劉 譽，吳錦順，潘 娟

（1.天津國際旅行衛(wèi)生保健中心 天津海關口岸門診部，天津 300450；2.珠海國際旅行衛(wèi)生保健中心 拱北海關口岸門診部，廣東 珠海 519000）

馬巴貝斯蟲是一種血液寄生蟲，可由蜱傳播給馬、驢、騾和斑馬，它感染馬屬動物的紅細胞和淋巴細胞［1］。國外學者通過染色血片檢查、實驗動物分離蟲種和血清學方法檢查，對已發(fā)現(xiàn)的22 例人巴貝斯蟲病例的病原學進行了分析，發(fā)現(xiàn)已知的人巴貝斯蟲是來源于家畜和野生動物的4 種巴貝斯蟲：牛巴貝斯蟲、馬巴貝斯蟲、分歧巴貝斯蟲和田鼠巴貝斯蟲［2］。感染馬巴貝斯蟲后，可引起一種血液原蟲病，通常把它叫作馬巴貝斯蟲病［3-4］。

馬巴貝斯蟲病的臨床癥狀通常表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、黃疸［1，3，5］，病馬較瘦弱。該病可發(fā)生最急性、急性和慢性病例，急性病例特征是高熱、黏膜充血、呼吸脈搏加速［4］，急性病例通常導致持續(xù)的、長期感染［3］，嚴重可導致死亡［4］；慢性病例在臨床上通常呈現(xiàn)非特征性癥狀，如食欲不振，動作遲緩，體重下降，直腸檢查常可發(fā)現(xiàn)脾腫大［4］。最急性病例比較少見，到發(fā)現(xiàn)時病馬已死亡或者瀕臨死亡［5］。馬巴貝斯蟲病廣泛分布于世界各地［6］。

馬巴貝斯蟲為許多進出口馬屬動物國家要求的法檢項目［7-8］，在進出口馬屬動物雙邊協(xié)議中都要求檢測馬巴貝斯蟲。國際動物衛(wèi)生組織將馬巴貝斯蟲病列為B 類動物疾?。?］。在我國，農(nóng)業(yè)部將其定為二類動物疾?。?］。

南非新近調(diào)查證明，馬的巴貝斯蟲病是一種嚴重傳播性疾病，年發(fā)率為1.88%，近10 000 匹馬，兩個蟲種在南非對易感馬的致死率均在10% 以上，有時接近50%。在中國，黑龍江、內(nèi)蒙古、吉林、青海等省發(fā)病較嚴重，平均死亡率為11.9%，嚴重地區(qū)達14.6%［6］。

由于馬巴貝斯蟲危害大，難以根治，對國際馬匹貿(mào)易產(chǎn)生很大影響［8］，因此各國都將該寄生蟲列為重要監(jiān)測的馬病之一。

馬巴貝斯蟲病雖然主要是在馬屬動物之間流行，但人偶爾可能感染，是一種人畜共患病。受感染的機會與蜱蟲叮咬密切相關。因此，到流行地區(qū)旅游或野外作業(yè)的人群有被感染的危險。切除脾臟者更易感染。隨著人與馬屬動物接觸的機會越來越多，人感染巴貝斯蟲的報道也越來越多。人感染巴貝斯蟲的癥狀主要有發(fā)冷，發(fā)熱，精神不振，厭食，黃疸，溶血性貧血等癥狀［2］。

馬巴貝斯蟲感染馬屬動物后因不產(chǎn)生明顯的臨床癥狀，因此主要依靠實驗室檢測進行診斷。目前主要有病原學、血清學、分子生物學和生物學試驗等檢測技術(shù)。

1 鏡檢法

馬巴貝斯蟲的感染可以通過血液或組織染色涂片的蟲體檢查來診斷，如姬姆薩染色［9］，通常能獲得最好的效果。采用厚膜血液涂片技術(shù)，有時也可查到蟲體［10］。取一小滴血液置于潔凈的載玻片上，自然干燥，80℃加熱固定5 min，用5% 姬姆薩染色液染色20～30 min，顯微鏡下觀察結(jié)果。血涂片的方法簡單易行，結(jié)果易于判定，但是其陽性檢出率極低，對于低水平蟲血癥尤為困難［1］。目前，這種方法已經(jīng)較少在實際工作中應用。

2 血清學檢測技術(shù)

在血清學檢測方法中應用較多的為補體結(jié)合試驗、間接免疫熒光試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫膠體金試驗。

