(yǎng)基（果膠、羧甲基纖維素、淀粉、蔗糖）平板中央，置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)。在接種后第7天測量各菌株在不同碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑，拍照記錄生長表型。

1.6?VdPL14敲除突變體生長表型及產(chǎn)孢量測定

以野生型菌株Vd991為對照，制備野生型和敲除突變體ΔVdPL14的孢子懸浮液（1×106個/mL）;吸取1?μL孢子懸浮液，滴到直徑60?mm的PDA平板中心部位，25℃，恒溫黑暗培養(yǎng)8?d后觀察生長表型;光學生物顯微鏡下觀察孢子形態(tài);在菌落邊緣處用內(nèi)徑8?mm的打孔器均勻取3個菌餅，放入3?mL無菌水中振蕩混勻，利用血球計數(shù)板在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計孢子的數(shù)量，分析VdPL14敲除對產(chǎn)孢是否有影響（結(jié)果部分使用對數(shù)值體現(xiàn)）。

1.7?VdPL14敲除突變體及回補轉(zhuǎn)化株致病性鑒定

棉花和煙草幼苗在25℃，L∥D=14?h∥10?h條件下分別培養(yǎng)約3周和4周用于接種。棉苗第2片真葉伸展時

采用蘸根法［19］進行接種。將棉花幼苗連根拔出，在5×106個/mL的大麗輪枝菌孢子懸浮液（Vd991、ΔVdPL14和ECVdPL14）中浸泡30?min后重新種回土中。煙苗采用灌根法接種，每盆澆灌15?mL?5×106個/mL的大麗輪枝菌孢子懸浮液。

每個突變體轉(zhuǎn)化株系和野生型菌株均接種20株棉花和4株煙草幼苗，試驗重復3次。

接菌21?d后觀察棉花和煙草幼苗的發(fā)病情況并剖莖觀察縱切面的病變情況，統(tǒng)計不同發(fā)病等級幼苗數(shù)量的占比，發(fā)病等級參照Zhang等［20］的分級方法。以煙草NbEF1α、棉花18S?rDNA為內(nèi)參基因，大麗輪枝菌的延伸因子VdEF1α作為靶標基因［18］（引物見表4），利用定量PCR（qPCR）法檢測病原菌在棉苗或煙草莖基部的定殖情況（即生物量）。反應條件：95℃預變性3?min;95℃變性20?s，60℃退火20?s，72℃延伸20?s，40個循環(huán)。反應體系（20?μL）：?DNA模板1?μL，10?μmol/L引物各0.6?μL，2×qPCR?SuperMix?10?μL，ddH2O?7.8?μL。

1.8?酵母信號肽活性檢測方法

根據(jù)預測分析的信號肽序列長度（18個氨基酸），擴增編碼信號肽的CDS序列（引物見表5）。利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ將質(zhì)粒pSUC2線性化，通過同源重組技術(shù)將目的片段克隆至pSUC2載體上，獲得重組質(zhì)粒pSUC2∷SPVdPL14并導入酵母菌株YTK12。將酵母菌株YTK12、YTK12pSUC2、YTK12SPVdPL14及陽性對照YTK12SPAvr1b分別劃線于YPRAA（棉子糖為唯一碳源）和CMDW（色氨酸缺陷）培養(yǎng)基平板上，于30℃培養(yǎng)2?d后觀察各酵母菌株的生長情況。

1.9?數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft?Excel的數(shù)據(jù)分析模塊對試驗數(shù)據(jù)進行t測驗，采用Microsoft?Excel和AdobePhotoshop?CC作圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?PL1家族基本信息

基于基因組注釋分析，大麗輪枝菌Vd991的基

因組共編碼17個PL1家族基因，命名為VdPL11

～VdPL117。利用SignalP?5.0（https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP5.0）對PL1家族成員進行信號肽預測分析，結(jié)果顯示其中16個成員含有信號肽（表6，圖1）;該家族成員多數(shù)

含有Amb_all結(jié)構(gòu)域，另外VdPL17含有真菌

纖維素結(jié)合域（fungaltype?cellulosebinding?domain，F(xiàn)CBD），VdPL117含有碳水化合物結(jié)合模塊結(jié)構(gòu)域（carbohydratebinding?module?1，

