張博文，司俊飛，張振杰，郭嘉棟，陳 榮，赫永強，余復(fù)昌，齊 萌，2

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000）

隱孢子蟲（Cryptosporidium）是引起人和動物腹瀉的常見腸道寄生原蟲之一， 多通過飲水或食物進行傳播［1］。 成年綿羊感染隱孢子蟲后，一般無明顯臨床癥狀； 羔羊感染隱孢子蟲后， 可引起腹瀉、脫水、消化不良、增長緩慢等臨床癥狀［2］。 目前，已命名至少45 個隱孢子蟲蟲種，常見感染羊的隱孢子蟲有微小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）、泛在隱孢子蟲（C.ubiquitum）和肖氏隱孢子蟲（C.xiaoi），其中，微小隱孢子蟲和泛在隱孢子蟲是人獸共患隱孢子蟲蟲種［3］。

在我國開展的調(diào)查結(jié)果顯示， 綿羊隱孢子蟲感染率為0.41%（2/489）～36.36%（36/99）， 以新疆維吾爾自治區(qū)、寧夏回族自治區(qū)、吉林省和北京市的綿羊隱孢子蟲感染率較高， 分別為36.36%（36/99）、33.75%（81/240）、32.86%（23/70） 和29.69%（19/64）；以肖氏隱孢子蟲為優(yōu)勢感染蟲種，泛在隱孢子蟲和微小隱孢子蟲次之；以＜3 月齡羔羊更易感染隱孢子蟲［2，4-5］。

研究發(fā)現(xiàn)，微小隱孢子蟲至少存在21 個亞型家族， 不同宿主之間微小隱孢子蟲的亞型分布具有一定差異，其中Ⅱa 與Ⅱd 亞型家族可感染人和多種動物，Ⅱc 和Ⅱe 則僅感染人［6］。我國綿羊感染的微小隱孢子蟲亞型主要為Ⅱd 亞型家族， 同時也發(fā)現(xiàn)少數(shù)感染Ⅱa 亞型家族［7-9］。 該研究結(jié)合顯微鏡觀察和分子生物學(xué)技術(shù)， 檢測新疆南疆某規(guī)?；B(yǎng)殖場腹瀉羔羊隱孢子蟲感染情況， 解析其基因亞型分布特點， 以期為我國新疆羊源隱孢子蟲的致病性和遺傳進化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 腹瀉羔羊糞便樣本的采集

2023 年4 月，在新疆南疆某規(guī)?；d羊養(yǎng)殖場，采用一次性手套經(jīng)直腸采集4 個品種1 月齡以內(nèi)腹瀉羔羊糞便樣本共60 份，分別置于潔凈自封袋中，標記信息后置4 ℃冷藏箱，送至實驗室，4 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑與儀器

奧林巴斯CX31 顯微鏡， 日本Olympus 公司產(chǎn)品；A600 型PCR 儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-7C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及JY 系列電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；糞便全基因組DNA 提取試劑盒，OMEGA 公司產(chǎn)品；2×EasyTaq PCR Super Mix（+dye）和DL 2 000 Marker，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 隱孢子蟲卵囊顯微鏡觀察

參考李治國等［10］報道的方法，采用飽和蔗糖溶液漂浮法檢查糞便樣本中的隱孢子蟲卵囊。 取1～2 g 綿羊糞便樣本于50 mL 燒杯中，加入30 mL蒸餾水充分攪拌均勻，經(jīng)60 目篩網(wǎng)過濾至50 mL離心管中，3 000 r/min 離心2 min；棄去上清液，分別于離心管沉淀物中加入20 mL 飽和蔗糖溶液，充分攪拌均勻后，3 000 r/min 離心3 min； 吊環(huán)蘸取表層液膜置載玻片上，加蓋玻片，置普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 腹瀉羔羊糞便樣本DNA 的提取

取約200 mg 糞便樣本分別置于2 mL 離心管內(nèi)，使用糞便全基因組DNA 提取試劑盒，按照操作流程提取糞便樣本中的DNA， 每份樣本提取200 μL DNA，置于-20 ℃保存。

