石玉節(jié)，柴貝貝，張彥昕

（鄭州賽科藥業(yè)科技有限公司，河南 鄭州 450000）

變形桿菌是人和動物的一種常見條件致病菌，以普通變形桿菌（Proteus vulgaris）和奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）最為常見［1］。 變形桿菌可引起腹瀉、腎盂腎炎、尿道炎、腦膜炎、菌血癥等疾病，嚴重時導(dǎo)致死亡［2-4］。 摩氏摩根菌（Morganella morganii）為兼性厭氧的革蘭陰性菌，是一種條件致病菌，可引起腹瀉以及傷口和尿道感染，嚴重時可引起菌血癥［5］。 近些年，變形桿菌和摩氏摩根菌的臨床分離率越來越高， 且很多臨床分離菌株都呈現(xiàn)出較強的耐藥性［6］。 攜帶介導(dǎo)對碳青酶烯類抗菌藥物耐藥的blaNDM基因的“超級耐藥菌”的出現(xiàn)，使得被稱為人類治療革蘭陰性菌感染“最后一道防線” 的碳青酶烯類抗菌藥物無法發(fā)揮較好的治療作用， 對人類健康和公共衛(wèi)生安全造成了嚴重威脅［7］，也對畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。 流行病學(xué)調(diào)查報告顯示，blaNDM基因主要在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床上的克雷伯菌和大腸桿菌中傳播［8］，關(guān)于分離出攜帶blaNDM基因的摩氏摩根菌報道較少。

2021 年11 月， 廣東省某鴨場的部分鴨只開始發(fā)病，初期病鴨精神沉郁、羽毛凌亂，并排出黃綠色水樣稀糞，后期發(fā)病鴨只陸續(xù)死亡。為確定引起病鴨死亡的細菌性病原種類， 筆者從發(fā)病鴨場采集病料進行病原菌分離培養(yǎng)及鑒定； 在確定病原菌種屬的基礎(chǔ)上， 對分離菌株進行抗菌藥物敏感性試驗和NDM 耐藥基因檢測，并評價單味中藥對分離菌株的體外抑菌效果， 篩選對分離菌株具有明顯抑菌作用的中藥， 以期為該類疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

肝臟、 脾臟等病料樣本采集自廣東省某鴨場的發(fā)病鴨只。

1.1.2 主要試劑及受試藥物

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、沙門志賀菌屬（SS）瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，南京建成生物科技有限公司產(chǎn)品；革蘭染液試劑盒，索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；細菌生化微量鑒定管，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PCR 試驗相關(guān)試劑，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

13 種藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。 野菊花、大黃、金銀花、連翹、苦參、辣木、駱駝刺、枇杷葉、桑葉、黃柏、防風(fēng)、射干、桔梗、博落回，均購自河南省禹州市永銘藥業(yè)有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

SW-CJ-1F 型超凈工作臺， 蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；LS-50LD 型立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；LI-9272 型恒溫培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PA43 BIO型光學(xué)顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司產(chǎn)品；DYY-6D 型電泳儀， 北京市六一儀器廠產(chǎn)品；A050911-014 型UVP 凝膠成像系統(tǒng)，美國思博明科學(xué)器材公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng)

將灼燒過的剪刀烙烤病變組織表面， 用剪刀剪開組織， 手持灼燒過的接種環(huán)伸入切口輕輕轉(zhuǎn)動后取出， 分別于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SS 瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h； 挑取不同形態(tài)的單個菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)8 h； 劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng)， 直至培養(yǎng)基上出現(xiàn)單一菌落。

1.2.2 革蘭染色鏡檢

從長有單一菌落的平板培養(yǎng)基上， 無菌挑取單個菌落，使用革蘭染色試劑盒進行染色，光鏡下觀察細菌形態(tài)、排列方式及染色特征。

1.2.3 生化鑒定

在無菌環(huán)境下， 使用接種環(huán)挑取純化培養(yǎng)后的單個菌落，接種于生化微量鑒定管中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀察試驗結(jié)果。