CBM1）（表6，圖1）。利用MEGA?6構(gòu)建大麗輪枝菌17個PL1家族成員及部分真菌的PL1家族蛋白的系統(tǒng)進化樹，以阿維鏈霉菌Streptomyces?avermitilis果膠裂解酶FoPEL（BAC74094）、芽胞桿菌Bacillus?spp.果膠裂解酶BsPEL（1EE6_A）和稻瘟菌Magnaporthe?oryzae果膠裂解酶CoPEL（XP_369589.1）蛋白序列作為外群。結(jié)果顯示大麗輪枝菌Vd991中17個PL1家族成員被分成3個進化分支，其中VdPL12、VdPL14、VdPL15、VdPL16、VdPL18、VdPL110、VdPL111、VdPL114、VdPL116和VdPL117屬于一個進化分支，包含的成員最多;VdPL17、VdPL19、VdPL112、VdPL113和VdPL115屬于第二個進化分支，VdPL11和VdPL13屬于一個進化分支。以上結(jié)果表明大麗輪枝菌中PL1家族成員在進化過程中發(fā)生了明顯分化（圖2）。

2.2?PL1家族基因表達模式分析

為明確PL1家族基因在大麗輪枝菌侵染棉花過程中的表達特性，測定了該家族基因在棉花根系誘導下在不同時間的表達差異情況，結(jié)果顯示，除VdPL110、VdPL116和VdPL117在侵染過程中下調(diào)表達外，其余基因在侵染過程中均上調(diào)表達。其中，VdPL14、VdPL15和VdPL18在侵染的整個進程中顯著上調(diào)表達（單因素方差分析P<0.001），初步表明這些基因在大麗輪枝菌的侵染過程中發(fā)揮重要作用。而VdPL14、VdPL18在侵染第2天時受誘導表達最為強烈，分別上調(diào)326.12倍和426.43倍，表明二者在侵染早期，尤其是突破寄主根部的表皮和皮層屏障時發(fā)揮重要作用。后續(xù)選取代表基因VdPL14進行其致病功能研究。

2.3?VdPL14基因敲除突變體和回補轉(zhuǎn)化株P(guān)CR鑒定結(jié)果

VdPL14基因敲除轉(zhuǎn)化菌株經(jīng)單孢分離和純化之后，選取2個轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA進行分子驗證，結(jié)果如圖4a所示：以野生型Vd991基因組為對照，潮霉素抗性基因檢測引物（表3）從ΔVdPL14突變體中擴增到了約500?bp的條帶，從野生型菌株Vd991中未擴增出條帶;VdPL14基因內(nèi)部檢測引物（表3）從ΔVdPL14突變體中未擴增處條帶，從野生型菌株Vd991中擴增到了約700?bp的條帶;VdPL14基因外部檢測引物（表3）從ΔVdPL14突變體中擴增到了約3?800?bp的條帶，從野生型菌株Vd991中未擴增出條帶（圖4a）。以上結(jié)果表明潮霉素抗性基因已成功替換目的基因并整合到大麗輪枝菌基因組中，獲得VdPL14缺失突變體ΔVdPL14。將上述轉(zhuǎn)化子命名為ΔVdPL14#1和ΔVdPL14#2。

在ΔVdPL14#1、ΔVdPL14#2缺失突變體的基礎上，構(gòu)建了VdPL14基因回補菌株，利用基因內(nèi)部引物及遺傳霉素（G418）抗性基因引物（表3）進行分子驗證，結(jié)果顯示，回補轉(zhuǎn)化株ECVdPL14與在野生型菌株中擴增到的VdPL14基因條帶大小一致（約700?bp），且能成功擴增到遺傳霉素抗性基因片段，表明成功構(gòu)建了大麗輪枝菌VdPL14基因回補轉(zhuǎn)化株的陽性轉(zhuǎn)化子（圖4b）。

