李澤廷，蘇少鋒，喬健敏，馬躍軍，孫培培，趙俊利，吳海青

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古草原同源牧業(yè)有限公司， 內(nèi)蒙古 呼和浩特

010020）

下丘腦-垂體-性腺軸屬于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的 一部分，發(fā)揮重要的生殖調(diào)控作用。垂體受到來自下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素（gonadotropinreleasing hormone，GnRH）調(diào)控，繼而分泌促卵泡素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH） 和 促 黃 體 素（luteinizing hormone，LH），這兩種激素共同調(diào)控性腺的發(fā)育。 FSH 和LH 共同調(diào)控卵巢性激素的分泌，同時，中樞生殖激素的合成與分泌又受卵巢激素的反饋調(diào)節(jié)。 當(dāng)下丘腦GnRH 合成增加促進(jìn)FSH 和LH 的分泌時， 稱為正反饋 （positive feedback）；當(dāng)FSH 和LH 的分泌量增加到一定程度時會導(dǎo)致下丘腦GnRH 合成減少，稱為負(fù)反饋（negative feedback）。

垂體作為下丘腦-垂體-性腺軸中的重要組成部分，通過結(jié)締組織包裹的被膜隔開，一部分是主要由神經(jīng)細(xì)胞組成的神經(jīng)垂體， 另一部分是由分泌激素的細(xì)胞組成的腺垂體。 腺垂體是垂體分泌激素的主要部位，也是機(jī)體重要的內(nèi)分泌腺。促性腺激素FSH 和LH 在動物的生殖發(fā)育過程中起著重要作用。FSH 可以促進(jìn)卵巢的生長、卵泡內(nèi)膜細(xì)胞的分化以及顆粒細(xì)胞的增殖， 進(jìn)而促進(jìn)卵泡細(xì)胞的生長和發(fā)育。 FSH 和LH 的共同作用也可以促進(jìn)卵泡的生長發(fā)育并排出優(yōu)勢卵泡，因此，腺垂體細(xì)胞的體外培養(yǎng)對于研究促性腺激素（gonadotropin，Gn）的分泌機(jī)制顯得尤為重要。 細(xì)胞的體外培養(yǎng)可以避開體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境因素的影響，腺垂體細(xì)胞的體外培養(yǎng)更容易揭示FSH 和LH 的分泌機(jī)理。 筆者介紹了腺垂體在腦室中所處的位置以及腺垂體細(xì)胞的類型和主要分泌的激素， 綜述了腺垂體細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定方法， 以及外源藥物對體外培養(yǎng)腺垂體細(xì)胞分泌Gn 影響的研究進(jìn)展， 以期為深入研究下丘腦-垂體-卵巢軸的功能及機(jī)制，優(yōu)化與完善腺垂體細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，篩選Gn 分泌調(diào)節(jié)藥物提供參考。

1 腺垂體的位置

腺垂體屬于垂體的一部分。垂體主要由前葉、中葉和后葉構(gòu)成，前葉通常指腺垂體，后葉通常指神經(jīng)垂體。 垂體前葉是垂體性激素分泌的主要部位； 中葉主要合成促黑素； 后葉本身并不產(chǎn)生激素，而是從下丘腦接收并儲存抗利尿激素（antidiuretic hormone，ADH）和催產(chǎn)素（oxytocin，OXT），然后釋放到血液中。 動物的繁殖和發(fā)育受到來自腺垂體分泌的FSH 和LH 的共同調(diào)控。

2 腺垂體細(xì)胞的類型及主要分泌的激素

2.1 腺垂體細(xì)胞的類型

腺垂體中細(xì)胞類型多樣， 包括FSH 細(xì)胞、LH細(xì)胞、 促乳素 （prolactin，PRL） 細(xì)胞、 生長激素（growth hormone，GH）細(xì)胞、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）細(xì)胞、促甲狀腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）細(xì)胞。 細(xì)胞的類型不同，其分泌的激素也不同。

2.2 腺垂體細(xì)胞主要分泌的激素

腺垂體細(xì)胞的主要作用是分泌性激素， 主要包括FSH、LH 和PRL。Gn 主要促進(jìn)腺垂體合成及釋放FSH 和LH，Gn 脈沖頻率和振幅直接對FSH和LH 的合成產(chǎn)生影響， 在低脈沖頻率下優(yōu)先刺激FSH 分泌，在高脈沖頻率下優(yōu)先刺激LH 分泌。GnRH 也可以直接作用于性腺， 但對性腺的作用是抑制性的。

