梁 爽，連賀強(qiáng)，胡海洋，史曉娟，馬建敏

（新鄉(xiāng)市疾病預(yù)防控制中心，河南 新鄉(xiāng) 453000）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)因其良好的靈敏度和特異性［1］，被廣泛應(yīng)用于傳染病檢測(cè)領(lǐng)域，成為在新型冠狀病毒（SARSCoV-2，以下簡(jiǎn)稱新冠病毒）感染疫情期間重要的防控檢測(cè)手段［2］。該技術(shù)缺點(diǎn)是操作中易受到核酸污染而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果［3］，所以在區(qū)域核酸檢測(cè)［4］期間，因樣本量大、操作不當(dāng)?shù)仍蛞鸬膶?shí)驗(yàn)室核酸污染時(shí)有發(fā)生［5-6］，實(shí)驗(yàn)室只能停用。核酸污染的快速去除對(duì)于實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)緊急檢測(cè)任務(wù)至關(guān)重要，但目前可供參考的方法資料十分有限，且在我們的前期實(shí)踐工作中發(fā)現(xiàn)，徹底去除需要5～7 d（數(shù)據(jù)未發(fā)表）?，F(xiàn)結(jié)合2022 年10 月本實(shí)驗(yàn)室核酸污染的消毒處置過(guò)程，探討一種快速有效的去污染方法。

1 材料

1.1 主要使用儀器

全自動(dòng)核酸提取儀（Zybio EXM3000），熒光定量PCR 儀（杭州博日9600 FQD-96A），高速離心機(jī)（Eppendorf 5425），過(guò)氧化氫空氣消毒機(jī)（浙江泰林FHP3）。

1.2 主要使用試劑

磁珠法核酸提取試劑（西安天隆科技有限公司），新冠病毒熒光定量PCR 試劑盒（圣湘生物科技股份有限公司），核酸去除劑（LEMINSCARE），84 消毒液（北京雅特），7.5% 過(guò)氧化氫消毒液（泰林生物）。

2 方法

2.1 污染發(fā)現(xiàn)與排查

2022 年10 月份區(qū)域核酸檢測(cè)過(guò)程中，檢出的新冠病毒陽(yáng)性數(shù)量突然增加，多為單靶標(biāo)（ORFa/b 或N基因）弱陽(yáng)性，Ct 值在37～40，但同批次檢測(cè)的空白對(duì)照、陰性對(duì)照、內(nèi)質(zhì)控等結(jié)果仍正常?？梢蓸颖臼褂秒p試劑（新啟封）和備用實(shí)驗(yàn)室重新檢測(cè)，兩種試劑結(jié)果一致，全部為陰性。疑似該實(shí)驗(yàn)室核酸污染。

2.2 消毒前采樣

立即開展消毒前的環(huán)境采樣。對(duì)實(shí)驗(yàn)室不同區(qū)域、各物體表面涂抹采樣，共采集25 份樣品，送至備用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)新冠病毒核酸，目的是查找污染部位。

2.3 污染的消毒處置

采樣后立即使用過(guò)氧化氫消毒機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行7.5% 過(guò)氧化氫霧化消毒。分別對(duì)試劑配制區(qū)、核酸提取區(qū)和PCR 擴(kuò)增區(qū)消毒，將房間內(nèi)生物安全柜前擋、離心機(jī)蓋子、核酸提取艙門及PCR 儀蓋子打開，每個(gè)房間（空間40～50 m3）消毒時(shí)間設(shè)置1 h，結(jié)束后密閉房間2 h，進(jìn)行消毒后第一次采樣（方法、數(shù)量同上），然后打開機(jī)械通風(fēng)12 h。

之后，依據(jù)消毒前采樣和消毒后第一次采樣檢測(cè)結(jié)果，使用不同濃度的含氯消毒劑對(duì)污染部位進(jìn)行重點(diǎn)消毒。用濃度5 500 mg/L 的84 消毒液對(duì)核酸提取儀、冰箱內(nèi)部及把手等擦拭2 遍，10 min 后，再用清水擦拭3 遍去除余氯。生物安全柜和核酸提取儀倉(cāng)體內(nèi)部因構(gòu)造問(wèn)題難以擦拭徹底，故再使用自帶紫外線燈照射2 h。較難去除污染的是PCR 儀上樣孔，本研究使用咽拭子蘸取5 500 mg/L 的84 消毒液逐孔反復(fù)擦拭2 遍，再蘸取清水擦拭5 遍以上，最后用核酸去除劑再次噴灑、擦拭，移至通風(fēng)處。其他未檢出陽(yáng)性的儀器、耗材和地面等用2 000 mg/L的84 消毒液擦拭或拖拭。消毒后再次采樣，并打開機(jī)械通風(fēng)12 h。全程時(shí)間不超過(guò)36 h。

2.4 消毒效果驗(yàn)證

消毒全部結(jié)束后，進(jìn)行消毒后第二次采樣檢測(cè)（方法、數(shù)量同上）；同時(shí)使用自制的2 套相同的新冠病毒盲樣質(zhì)控品（每套5 份）在該實(shí)驗(yàn)室和備用實(shí)驗(yàn)室，使用相同試劑分別進(jìn)行檢測(cè)。環(huán)境樣品檢測(cè)陰性，2 個(gè)實(shí)驗(yàn)室的盲樣檢測(cè)結(jié)果一致，表明污染去除，消毒有效。