2.4?VdPL14基因敲除突變體和回補轉(zhuǎn)化株碳源利用分析

大麗輪枝菌在侵染植物過程中會分泌大量的植物細胞壁水解酶以降解植物細胞壁組織。植物細胞壁中主要含有果膠、纖維素、半纖維素等成分，為了明確VdPL14敲除突變體及回補轉(zhuǎn)化株對不同植物碳源的利用能力，本研究分別測定了在4種不同碳源（蔗糖、果膠、羧甲基纖維素、淀粉）培養(yǎng)條件下敲除突變體和回補轉(zhuǎn)化株的生長表型。結(jié)果表明，培養(yǎng)7?d后，相較于野生型菌株Vd991，敲除突變體ΔVdPL14#1和ΔVdPL14#2在以果膠、羧甲基纖維素和淀粉為唯一碳源的多糖培養(yǎng)基上的生長受到顯著抑制，回補轉(zhuǎn)化株的生長表型恢復到野生型的生長水平（圖5）。上述結(jié)果說明基因VdPL14的缺失影響了大麗輪枝菌對果膠、羧甲基纖維素和淀粉的利用能力。

2.5?VdPL14基因敲除突變體及回補轉(zhuǎn)化株生長表型及產(chǎn)孢量分析

PDA平板上的生長表型及顯微形態(tài)觀察結(jié)果表明，相較于野生型菌株Vd991，VdPL14基因缺失后菌落形態(tài)和孢子的顯微形態(tài)沒有顯著差異（圖6a）。產(chǎn)孢量的差異分析結(jié)果顯示，缺失突變體ΔVdPL14#1和ΔVdPL14#2的產(chǎn)孢能力相對于野生型Vd991沒有顯著差異（圖6b，6c）。以上結(jié)果說明，VdPL14基因的缺失對生長表型、孢子形態(tài)及產(chǎn)孢量均無顯著影響。

2.6?VdPL14基因敲除突變體及回補轉(zhuǎn)化株致病力分析

為驗證突變體ΔVdPL14的致病力，分別將野生型菌株Vd991、突變體ΔVdPL14、回補轉(zhuǎn)化株ECVdPL14接種感病品種‘軍棉1號。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Vd991侵染的棉花表現(xiàn)出典型的黃化萎蔫癥狀，頂梢枯死，剖莖維管束褐化嚴重（圖7a）。相較野生型，突變體ΔVdPL14對寄主棉花的致病力顯著下降，僅極少數(shù)子葉表現(xiàn)出輕微黃化癥狀，維管束褐化明顯減弱（圖7a）。而接種回補轉(zhuǎn)化子后棉花葉片恢復典型的黃萎癥狀，與野生型菌株類似（圖7a）。煙草（本氏煙Nicotiana?benthamiana）接種Vd991、ΔVdPL14、和ECVdPL14后情況與接種棉花的致病情況類似（圖7b）。棉苗的發(fā)病情況統(tǒng)計（圖7c）和大麗輪枝菌在根部的生物量與上述表型相對應（圖7d）。接種煙草也得到了類似結(jié)果（圖7e）。以上結(jié)果表明，VdPL14是大麗輪枝菌重要的毒力因子。

2.7?VdPL14信號肽分泌特性分析

本試驗采用酵母信號肽捕獲系統(tǒng)驗證VdPL14信號肽是否具有介導蛋白分泌的功能。結(jié)果顯示，不含pSUC2的YTK12菌株在CMDW培養(yǎng)基（色氨酸缺失培養(yǎng)基）和YPRAA培養(yǎng)基（以棉籽糖作為唯一碳源）上略有生長;攜帶pSUC2的YTK12菌株只能在CMDW培養(yǎng)基上生長，不能在YPRAA培養(yǎng)基上生長;陽性對照YTK12SPAvrb菌株具有信號肽活性，在CMDW和YPRAA培養(yǎng)基上均能生長;含有重組質(zhì)粒的YTK12SPVdPL14酵母菌株在CMDW和YPRAA培養(yǎng)基上也均能生長（圖8）。TTC試驗（又稱氯化三苯四氮唑法）表明，陽性對照YTK12SPAvrb和?YTK12SPVdPL14均可將蔗糖轉(zhuǎn)移酶分泌出去，單糖還原TTC后呈紅色，而不含pSUC2的YTK12菌株和攜帶pSUC2的YTK12菌株不能將蔗糖轉(zhuǎn)移酶分泌出去，所以均為無色。上述結(jié)果表明VdPL14?N端信號肽具有介導蛋白外泌的活性，VdPL14為分泌蛋白。