2.2.1 FSH

FSH 是由ɑ 亞基和β 亞基構(gòu)成的糖蛋白激素，2 個亞基由共價鍵結(jié)合。 促卵泡素受體（follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR） 屬于G 蛋白偶聯(lián)受體。 FSH 只有與靶細(xì)胞膜上的FSHR 結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)作用。在雌性動物中，F(xiàn)SH 可以明顯促進(jìn)卵泡和卵巢的生長發(fā)育。 雌激素與FSH聯(lián)合作用可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、 子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化、卵泡腔增大，促進(jìn)卵泡發(fā)育。 在雄性動物中，F(xiàn)SH 有利于精子的發(fā)育成熟。 通過與FSHR 的相互作用，F(xiàn)SH 作用于雄性動物細(xì)胞中的獨(dú)特靶點(diǎn)，即位于睪丸生精小管基膜上的支持細(xì)胞， 這些細(xì)胞可以促進(jìn)精原細(xì)胞增殖［1-2］。 在成年小鼠睪丸中，F(xiàn)SH 刺激支持細(xì)胞產(chǎn)生抗凋亡因子和黏附分子，促進(jìn)生殖細(xì)胞成熟［3-4］。 FSH 的缺乏會導(dǎo)致支持細(xì)胞數(shù)量減少［5-6］。 研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH 與睪丸的重量也有關(guān)， 從體外培養(yǎng)的水牛犢牛腺垂體細(xì)胞中提取的FSH 以不同劑量注射到雄性兔子體內(nèi)，與對照組相比，低劑量和高劑量的FSH 均增加了睪丸重量，提高了血清FSH 含量［7］。

2.2.2 LH

LH 是由ɑ 亞基和β 亞基構(gòu)成的糖蛋白激素，穩(wěn)定性通常較好，在提取和純化過程中比FSH 穩(wěn)定，在雌性動物中可以促進(jìn)卵泡發(fā)育、誘導(dǎo)排卵以及促進(jìn)黃體形成。 在發(fā)情周期過程中LH 和FSH協(xié)同作用促進(jìn)卵泡發(fā)育，當(dāng)卵泡發(fā)育接近成熟時，LH 水平達(dá)到峰值從而誘發(fā)排卵。 LH 可以促進(jìn)雄性動物睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖， 睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌雄激素和生長因子， 這些物質(zhì)共同作用誘導(dǎo)副性腺發(fā)育、精子成熟以及睪酮合成［8］。 LH、FSH 和睪酮三者的共同作用可以促進(jìn)ACTH 細(xì)胞和TSH 細(xì)胞的完全成熟。 由此可見，F(xiàn)SH 和LH 在動物繁殖機(jī)能調(diào)控方面起到重要作用。

2.2.3 PRL

PRL 細(xì)胞主要分泌PRL。 PRL 是由199 個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白質(zhì)。 在雌性動物中PRL最主要的功能是促進(jìn)乳腺發(fā)育和泌乳［9］；在雄性動物中，PRL 可增加間質(zhì)細(xì)胞上促黃體素受體（luteinizing hormone receptor，LHR）的數(shù)量［10］，通過支持細(xì)胞增加FSHR 的數(shù)量［11］。 PRL 在骨組織中也發(fā)揮一定的作用［12-13］。

3 腺垂體細(xì)胞的體外培養(yǎng)

垂體結(jié)構(gòu)較小且功能較為復(fù)雜， 通過體外培養(yǎng)腺垂體細(xì)胞可以更好地了解其激素分泌功能。為了得到數(shù)量更多且活力較好的腺垂體細(xì)胞，研究者們在摸索腺垂體細(xì)胞分離培養(yǎng)最佳方法的基礎(chǔ)上，探索傳代培養(yǎng)、純化培養(yǎng)、維持培養(yǎng)等不同培養(yǎng)方法的最佳條件。