1.2.4 16S rDNA 序列PCR 擴增及測序分析

采用煮沸法提取分離菌株的基因組DNA。PCR 擴增采用細菌16S rDNA 序列通用引物，上游引 物 （rmtc-F） 序 列：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3， 下游引物（rmtc-R） 序列：5′-AAGGAGGTGAGCCAGCCGCA-3′，預(yù)期擴增產(chǎn)物大小1 500 bp。 PCR 反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA 模板3 μL，上、下游引物各0.5 μL。 PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94℃變性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s， 共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。 反應(yīng)結(jié)束后，取6 μL PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性擴增產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。

1.2.5 基于16S rDNA 的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

在NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫中， 將分離菌株的16S rDNA 測序結(jié)果與已公布的細菌16S rDNA序列進行BLAST 比對； 根據(jù)比對結(jié)果用DNAStar軟件進行同源性分析， 并使用Mega-X 軟件中鄰接法（Neighbor-Joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹， 通過分離菌株的同源性分析及在進化樹上的分支確定其對應(yīng)種屬。

1.2.6 抗菌藥物敏感性試驗

對分離純化的菌株進行抗菌藥物敏感性試驗，參照K-B 紙片擴散法，結(jié)果參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推薦的抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準進行耐藥、中介、敏感的結(jié)果判定。

1.2.7 NDM 耐藥基因檢測

采用PCR 法檢測10 種NDM 耐藥基因在分離菌株中的分布情況。 目的基因引物序列參照相關(guān)文獻設(shè)計［9-10］，引物序列及預(yù)期擴增產(chǎn)物長度見表1。 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 以提取的分離菌基因組DNA 為模板，不同耐藥基因?qū)?yīng)不同的引物，參照“1.2.4”項下的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行PCR 擴增。 反應(yīng)結(jié)束后，取擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并觀察記錄結(jié)果。

表1 10 種NDM 耐藥基因檢測所用引物序列信息

1.2.8 中藥體外抑菌試驗

1.2.8.1試驗菌液及單味中藥藥液制備

菌液制備： 無菌挑取分離菌單個純菌落于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～12 h。 用普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)液，使菌液濃度達到1×107CFU/mL，備用。

單味中藥液制備：采用水煎煮沸法制備試驗所需所有藥材的中藥藥液，每種中藥各稱取60 g，水煎2 次，合并2 次濾液，濃縮至藥材與藥液比1∶1，使中藥藥液終濃度為1 g/mL，高壓蒸氣滅菌30 min，4 ℃保存，備用。

1.2.8.2 最小抑菌濃度（MIC）的測定

采用肉湯二倍稀釋法測定各單味中藥對分離菌株的MIC。 如果藥液本身透明， 則直接判定結(jié)果；若藥液顏色較深，在培養(yǎng)結(jié)束后無法直接觀察結(jié)果， 則使用接種環(huán)挑取每孔培養(yǎng)液在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24 h， 以無菌生長的最低稀釋度為MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離及革蘭染色鏡檢結(jié)果

從病變組織中分離出2 株具有鑒定意義的菌株，將2 株分離菌株分別命名為SK1、SK2。 2 株菌在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)圓形、灰白色、中央突起、表面光滑的單個菌落；SK1 株在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、扁平、半透明、表面光滑的菌落，在SS 瓊脂培養(yǎng)基上為半透明、中央黑色或整個菌落都呈黑色的圓形、 扁平菌落；SK2 株在SS瓊脂培養(yǎng)基及麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上均為無色菌落。 革蘭染色鏡檢顯示，2 株分離菌株均為革蘭陰性菌，其形狀以短桿狀為主，兩端鈍圓，多數(shù)為中等大小。

2.2 生化鑒定試驗結(jié)果

生化鑒定試驗結(jié)果見表2，根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊（第八版）》，SK1 株的鑒定結(jié)果與奇異變形桿菌基本相符，SK2 株的鑒定結(jié)果符合摩氏摩根菌的生化特性。