2.1 補體結(jié)合試驗（CFT）

Hirato 等［11］最早研究采用CFT 檢測馬巴貝斯蟲。Frerichs 等［12］對CFT 抗原的制備方法進行了研究，其建立的CFT 在一些國家中被作為進口馬檢疫的首選試驗［13］，該方法在蟲血癥高峰期收集抗原，以溶血系統(tǒng)作為指示系統(tǒng)，測定血清效價達1∶5 時為陽性，可以特異性地針對馬巴貝斯蟲進行診斷。由于CFT 的診斷準確性和敏感性較好，因而一直作為國際貿(mào)易指定試驗。CFT 分為常量法［6］和微量法［4，14］。但是，CFT 有3 個問題無法解決：一是存在抗補體反應的血清不能用CFT 檢測，二是與CFT 對照紅細胞抗原發(fā)生反應的血清不能用CFT 檢測，三是因為在經(jīng)典CFT 方法IgG（T）不結(jié)合補體，所以含有特殊IgG（T）抗體的血清可產(chǎn)生假陰性結(jié)果［15］。

2.2 間接免疫熒光試驗（IFA）

間接免疫熒光試驗已成功用于馬巴貝斯蟲鑒別診斷［5，16］。該試驗是將待檢血清從1∶80 依次稀釋為1∶1 280，加于抗原玻片上，再加入熒光素標記的兔抗馬IgG，經(jīng)過孵育和洗滌，在熒光顯微鏡下尋找發(fā)熒光的蟲體。

IFA 較CFT 更早些檢出馬巴貝斯蟲陽性抗體，且持續(xù)檢出抗體的時間比CFT 長，當CFT 檢測已轉(zhuǎn)為陰性時，IFA 仍能檢出為陽性。因此Tenter 等［17］建議CFT 與IFA 試驗結(jié)合使用以便安全鑒別馬巴貝斯蟲感染。

而另一方面，雖然IFA 試驗對強陽性反應的判定較簡單，但對界于弱陽性和陰性反應之間的鑒別，則比較困難，容易誤判。因此，目前IFA 試驗仍是作為CFT 的輔助試驗，用于對發(fā)生抗補體反應的血清的檢測，主要為一些驢血清。而不作為官方試驗或貿(mào)易指定試驗［4］。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA 因其快速、敏感、特異的特點，一直是被作為檢測馬巴貝斯蟲的理想方法進行研究。

最早，Gota［18］和Merkle［19］曾報道采用ELISA 可檢測出實驗感染馬的馬巴貝斯蟲抗體。

1991 年Knowles 等［15］成功地將馬巴貝斯蟲裂殖子抗原1（EMA-1）重組蛋白和單克隆抗體Mab36/133.97［20］應用于競爭ELISA（C-ELISA）。其原理是含有馬巴貝斯蟲抗體的血清與包被的EMA-1 重組蛋白特異地結(jié)合，抑制Mab36/133.97與重組蛋白結(jié)合，從而影響了單抗與結(jié)合物的結(jié)合，導致不產(chǎn)生顏色反應或很少顏色反應。該CELISA 解決了補體結(jié)合試驗存在的3 個問題。用C-ELISA 和CFT 對來自19 個國家的154 份血清進行馬巴貝斯蟲抗體檢測，結(jié)果符合率為94%（144份）。不符合的10 份血清中有5 份經(jīng)免疫沉淀反應證實結(jié)果與C-ELISA 相符。154 份血清中有16份駑巴貝斯蟲（Babesia caballi）CFT 陽性的樣品，經(jīng)C-ELISA 檢測為陰性，這些數(shù)據(jù)表明，C-ELISA 對馬巴貝斯蟲是有特異性的。

Huang 等［21］將編碼馬巴貝斯蟲裂殖子抗原-2（EMA-2t）片段的基因克隆，并在大腸桿菌中高表達為谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶融合蛋白（G-rEMA-2t）。GrEMA-2t 有很好的抗原性。用G-rEMA-2t 做酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）能清楚地區(qū)別開實驗感染馬巴貝斯蟲的馬血清和感染駑巴貝斯蟲的馬血清以及健康馬血清。在感染的急性期和潛伏期（感染后6～244 d）在感染馬巴貝斯蟲的馬體內(nèi)都能檢測到特異性抗體。結(jié)果表明G-rEMA-2t 適合于用作有效的免疫學診斷方法的抗原，因為它們具有高的敏感性、特異性和高的產(chǎn)出量。