3.1 腺垂體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

腺垂體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法主要有機(jī)械法和機(jī)械+酶消化法。機(jī)械法通常是將已經(jīng)分離出來的腺垂體用剪刀剪成糊狀，然后將組織塊和液體放入試管，在細(xì)胞篩上過濾碾磨成液體，得到細(xì)胞懸浮液，最后將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。 鄭慧媛等［14］研究表明，采用機(jī)械法分離培養(yǎng)腺垂體細(xì)胞，可以在較短的時間內(nèi)獲得細(xì)胞，但是對細(xì)胞損傷較大，得到的細(xì)胞存活率較低。機(jī)械+酶消化法是指將腺垂體剪成小塊轉(zhuǎn)入離心管中， 之后加入消化酶或者Ⅳ型膠原酶進(jìn)行消化，離心后棄上清液，最后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。楊地等［15］采用機(jī)械+酶消化法分離腺垂體細(xì)胞， 在腺垂體剪碎之后加入Ⅳ型膠原酶進(jìn)行消化， 一定時間后將液體通過細(xì)胞篩進(jìn)行過濾，得到細(xì)胞懸浮液，最后將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，得到的細(xì)胞存活率較高。 蔣小飛等［16］比較了幾種SD 大鼠腺垂體細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的效果，發(fā)現(xiàn)采用機(jī)械+酶消化法獲得的腺垂體細(xì)胞數(shù)量較多且活力較高。 尹慧勇等［17］在山羊腺垂體細(xì)胞培養(yǎng)基中分別添加胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶和胰蛋白酶、 Ⅳ型膠原酶和透明質(zhì)酸酶進(jìn)行消化，將細(xì)胞懸浮液鋪板培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后采用免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行鑒定； 通過對細(xì)胞消化結(jié)果和腺垂體細(xì)胞的生長特性進(jìn)行比較， 發(fā)現(xiàn)山羊腺垂體組織在37 ℃條件下以Ⅳ型膠原酶和透明質(zhì)酸酶混合消化2.5～3 h，腺垂體細(xì)胞的消化效果最好， 細(xì)胞通常在24 h 開始貼于培養(yǎng)皿底部生長，在72 h 后細(xì)胞大量增殖連接成團(tuán)，形態(tài)多為多角形或梭形， 培養(yǎng)6 d 左右細(xì)胞基本覆蓋鋪滿培養(yǎng)皿底部。

單獨(dú)使用胰蛋白酶獲得的細(xì)胞數(shù)量少， 液體黏性較大，消化效果差；單獨(dú)使用膠原酶獲得的細(xì)胞數(shù)量多，但是液體黏性大，不易過濾；單獨(dú)使用Ⅳ型膠原酶或胰蛋白酶獲得的細(xì)胞存活率較低，液體黏性大，不易過濾。 對比以上方法，機(jī)械法配合Ⅳ型膠原酶+透明質(zhì)酸酶消化法分離腺垂體細(xì)胞的效果較好， 細(xì)胞分離培養(yǎng)后的活力較高且存活率較高。

3.2 腺垂體細(xì)胞的體外培養(yǎng)

合適的體外培養(yǎng)條件有利于分離后的腺垂體細(xì)胞維持活性及分泌特性， 為建立腺垂體體外細(xì)胞模型提供可模擬體內(nèi)環(huán)境的有利條件。 史繼新等［18］研究了小鼠垂體前葉細(xì)胞體外培養(yǎng)的3 種方法：傳代培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和維持培養(yǎng)。

傳代培養(yǎng)是指待細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部時，使用胰蛋白酶進(jìn)行消化，離心后將細(xì)胞重新鋪板的培養(yǎng)方法。 傳代培養(yǎng)時腺垂體細(xì)胞增殖速度較快， 通常在24 h 內(nèi)貼于培養(yǎng)皿底部，48 h 后呈對數(shù)生長，大約7 d 后需要繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 培養(yǎng)的腺垂體細(xì)胞形態(tài)接近圓形或多角形， 較大的腺垂體細(xì)胞可逐漸形成細(xì)胞團(tuán)， 隨著培養(yǎng)時間的延長，腺垂體細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，采用倒置顯微鏡觀察可以看到大量長梭形和不規(guī)則形態(tài)的細(xì)胞。通過多次傳代培養(yǎng)， 腺垂體細(xì)胞數(shù)量有明顯的下降，細(xì)胞會發(fā)生一定程度的變性。