表2 分離菌株SK1、SK2 的生化鑒定結(jié)果

2.3 16S rDNA 序列的PCR 擴增結(jié)果

如圖1 所示，SK1 株和SK2 株的PCR 擴增產(chǎn)物大小均在1 500 bp 左右，獲得的目的條帶單一、清晰，片段與預(yù)期擴增片段大小相符。

圖1 分離菌株的16S rDNA 序列PCR 擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

2.4 16S rDNA 序列同源性分析及進化樹的構(gòu)建

通過使用MegAlign 軟件比較分析測序獲得的SK1 株、SK2 株16S rDNA 序 列 與GenBank 中已公布的細菌16S rDNA 序列的同源性，判定2 株菌的種屬。 由圖2 可知，分離株SK1 與20 株參考菌株的16S rDNA 序列進行比對，同源性為93.4%～99.6%， 與美國人體糞便來源Proteus mirabilis 分離株（GenBank 登錄號：JX006386.1）、中國南京市黑水蠅幼蟲體內(nèi)Proteus mirabilis 分離株（Gen-Bank 登錄號：OK053814）同源性最高，達99.6%，因此， 將SK1 株鑒定為奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）； 分離株SK2 與20 株參考菌株的16S rDNA 序列進行比對， 同源性為93.7%～99.2%，與中國云南省動物糞便來源Morganella morganii 分離株（GenBank 登錄號：KC456528）、荷蘭微生物實驗室Morganella morganii 分離株 （GenBank 登錄號：KJ626253.1）同源性最高，達99.2%，因此，將SK2 株鑒定為摩氏摩根菌（Morganella morganii）。

圖2 分離菌株的16S rDNA 序列同源性比對分析

對SK1 株、SK2 株以及GenBank 中收錄的20株參考菌株的16S rDNA 序列繪制系統(tǒng)進化樹。由圖3 可知，22 株細菌的16S rDNA 序列在進化上分為兩大支，SK1 株與中國南京市黑水蠅幼蟲體內(nèi)Proteus mirabilis 分 離 株 （GenBank 登 錄 號：OK053814） 屬于同一分支，SK2 株與中國云南省動物糞便來源Morganella morganii 分離株（Gen-Bank 登錄號：KC456528）屬于同一分支，遺傳關(guān)系最為密切。

圖3 基于細菌16S rDNA 構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

2.5 抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果

分離菌株的抗菌藥物敏感性結(jié)果見表3。 由表3 可知，SK1 株對新霉素、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、環(huán)丙沙星敏感，對其余8 種抗菌藥物耐藥；SK2 株對慶大霉素、卡那霉素、新霉素、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮敏感，對多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、氟苯尼考、多黏菌素B 耐藥，環(huán)丙沙星和左氧氟沙星中介。

表3 分離菌SK1 株、SK2 株的抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果 單位：mm

2.6 NDM 耐藥基因檢測結(jié)果

對分離菌株SK1、SK2 進行10 種NDM 耐藥基因的PCR 檢測， 結(jié)果顯示，SK2 株檢測出blaNDM-1基因， 其他9 種NDM 耐藥基因菌未檢出；SK1 株10 種NDM 耐藥基因均未檢出。

2.7 單味中藥對分離菌株的MIC

單味中藥對2 株分離菌的體外抑菌效果見表4。由表4 可知，博落回對SK1 株的抑菌效果最強，MIC 為3.906 mg/mL； 其次是大黃和金銀花，MIC為31.25 mg/mL； 然后是苦參和連翹，MIC 分別為125、250 mg/mL；野菊花、駱駝刺、枇杷葉和射干的MIC 均為500 mg/mL。 連翹對SK2 株的抑菌效果最強，MIC 為3.906 mg/mL；其次為博落回，MIC 為7.812 5 mg/mL；金銀花的MIC 為15.625 mg/mL；大黃、駱駝刺的MIC 為31.25 mg/mL；辣木的MIC 為62.5 mg/mL；苦參、射干的MIC 為125 mg/mL；野菊花的MIC 為250 mg/mL； 枇杷葉、 桑葉、 防風(fēng)的MIC 為500 mg/mL。