3?結(jié)論與討論

果膠是植物細胞壁最主要和最復雜的組分之一，微生物侵染植物必須突破該屏障。果膠裂解酶在突破寄主植物屏障中發(fā)揮重要作用。許多病原真菌中果膠裂解酶家族基因數(shù)量相較于非致病真菌顯著增加［2124］。大麗輪枝菌是典型的土傳維管束病原真菌，其通過根部侵染寄主，然后在導管中定殖和擴繁［13］。比較基因組分析也證實，相較其他葉部病原真菌（如稻瘟菌），大麗輪枝菌編碼的碳水化合物活性酶更多，尤其是果膠酶，以適應其定殖在植物導管這一特殊生態(tài)位［14］。大麗輪枝菌果膠裂解酶PL1家族成員在大麗輪枝菌所有果膠裂解酶中豐度最高［14］，包含17個成員，部分家族成員在寄主誘導條件下表現(xiàn)為高表達，表明該家族成員在病原菌侵染寄主過程中發(fā)揮重要作用。序列進化分析也表明，該家族成員在進化過程中發(fā)生了顯著分化，表明該家族成員在侵染過程中的功能也產(chǎn)生了一定程度的分化。通過對大麗輪枝菌PL1家族基因的系統(tǒng)分析，可為后續(xù)開展該家族成員致病功能和操縱免疫特性的鑒定提供重要數(shù)據(jù)支撐。

隨著細菌中首個果膠裂解酶于1962年在軟腐病菌Erwinia?carotovora中被發(fā)現(xiàn)以來［25］，越來越多的果膠裂解酶被發(fā)現(xiàn)在病原菌致病過程中發(fā)揮重要作用。早期研究發(fā)現(xiàn)，腐皮鐮孢豌豆專化型Fusarium?solani?f.sp.?pisi的果膠裂解酶與其侵染直接相關(guān)，其中PLA基因在侵染寄主中高效表達，為關(guān)鍵致病靶標基因［2627］;在黑曲霉Aspergillus?nidulans的6個PL基因中，PLA具有致病功能［28］;膠孢炭疽菌Colletotrichum?gloeosporioides中兩個pel基因在引起寄主壞死中發(fā)揮作用［29］;大麗輪枝菌果膠裂解酶基因VdPEL1參與病原菌致病過程［17］;新近研究發(fā)現(xiàn)稻瘟菌中的果膠裂解酶基因MoPL1在侵染后期顯著上調(diào)表達，在死體營養(yǎng)階段發(fā)揮重要功能［30］。本研究通過對大麗輪枝菌侵染過程中高表達的果膠裂解酶基因VdPL14進行基因敲除和回補，并對突變體及回補轉(zhuǎn)化株進行了致病性驗證，明確了在侵染早期（48?h）顯著上調(diào)表達的大麗輪枝菌果膠裂解酶基因VdPL14是重要的毒力因子，在其致病過程中發(fā)揮重要作用。該基因缺失后導致大麗輪枝菌對多種植物細胞壁復雜組分的降解和利用能力顯著降低。

有研究發(fā)現(xiàn)果膠裂解酶家族成員能夠作為病原體相關(guān)的分子模式（pathogenassociated?molecular?patterns，PAMPs）或損傷相關(guān)的分子模式（damage?associated?molecular?patterns，DAMPs）在病原菌侵染寄主過程中發(fā)揮操控寄主免疫的功能。例如，稻瘟菌中的果膠裂解酶MoPL1能夠作為DAMPs激發(fā)煙草葉片的免疫反應［30］，大麗輪枝菌果膠裂解酶VdPEL1作為PAMPs激發(fā)的免疫反應（PAMPtriggered?immunity，PTI）［17］，MoPL1和VdPEL1激發(fā)的寄主免疫反應均依賴于其自身的酶活。本研究雖然尚未開展該家族成員操控寄主免疫反應的系統(tǒng)分析，但是初步明確了VdPL14分泌到胞外發(fā)揮作用并且是重要的毒力因子。因此，推測VdPL14除了能夠作為果膠裂解酶直接參與植物細胞壁組分的降解外，還有可能作為PAMP或DAMP在干擾植物免疫反應中發(fā)揮重要作用，但需要開展進一步的研究。

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（責任編輯：楊明麗）