純化培養(yǎng)是指利用成纖維細(xì)胞先貼壁以及對胰蛋白酶消化較上皮細(xì)胞敏感的原理對腺垂體細(xì)胞進(jìn)行純化的培養(yǎng)方法。 該方法可以增加腺垂體細(xì)胞的數(shù)量， 但是純化培養(yǎng)后細(xì)胞需要經(jīng)歷的過程較長，大約需要持續(xù)48～72 h。 在細(xì)胞貼壁的前幾天，可以看到大量的細(xì)胞處于分裂期，繼續(xù)培養(yǎng)形成的細(xì)胞團(tuán)才會逐漸增加， 同時穿插有少量的長梭形細(xì)胞，長期培養(yǎng)容易導(dǎo)致細(xì)胞變性。

維持培養(yǎng)是指將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每3 d 更換1 次培養(yǎng)液，持續(xù)培養(yǎng)30 d 的培養(yǎng)方法。該方法培養(yǎng)時間較長，會影響細(xì)胞的生長與活性。通過比較以上3 種方法，可以采用純化培養(yǎng)的方式進(jìn)行腺垂體細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

為了優(yōu)化培養(yǎng)體系， 研究者在模擬微重力條件下對大鼠腺垂體細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)， 發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)條件下的腺垂體細(xì)胞比二維培養(yǎng)更接近體內(nèi)環(huán)境，同時可以避免體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，是一種理想的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，微重力在促進(jìn)細(xì)胞分化方面具有優(yōu)勢［19-21］。 寧澤乾［22］研究表明，應(yīng)用模擬微重力對腺垂體細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)， 腺垂體細(xì)胞比普通細(xì)胞增殖更快且細(xì)胞活力較好，因此，可以通過微重力三維培養(yǎng)方式進(jìn)行腺垂體細(xì)胞培養(yǎng)。

4 腺垂體細(xì)胞的鑒定

腺垂體細(xì)胞的鑒定主要包括形態(tài)學(xué)、 細(xì)胞學(xué)以及分子生物學(xué)方面的鑒定。 形態(tài)學(xué)鑒定通過利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)， 腺垂體細(xì)胞剛貼壁時呈現(xiàn)圓形或不規(guī)則形態(tài)， 完全貼滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部需要5 d 左右， 此時大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)多角形或梭形。 細(xì)胞學(xué)鑒定主要有免疫組化法和免疫熒光法；通過免疫組化法觀察FSH 和PRL 等陽性細(xì)胞染色結(jié)果，F(xiàn)SH 陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)為藍(lán)色，PRL陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)為藍(lán)褐色； 經(jīng)免疫熒光染色的FSH 陽性細(xì)胞在熒光顯微鏡下細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。分子生物學(xué)鑒定是指基因水平的鑒定，通過設(shè)計(jì)FSH、LH、PRL 等基因引物序列，利用PCR 擴(kuò)增目的基因后進(jìn)行凝膠電泳檢測， 觀察凝膠特定位置上有無符合預(yù)期大小的條帶， 有條帶可證明FSH、LH、PRL 等基因有表達(dá)， 再通過qPCR 分析FSH、LH、PRL 等基因的表達(dá)水平。針對FSH、PRL、LH 等標(biāo)記基因的PCR 方法可以用于鑒定腺垂體細(xì)胞。

5 培養(yǎng)基中添加外源物質(zhì)對腺垂體細(xì)胞分泌Gn的影響

腺垂體細(xì)胞體外培養(yǎng)基中添加外源物質(zhì)的研究主要集中在外源物質(zhì)對FSH 和LH 分泌量的影響。 添加不同的外源物質(zhì)對FSH 和LH 的作用不同， 主要分為兩大類： 一類是促進(jìn)FSH 和LH 分泌，包括GnRH 激動劑戈那瑞林［23］、瘦素［24-27］、中藥［28］、雌二醇［29］、甲基-β-環(huán)糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）［30］、蜂花粉［31］等；另一類是抑制FSH 和LH 分泌，如GnRH 拮抗劑Antarelix［32］、脂聯(lián)素［33］和阿片肽類物質(zhì)［34］等。

5.1 促進(jìn)Gn 分泌的物質(zhì)及作用機(jī)理

GnRH 激動劑戈那瑞林是一種人工合成的GnRH 類似物， 通過影響下丘腦-垂體的功能，促進(jìn)動物的垂體前葉釋放FSH 和LH。 王文華［23］研究表明， 在體外培養(yǎng)腺垂體細(xì)胞體系中添加戈那瑞林，可使FSH 和LH 分泌量顯著提高。