表4 中藥對分離菌SK1 株、SK2 株的MIC 測定結(jié)果 單位：mg/mL

3 討論

奇異變形桿菌存在于被污染的水源、 糞肥和土壤中，對人和動物都具有感染性。在畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域， 奇異變形桿菌引起的感染是近些年多發(fā)的急性細菌性傳染病，發(fā)病主要集中家禽中，鴨感染奇異變形桿菌的報道較為少見［11］。 本研究分離的奇異變形桿菌SK1 株，對新霉素、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、環(huán)丙沙星敏感，此結(jié)果與近些年報道的醫(yī)源、 動物源奇異變形桿菌藥物敏感性研究結(jié)果相似［12-14］。 有研究報道，兔源奇異變形桿菌對環(huán)丙沙星高度敏感［15］，但也有報道稱人源奇異變形桿菌對環(huán)丙沙星耐藥［16-17］，這種差異可歸因于菌株宿主來源的不同。 張萍等［18］報道狐貍源奇異變形桿菌對頭孢菌素類藥物敏感， 這一結(jié)果與本研究結(jié)果相似， 即鴨源奇異變形桿菌SK1 株對頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢他啶敏感。 楊霞等［19］報道鴨源奇異變形桿菌對頭孢氨芐耐藥， 頭孢氨芐是第一代頭孢菌素類藥物； 本研究中鴨源奇異變形桿菌對頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢他啶敏感，三者均為第三代頭孢菌素類藥物； 提示相同動物來源的奇異變形桿菌對同類藥物的敏感性差異可能與藥物代次有關(guān)。

摩氏摩根菌屬于腸桿菌科摩根菌屬， 廣泛存在于人和動物的糞便、污水、土壤中，在機體免疫力低下時可條件性致病， 且該菌的天然耐藥性嚴重［20］。近年來，有很多關(guān)于摩氏摩根菌引起人和多種動物疾病的相關(guān)報道， 甚至可引起人和動物的死亡［21］。目前有摩氏摩根菌引起烏魚、中華鱉、牛、豬、雞、兔等動物感染的報道［22］，但是關(guān)于從鴨體內(nèi)分離出摩氏摩根菌報道相對較少。 本研究分離出的摩氏摩根菌SK2 株對慶大霉素、卡那霉素、新霉素、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮敏感，對多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、氟苯尼考、多黏菌素B 耐藥， 這一結(jié)果與文獻報道的鳀魚源摩氏摩根菌對抗菌藥物的敏感性檢測結(jié)果相似［23］；并且該菌株檢測出blaNDM-1耐藥基因，說明該鴨場存在碳青霉烯類抗菌藥物耐藥性傳播和擴散的風(fēng)險。

單味中藥體外抑菌結(jié)果顯示， 博落回對奇異變形桿菌SK1 株的抑菌效果最強，大黃、金銀花次之；連翹對摩氏摩根菌SK2 株的抑菌效果最強，其次為博落回和金銀花。 其他中藥對SK1 株和SK2株的體外抑菌效果不如以上中藥理想。 此結(jié)果可為治療鴨源奇異變形桿菌和摩氏摩根菌感染參考依據(jù)。但本研究僅進行了體外試驗，中藥在進入動物體內(nèi)是否能對上述2 種菌發(fā)揮有效的抑制效果，還需進一步試驗驗證。

4 結(jié)論

引起該鴨場鴨群發(fā)病的主要病原菌為奇異變形桿菌和摩氏摩根菌，可使用新霉素、頭孢菌素類抗菌藥物及中藥博落回、 連翹對患病鴨只進行治療。