3 結(jié)果

3.1 消毒前采樣結(jié)果

消毒前采集的25 份樣品，包括操作臺(tái)面、門把手、儀器、生物安全柜、移液器、地面、墻面等各部位，其中6 份單靶標(biāo)（N 基因）或雙靶標(biāo)（ORF1ab 和N 基因）陽(yáng)性，分別是核酸提取儀、PCR 儀和冰箱等。（見表1）。

表1 消毒前后環(huán)境樣品檢測(cè)結(jié)果

3.2 消毒后采樣結(jié)果

使用過(guò)氧化氫消毒后第一次采樣結(jié)果顯示，核酸提取倉(cāng)和PCR 儀模塊仍檢出陽(yáng)性（見表1）；消毒結(jié)束后第二次采樣結(jié)果，25 份環(huán)境樣本全部陰性（見表1）；5 份新冠病毒盲樣在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)Ct值基本一致，且結(jié)果正確，空白對(duì)照、陰性對(duì)照均為陰性，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線（見表2）。表明實(shí)驗(yàn)室可以使用。

表2 5 份新冠病毒盲樣檢測(cè)室間比對(duì)結(jié)果

4 討論

核酸污染難以去除，這是困擾絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)難題。本實(shí)驗(yàn)室在指導(dǎo)和處理基層實(shí)驗(yàn)室去污染過(guò)程中，工作思路上傾向于先找明污染來(lái)源，然后使用過(guò)氧化氫和84 消毒液中的一種，或者兩者聯(lián)合使用，反復(fù)消毒、檢測(cè)，雖然污染最終消除，但所用時(shí)間長(zhǎng)，嚴(yán)重影響工作。為此，本次在前期數(shù)據(jù)（未發(fā)表）的基礎(chǔ)上對(duì)采取措施的時(shí)間、流程和消毒方法上進(jìn)行了整體優(yōu)化，缺憾是因受限于時(shí)間以及現(xiàn)實(shí)條件，未能設(shè)置平行比對(duì)實(shí)驗(yàn)。但該實(shí)驗(yàn)室污染后能夠在36 h 重新啟用，表明整個(gè)流程及方法行之有效。

首先要快速發(fā)現(xiàn)污染，本次實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)同一反應(yīng)板陽(yáng)性數(shù)量突然增多，復(fù)查后呈陰性，即果斷停用實(shí)驗(yàn)室，立即按照核酸污染進(jìn)行消毒。消毒前采樣是為了查找污染原因，但完全依賴該結(jié)果再采取措施會(huì)耽誤時(shí)間，因引起實(shí)驗(yàn)室污染的原因很多，涉及實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的方方面面，準(zhǔn)確找到原因不是件容易的事［7］?？梢暈閷?shí)驗(yàn)室存在氣溶膠污染，從而采用過(guò)氧化氫霧化消毒。過(guò)氧化氫溶液是一種強(qiáng)氧化劑，可游離釋放出羥自由基和氧自由基，能分解核酸片段［8］，且霧化形成的氣溶膠微粒擴(kuò)散性好，消毒時(shí)不留死角［9］。對(duì)一些污染難以消除的重點(diǎn)部位如核酸提取倉(cāng)、PCR 儀加樣模塊等，再選擇84 消毒液、核酸去除劑及紫外線消毒燈等化學(xué)消毒和物理消毒聯(lián)合去污染。

上述消毒方法適用于核酸污染的應(yīng)急快速處置，其缺點(diǎn)是高濃度含氯消毒劑和過(guò)氧化氫消毒液均具有強(qiáng)氧化性，用于核酸提取儀、生物安全柜及PCR 擴(kuò)增儀的消毒處理后，應(yīng)迅速?gòu)氐兹コ緞埩?，避免?duì)金屬儀器的腐蝕［10］；且在消毒過(guò)程中，消毒人員需做好二級(jí)防護(hù)，防止消毒劑對(duì)呼吸系統(tǒng)和皮膚黏膜的刺激。此外，污染去除后，應(yīng)及時(shí)更換實(shí)驗(yàn)室排風(fēng)濾網(wǎng)，避免再次污染。

因此，實(shí)驗(yàn)室一定高度重視并嚴(yán)防核酸污染的發(fā)生。建議規(guī)范各項(xiàng)管理：一是科學(xué)制定核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室SOP，并嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)范；二是要強(qiáng)化培訓(xùn)，人員需持證上崗，并落實(shí)崗位監(jiān)督機(jī)制；三是加強(qiáng)對(duì)易產(chǎn)生氣溶膠的儀器的日常消毒，如全自動(dòng)核酸提取儀在提取核酸過(guò)程中，因震蕩會(huì)造成質(zhì)控品或陽(yáng)性樣本等核酸揮發(fā)形成氣溶膠［11］，日常消毒時(shí)可以用1 000 mg/L 的含氯消毒劑進(jìn)行擦拭消毒后開啟自身紫外線燈消毒3 h［12］。