1.5 隱孢子蟲SSU rRNA 基因和微小隱孢子蟲gp60 基因的PCR 擴增與電泳

參照文獻［11］設(shè)計隱孢子蟲SSU rRNA 基因序列引物，對所有DNA 樣本進行PCR 擴增，鑒定隱孢子蟲種屬；參照文獻［12］設(shè)計隱孢子蟲gp60基因序列引物， 對鑒定為微小隱孢子蟲的樣本進行基因亞型鑒定； 引物均由蘇州金維智生物科技有限公司合成， 引物序列見表1。 隱孢子蟲SSU rRNA 基因和微小隱孢子蟲gp60 基因的PCR 擴增均按照25 μL 反應(yīng)體系進行，各組分分別為：2×EasyTaq PCR Super Mix（+dye）12.5 μL，上、下游引物各0.3 μL，雙蒸水10.9 μL，糞便DNA 模板1 μL。

表1 隱孢子蟲SSU rRNA 基因和gp60 基因序列信息

基于隱孢子蟲SSU rRNA 基因位點， 兩輪PCR 擴增條件均為：預(yù)變性94 ℃5 min；變性94 ℃30 s，退火55 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，35 個循環(huán)；再延伸72 ℃5 min。每次PCR 擴增時，以塔里木大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實驗室保存的牛源安氏隱孢子蟲（C.andersoni）DNA 樣本為陽性對照， 以雙蒸水為陰性對照。 基于微小隱孢子蟲gp60 基因位點，兩輪PCR 擴增反應(yīng)條件均為：預(yù)變性94 ℃5 min；變性94 ℃45 s，退火58 ℃45 s，延伸72 ℃1 min，35個循環(huán)；再延伸72 ℃10 min。每次PCR 擴增時，以塔里木大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實驗室保存的牛源微小隱孢子蟲DNA 樣本為陽性對照，雙蒸水為陰性對照。 PCR 反應(yīng)結(jié)束后，每份樣本分別取5 μL 擴增產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳和觀察。

1.6 隱孢子蟲種屬/基因亞型序列測定和比對分析

基于SSU rRNA 基因和gp60 基因位點進行PCR 擴增，將PCR 擴增呈陽性的產(chǎn)物均委托蘇州金維智生物科技有限公司進行雙向測序和序列拼接。 利用NCBI 中的BLAST，對測序獲得的隱孢子蟲序列和微小隱孢子蟲基因亞型序列進行同源序列搜索，分別下載同源性較高的參考序列。對所獲隱孢子蟲種屬/基因亞型序列和下載的參考序列，采用MEGA 7.0 軟件進行比對分析，鑒定隱孢子蟲的種類和微小隱孢子蟲的基因亞型。

1.7 微小隱孢子蟲基因亞型的種系發(fā)育進化樹構(gòu)建和分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中，分別下載不同地區(qū)和不同宿主源微小隱孢子蟲基因亞型序列， 結(jié)合該研究所獲微小隱孢子蟲基因亞型序列，采用MEGA 7.0軟件對所有序列進行比對分析， 以鄰接算法（Neighbor-Joining，NJ） 構(gòu)建微小隱孢子蟲基因亞型種系發(fā)育進化樹， 進化樹的可靠性采用Bootstrap 分析進行檢測。 根據(jù)種系發(fā)育樹形成的聚類和分支， 分析微小隱孢子蟲不同基因亞型之間的遺傳進化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 隱孢子蟲卵囊的形態(tài)學(xué)觀察與種類初步鑒定

普通光學(xué)顯微鏡下（400×）觀察可見，飽和蔗糖溶液中隱孢子蟲卵囊呈圓形、 近圓形或不規(guī)則圓形，淡藍紫色，周邊有亮綠色折光帶，卵囊大小約5 μm×5 μm（見圖1）。 60 份羔羊腹瀉糞便樣本中有38 份樣本中觀察到隱孢子蟲卵囊，陽性率為63.33%（38/60）； 結(jié)合宿主年齡和形態(tài)學(xué)觀察，初步鑒定該次調(diào)查所獲蟲種為微小隱孢子蟲。