Kumar 等［22］曾用馬巴貝斯蟲全裂殖子（WM）抗原做ELISA 試驗，結(jié)果顯示W(wǎng)M 抗原不僅具有針對陰性血清較高預估值且其敏感性最強，而且其它馬病感染的陽性血清包括駑巴貝斯蟲，在ELISA 方法上顯示與WM 抗原無交叉反應，因此該試驗具有免疫學特異性。109 份未知的野外驢/馬血清的抗體滴度用WM 抗原做ELISA 檢測，結(jié)果顯示該方法具有經(jīng)濟、方便、敏感、特異等特點，適合用于野外馬巴貝斯蟲感染血清流行病學的研究。

近年來，日本學者［23-25］研究用馬巴貝斯蟲特異性基因片段產(chǎn)物作為ELISA 抗原檢測馬巴貝斯蟲。通過抽提感染馬巴貝斯蟲的陽性馬的總mRNA，構(gòu)建馬巴貝斯蟲cDNA 文庫，并在噬菌體展示文庫中進行表達，與陽性馬巴貝斯蟲血清進行反應，獲得免疫抗原，并對其進行測序，同NCBI 提供的基因庫進行比對，最終確定該基因來自馬巴貝斯蟲，到目前為止，他們共獲得了2 個新的抗原蛋白，一個大小為82 kd，命名為Be82；一個大小為158 kd，命名為Be158。

以Be82［23］為抗原的ELISA 檢測，可以檢出全部自然感染的陽性馬血清；對實驗感染馬的檢測發(fā)現(xiàn)，可以在感染后12～18 d 檢出。以上的實驗是在小樣本范圍內(nèi)進行的，因而還需進一步的研究予以證實。同時全長的Be82 抗原還存在一個缺陷，它與努巴貝斯蟲存在交叉反應。

在隨后的研究中，研究者［24］對全長的Be82 進行基因缺失克隆，構(gòu)建了5 種不同基因缺失克隆株，逐個進行篩選，發(fā)現(xiàn)236 到381 位氨基酸的基因缺失克隆株產(chǎn)物，與谷光甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合作為抗原包被，進行ELISA 試驗，該試驗具有非常好的特異性和敏感性，不與駑巴貝斯蟲存在交叉反應，可以應用于ELISA 檢測。

Be158 抗 原 是 近 期 新 發(fā) 現(xiàn) 的 抗 原［25］，編 碼Be158 抗原的Be158 基因由1 個3510 核苷酸開放讀碼框組成。用在大腸桿菌中表達的Be158 基因產(chǎn)物作為ELISA 抗原，在小量標本范圍內(nèi)檢測發(fā)現(xiàn)，該抗原具有較好的抗原特異性和敏感性，提示該抗原可以作為血清學診斷用抗原用于馬巴貝斯蟲ELISA 檢測。

2.4 免疫色析法（BeICT）

免疫色析法由于引進免疫膠體金技術(shù)而得到開發(fā)和應用。免疫膠體金技術(shù)［26］是近年來一門新興的實用技術(shù)，它是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金通過靜電與蛋白質(zhì)分子形成牢固結(jié)合，且不影響蛋白質(zhì)的生物特性。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結(jié)合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。

2004 年，Huang 等［27］首先建立了以重組rEMA-2t 抗原［21］為基礎的免疫色析方法，用于快速檢測馬巴貝斯蟲。該方法是一種基于硝酸纖維素膜（NC）的免疫方法。將重組rEMA-2t 抗原與膠體金結(jié)合，用0.05% 聚乙烯乙二醇20 000（PEG）和1% 牛血清白蛋白（BSA）穩(wěn)定和封閉結(jié)合顆粒，用聲處理后，再用0.5%BSA 和0.05%PEG 磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌、離心、懸浮，將結(jié)合物濃度調(diào)節(jié)至520 nm 下吸收值達到5 后，用含有5% 蔗糖10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）稀釋，涂抹在玻璃纖維上，真空干燥過夜。再將重組rEMA-2t 抗原及兔抗rEMA-2t IgG 線性均勻噴涂于NC 的試驗區(qū)和對照區(qū)上，將NC 干燥、封閉、洗滌后，空氣過夜干燥。將NC、吸收墊、結(jié)合墊、樣品墊安置在粘性卡片上一起切割成條。用此條即可檢測馬巴貝斯蟲感染。在樣品墊加入100μl樣品血清后，15 min 內(nèi)就可以觀察到檢測結(jié)果，陽性樣品在檢測區(qū)域可以觀察到一條清晰的沉淀線。用該方法對野外馬血清進行檢測，結(jié)果與ELISA 方法的符合率為96.7%，結(jié)果表明BeICT 是快速、簡便、特異的，不與駑巴貝斯蟲發(fā)生交叉反應。該方法較ELISA 方法更為簡便、快捷，可以發(fā)現(xiàn)一些早期感染和潛伏感染的動物，由于不需要儀器和設備，更適用于野外檢測馬巴貝斯蟲感染。