瘦素屬于肥胖基因的蛋白產(chǎn)物， 動物繁殖發(fā)育過程中體內(nèi)能量平衡和內(nèi)分泌功能受到瘦素的調(diào)控。 黃荷鳳［24］推測瘦素促進(jìn)GnRH 分泌的傳導(dǎo)機(jī)制是通過突觸系統(tǒng)影響GnRH 的分泌。 體外培養(yǎng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 瘦素可以直接促進(jìn)動物腺垂體分泌LH 和FSH［25-27］。

補(bǔ)腎助孕方是一服由多種中藥組成的臨床藥方， 對體外培養(yǎng)的腺垂體細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用， 能顯著提高大鼠腺垂體細(xì)胞FSH 和LH 分泌水平［28］。

雌二醇是一種重要的性類固醇激素， 可促進(jìn)FSH 和LH 的分泌， 通過激活腺苷酸環(huán)化酶/環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A 通路，磷脂酶C/肌醇1，3，5-三磷酸/蛋白激酶C 通路和Ca2+/鈣調(diào)蛋白/CaM 依賴性蛋白激酶Ⅱ通路誘導(dǎo)FSHβ 和LHβ的表達(dá)，從而促進(jìn)FSH 和LH 的合成和分泌。 轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)， 雌二醇可以顯著上調(diào)草魚垂體細(xì)胞中28 個基因的表達(dá)， 這些基因參與了生殖、性腺發(fā)育和中央神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等多種生物學(xué)功 能［29］。

MβCD 也可以刺激腺垂體細(xì)胞激素的分泌，具有激活生育和生殖功能的作用。 在哺乳動物的原代培養(yǎng)腺垂體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MβCD 可誘導(dǎo)LH 釋放。 研究表明，利用10-2mol/L 的MβCD 刺激牛垂體前葉細(xì)胞，可以促進(jìn)LH 和FSH 的分泌［30］。

蜂花粉是一種獨(dú)特的營養(yǎng)添加劑， 通過下丘腦-垂體-性腺軸發(fā)揮作用。 公雞體內(nèi)和體外腺垂體細(xì)胞的培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蜂花粉可以促進(jìn)FSH 和LH 的分泌，從而改善繁殖性能［31］。

以上研究表明，在體外培養(yǎng)條件下，激素、中藥、糖類等均可刺激腺垂體細(xì)胞分泌Gn。

5.2 抑制Gn 分泌的物質(zhì)及作用機(jī)理

Antarelix 是 一 種GnRH 拮 抗 劑， 通 過 與GnRH 受體結(jié)合，抑制Gn 的釋放。 Bellmann 等［32］研究表明， 通過Antarelix 處理的腺垂體細(xì)胞，其LH 分泌水平顯著下降。

脂聯(lián)素是成熟脂肪細(xì)胞分泌的一種脂肪因子， 通過活化AMPK 途徑抑制與GnRH 釋放相關(guān)的上游信號kisspeptin1（KISS1）基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制GnRH 分泌。張凌齊［33］研究表明，脂聯(lián)素可能經(jīng)脂聯(lián)素受體介導(dǎo)， 通過GnRH 受體或直接對腺垂體細(xì)胞FSH 和LH 的分泌起抑制性調(diào)節(jié)作用。

阿片肽類物質(zhì)直接作用于腺垂體細(xì)胞，對Gn分泌有一定的抑制作用，進(jìn)而抑制LH 的分泌。 由于腺垂體細(xì)胞上有阿片肽受體，β-內(nèi)啡肽可通過阿片肽受體介導(dǎo)對LH 分泌的抑制作用［34］。

綜上所述， 外源物質(zhì)的添加對于FSH 和LH分泌的影響主要是通過下丘腦-垂體-性腺軸進(jìn)行調(diào)控，通過GnRH 影響FSH 和LH 的分泌。

6 小結(jié)與展望

近年來， 隨著對腺垂體細(xì)胞的研究越來越廣泛和深入，F(xiàn)SH、LH 等生殖激素的分泌機(jī)理也逐漸被揭示。不斷優(yōu)化腺垂體細(xì)胞體外培養(yǎng)條件，建立完善的腺垂體細(xì)胞體外培養(yǎng)體系， 在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步明晰外源物質(zhì)促進(jìn)腺垂體細(xì)胞增殖及影響Gn 分泌的機(jī)理，對于人類生殖疾病研究及家畜繁殖性能提升具有重要意義。