圖1 普通光學(xué)顯微鏡下隱孢子蟲卵囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)（400×）

2.2 隱孢子蟲SSU rRNA 基因PCR 擴增結(jié)果及種屬鑒定

基于隱孢子蟲SSU rRNA 基因位點，60 份腹瀉羔羊糞便DNA 樣本中有52 份成功擴增約587 bp的條帶，與目的條帶相符（見圖2）。

圖2 隱孢子蟲SSU rRNA 基因的PCR 擴增結(jié)果

經(jīng)PCR 擴增可知，腹瀉羔羊的隱孢子蟲的陽性率為86.67%（52/60），其中，杜泊羊、澳湖羊、澳洲白羊、 湖羊羔羊的隱孢子蟲陽性率分別為85.71%（6/7）、89.29%（25/28）、100%（8/8）、76.47%（13/17）（見表2）。 52 份隱孢子蟲陽性樣本均成功雙向測序，經(jīng)序列比對分析，所獲隱孢子蟲序列均與我國大慶市奶牛源微小隱孢子蟲 （GenBank 序列登錄號：OQ456120） 和法國山羊羔羊源微小隱孢子蟲（GenBank 序列登錄號：OQ938540）序列同源性為100%，均鑒定為微小隱孢子蟲（見表2）。

表2 某規(guī)?；d羊養(yǎng)殖場腹瀉羔羊隱孢子蟲感染情況

2.3 微小隱孢子蟲gp60 基因PCR 擴增結(jié)果及基因亞型鑒定

基于gp60 基因位點對52 份微小隱孢子蟲陽性樣本進行PCR 擴增，49 份樣本成功擴增出約850 bp 大小的條帶，與目的片段相符（見圖3），有3 份樣本未能擴增成功。

圖3 隱孢子蟲gp60 基因的PCR 擴增結(jié)果

49 份微小隱孢子蟲陽性樣本均成功雙向測序， 經(jīng)序列比對分析，49 條微小隱孢子蟲序列均與我國安徽山羊源微小隱孢子蟲亞型ⅡdA19G1（GenBank 序列登錄號：MH049734）和陜西奶山羊源微小隱孢子蟲亞型ⅡdA19G1（GenBank 序列登錄號：KT235713）序列的同源性為100%，均鑒定為亞型ⅡdA19G1（見表3、圖4）。

圖4 基于隱孢子蟲基因亞型構(gòu)建的種系發(fā)育進化樹

表3 微小隱孢子蟲gp60 基因PCR擴增結(jié)果及基因亞型鑒定

2.4 微小隱孢子蟲基因亞型種系進化分析

根據(jù)微小隱孢子蟲gp60 基因序列構(gòu)建的種系發(fā)育進化樹可知， 微小隱孢子蟲不同亞型家族形成不同的進化支，Ⅱf、Ⅱg、Ⅱi 和Ⅱq 亞型家族聚類形成一個進化支， 與其他亞型家族形成不同分支。 該研究所獲綿羊源微小隱孢子蟲基因亞型ⅡdA19G1 與科威特人源微小隱孢子蟲基因亞型ⅡdA18G1，瑞典人源、我國牛源、山羊源微小隱孢子蟲基因亞型ⅡdA19G1，葡萄牙人源微小隱孢子蟲基因亞型ⅡdA21G1，波蘭牛源微小隱孢子蟲基因亞型ⅡdA23G1，英國人源微小隱孢子蟲基因亞型ⅡdA24G1 等序列同處于一個亞群進化支；與Ⅱt亞型家族形成一個亞群， 而與其他亞型家族形成不同的亞群分支。