3 分子生物學檢測技術(shù)

3.1 DNA 探針

目前，敏感而特異的馬巴貝斯蟲的DNA 探針已研究成功［28］。試驗時，從血液中提取寄生蟲DNA，在尼龍膜上點樣，然后用相關的放射性DNA探針檢查。探針法可以檢出一些帶蟲動物，而且在對那些指定出口且要求無寄生蟲感染的馬匹進行檢疫時，可以解決血清學試驗中存在的問題。但因操作方法的局限性，目前不能被廣泛采用。

3.2 聚合酶鏈反應（PCR）方法

PCR 方法已被廣泛應用于實驗室檢測的各個方面。在對馬巴貝斯蟲檢測方法的研究中，PCR 方法針對病原體進行檢測，可以檢出發(fā)病和帶蟲的馬匹，并且其敏感性是ELISA 等試驗無法比擬的，而且其特異性也是較高的，可以準確地與其它梨形蟲進行區(qū)分，因而成為一大研究熱點。當前，PCR 方法選擇擴增的靶序列主要為EMA-1 基因和18s 核糖體RNA。

Farah 等［29］用兩個合成的寡核苷酸引物特異性地擴增馬巴貝斯蟲EMA-1 基因中的819 bpsDNA片段的PCR 方法，對18 份來自埃及不同地區(qū)帶蟲但無馬巴貝斯蟲感染癥狀的馬血清，進行了顯微鏡檢查、間接熒光抗體試驗（IFA）和PCR 試驗。結(jié)果18 份帶蟲馬血清樣品經(jīng)顯微鏡檢查有7 份（38.8%）為陽性、IFA 檢查有9 份（50%）為陽性，而PCR 檢查有14 份（78%）為陽性。從而證明該PCR 是一種可用于常規(guī)檢驗慢性感染馬巴貝斯蟲的有價值的方法，尤其是在低寄生蟲水平。

Nicolaiewsky 等［30］將EMA-1 作為擴增的靶序列，通過巢式PCR 的方法，得到102 bp 的馬巴貝斯蟲特異性片段。

Rampersad 等［31］以18S 核糖體RNA 作為目的序列，研究認為采用巢式PCR 的方法，可以將檢測靈敏度提高50%以上。

Alhassan 等［32］建立了一種單循環(huán)多重PCR 診斷方法，該方法更簡便，可同時檢測馬巴貝斯蟲和駑巴貝斯蟲。它是以18S 核糖體RNA 基因為靶基因，設計相同正義引物和不同的兩套反義引物，在一個反應里，同時進行擴增馬巴貝斯蟲的540 bp 和駑巴貝斯蟲的392 bpDNA 片段。這種方法對馬巴貝斯蟲的檢測靈敏度可以達到0.018 個蟲體。因此，單循環(huán)多重PCR 方法為常規(guī)診斷實驗室和流行病學研究提供了一種區(qū)分馬巴貝斯蟲和駑巴貝斯蟲的敏感、特異、簡便的診斷方法。

4 生物學試驗技術(shù)

4.1 血液再次接種

血清學試驗中可能會遇到假陽性或假陰性反應［33-35］，在這種情況下采用全血接種易感動物進行傳代試驗，盡管煩瑣、成本高，對確定真陽性馬是一項非常有用的技術(shù)。將大量全血（500 ml）接種到易感馬（最好已切除脾的）體內(nèi)，爾后，觀察馬是否有該病的臨床癥狀。采血涂片鏡檢，如果在其紅細胞中檢查到蟲體，即可確診。

另一種方法是讓絕對無蟲的潔凈蜱叮咬可疑動物，然后檢查蜱內(nèi)是否有蟲體存在，或通過蜱再將蟲體傳播給另一個易感動物來進行診斷。

4.2 體外培養(yǎng)

為鑒別帶蟲動物，進行馬巴貝斯蟲體外長期培養(yǎng)，可作為一種補充診斷方法，彌補上述試驗的不足［35-38］。有人從未表現(xiàn)任何明顯蟲血癥的馬的血液，于培養(yǎng)初期即分離出了馬巴貝斯蟲［37，39］。

5 小結(jié)

以上各種方法各有優(yōu)勢，可根據(jù)具體情況采用不同的方法或幾種方法聯(lián)合應用。隨著免疫學和分子生物學的迅猛發(fā)展，研究會更加深入，未來會有更多的先進技術(shù)方法應用于馬巴貝斯蟲的診斷，為畜牧業(yè)和進出口貿(mào)易以及人類的健康發(fā)展創(chuàng)造良好的條件。