3 討論

世界范圍內(nèi)，綿羊感染隱孢子蟲較普遍，以羔羊更易感， 隨宿主年齡增長而隱孢子蟲感染率呈下降趨勢。 至少有14 個隱孢子蟲種/基因型可感染羊，在歐洲，綿羊以微小隱孢子蟲為優(yōu)勢感染蟲種；在大洋洲、亞洲和非洲，肖氏隱孢子蟲為綿羊的優(yōu)勢感染蟲種；而在北美洲和南美洲，泛在隱孢子蟲為綿羊的優(yōu)勢感染蟲種。上述研究結(jié)果提示，不同地理環(huán)境分布的綿羊感染隱孢子蟲蟲種/基因型存在一定的適應(yīng)性遺傳分布［13-14］。

在以色列的調(diào)查顯示，31 份2～21 日齡腹瀉綿羊羔羊的糞便樣本中，通過PCR 法檢測，有30份呈隱孢子蟲感染陽性， 感染率為96.77%（30/31），均為微小隱孢子蟲［15］；在羅馬尼亞的調(diào)查顯示，175 份＜21 日齡羔羊的腹瀉糞便樣本中， 通過顯微鏡觀察檢測， 有24 份呈隱孢子蟲感染陽性，感染率為13.71%（24/175），鑒定出3 種隱孢子蟲，以微小隱孢子蟲為優(yōu)勢感染蟲種（20/24），同時發(fā)現(xiàn)泛在隱孢子蟲（2/24）和肖氏隱孢子蟲（2/24）［16］。該研究通過顯微鏡觀察， 發(fā)現(xiàn)腹瀉羔羊隱孢子蟲的陽性率為63.33%（38/60）；通過PCR 法檢測，發(fā)現(xiàn)腹瀉羔羊隱孢子蟲的陽性率為86.67%（52/60），均為微小隱孢子蟲；調(diào)查結(jié)果與上述報道相一致，表明微小隱孢子蟲是感染新生羔羊的主要隱孢子蟲蟲種，可引起羔羊腹瀉。

研究發(fā)現(xiàn)， 感染綿羊的微小隱孢子蟲亞型主要是Ⅱa 和Ⅱd 亞型，其基因亞型呈現(xiàn)多樣遺傳分布特征。在西班牙，Díaz 等［17］報道無腹瀉癥狀綿羊羔羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡaA15G2R1 和ⅡaA14G2R1；在希臘，Papanikolopoulou 等［18］調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 腹瀉綿羊羔羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡaA15G2R1、 ⅡaA20G1R1、 ⅡdA15G1 和ⅡdA16G1；在以色列，Tako 等［15］報道腹瀉綿羊羔羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡaA15G1R1、ⅡaA15G2R1、 ⅡaA16G1R1、 ⅡaA16G2R1、 ⅡaA17G1R1、 ⅡaA17G2R1、 ⅡaA19G2R1、 ⅡaA21G1R1、ⅡdA20G1 和ⅡdA22G1；在羅馬尼亞，Imre 等［16］報道腹瀉綿羊羔羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡaA16G1R1、ⅡaA17G1R1、ⅡdA20G1、ⅡdA24G1 和ⅡdA22G2R1；在波蘭，Kaupke 等［19］報道綿羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡaA17G1R1；在巴西，Paz 等［20］報道綿羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡaA15G2R1。在我國，Mi 等［4］報道北京市、上海市、山東省、吉林省等地綿羊感染的微小隱孢子蟲亞型有ⅡaA15G2R1、ⅡaA17G2R1、ⅡdA15G1、ⅡdA18G1、ⅡdA19G1；Qi 等［8］報道新疆維吾爾自治區(qū)綿羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡdA15G1。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 某規(guī)?；瘓龈篂a羔羊源微小隱孢子蟲均為ⅡdA19G1，提示綿羊源微小隱孢子蟲具有區(qū)域適應(yīng)性。

4 結(jié)論

該結(jié)果表明，新疆維吾爾自治區(qū)某規(guī)模化綿羊養(yǎng)殖場腹瀉羔羊隱孢子蟲感染率較高，感染蟲種為微小隱孢子蟲， 鑒定出的基因亞型為ⅡdA19G1。調(diào)查結(jié)果為綿羊隱孢子蟲種屬鑒定與遺傳進化研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。