蔣靜嫻，楊丹妮，張曉金

摘 要：即食果蔬中的致病微生物污染給其食用造成了極大的安全隱患。致病微生物的傳統(tǒng)檢驗方法耗時、耗力，目前急需一種高效率、高準(zhǔn)確度、低成本且單次實驗可滿足多指標(biāo)篩檢要求的快速檢測技術(shù)來對即食果蔬中的多種致病微生物進行同時檢測。本文闡述了即食果蔬中食源性致病微生物的種類及其主要危害，介紹了目前比較常見的微生物檢測技術(shù)，并重點介紹了針對即食果蔬最新開發(fā)出的一種快速、簡便、高通量的微生物檢測方法，為研究者開辟其他食源性致病微生物快速檢測方法提供重要參考。

關(guān)鍵詞：即食果蔬；致病微生物；檢測技術(shù)；基因膜芯片

Research Progress in Detection of Pathogenic Microorganisms in Ready-To-Eat Fruits and Vegetables

JIANG Jingxian， YANG Danni*， ZHANG Xiaojin

（Changzhou Food and Drug Fiber Quality Supervision and Inspection Center， Changzhou 213000， China）

Abstract： The contamination of pathogenic microorganisms in ready-to-eat fruits and vegetables has caused great potential safety hazard. Traditional inspection methods for pathogenic microorganisms are time-consuming and labour-intensive， at present， a rapid detection technique with high efficiency， high accuracy， low cost and a single test can meet the requirements of multi-index screening is urgently needed to detect multiple pathogenic microorganisms in ready-to-eat fruits and vegetables simultaneously. In this paper， the types and main hazards of food-borne pathogenic microorganisms in ready-to-eat fruits and vegetables were described， a rapid， simple and high-throughput microbial detection method for ready-to-eat fruits and vegetables was introduced， which provided important reference for researchers to develop other rapid detection methods for food-borne pathogenic microorganisms.

Keywords： ready-to-eat fruits and vegetables; pathogenic microorganisms; detection technology; gene membrane chip

隨著人們物質(zhì)生活水平的日益提升和媒體對食品安全問題的頻頻曝光，消費者對“舌尖上的安全”越來越關(guān)注，對食品的營養(yǎng)價值、感官品質(zhì)及安全衛(wèi)生等需求也不斷提高。即食果蔬由于具有方便、新鮮、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，近年來深受消費者的喜愛，鮮切果蔬產(chǎn)業(yè)也因此得到了快速發(fā)展[1]。

即食果蔬是以新鮮水果或新鮮蔬菜的一種或多種為原料，經(jīng)過預(yù)處理、清洗、去皮或不去皮、切分或不切分以及消毒等加工處理，密封包裝后銷售，是可直接食用的產(chǎn)品。但即食果蔬未經(jīng)高溫殺菌處理，在去皮、去核、切分等加工過程中以及在運輸和貯藏過程中，極易受到微生物污染。

1 即食果蔬中致病微生物的危害

即食果蔬中的致病微生物主要分為細菌和病毒兩類。病毒中較為典型的是諾如病毒和輪狀病毒，這兩種病毒可以引起腹瀉、嘔吐、頭痛和發(fā)熱等癥狀[2-3]，主要通過糞-口傳播、昆蟲移動傳播、病毒攜帶者傳播等方式污染即食果蔬。

據(jù)美國疾控防控中心2015年的一項調(diào)查研究[4]顯示，美國沙門氏菌的感染致病事件呈現(xiàn)逐年增長的趨勢，而且在美國食物中毒致死的案例中，由沙門氏菌感染引發(fā)的案例占比較高。我國也有相關(guān)報道[5]表明，沙門氏菌是引發(fā)食源性疾病的“罪魁禍?zhǔn)住薄Ｉ抽T氏菌屬于腸桿菌科，感染后會導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒等疾病，主要臨床表現(xiàn)是腹瀉、嘔吐、發(fā)燒和腹痛等[4]，還會引起關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、心肌炎等并發(fā)癥?，F(xiàn)已有調(diào)查研究[6]表明，沙門氏菌的生存能力極強，可在蔬菜、水果、各種肉制品上長期存活。但實際上，在即食果蔬上易存活的致病微生物遠遠不止沙門氏菌一種，還包括金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、諾如病毒以及輪狀病毒等。

單核細胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌已被證實可以在鮮切哈密瓜、鮮切火龍果、鮮切木瓜等多種即食果蔬上繁殖生存[7]。近20年來，美國發(fā)生的性質(zhì)最惡劣的食物中毒事件就是由單核細胞增生李斯特氏菌感染引起的，在2011年7月末至10月初出現(xiàn)了110例相關(guān)病例報告[8]。金黃色葡萄球菌可導(dǎo)致局部化膿性感染，如腸胃炎、肺炎、心包炎等，嚴(yán)重時會引發(fā)膿毒癥、敗血癥等全身性感染[9]。

雖然在正常情況下，大腸埃希氏菌是與人體互利共生的腸道菌群之一，但在機體免疫力低下等特殊情況下，其危害不容小覷。有調(diào)查顯示[10]，大腸桿菌O157∶H7引起的食物中毒事件占食源性疾病事件的34.3%。

2 致病微生物的常見檢測技術(shù)

2.1 傳統(tǒng)分離鑒定法

傳統(tǒng)分離鑒定法是通過觀察微生物的形態(tài)特征和生理/生化反應(yīng)等對其進行微生物學(xué)分類鑒定，具體過程包括增菌、分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生理/生化鑒別以及血清學(xué)鑒別5個步驟[11]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離鑒定法有較高的鑒定準(zhǔn)確度，較低的設(shè)備要求，常作為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。對于沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌等常見致病菌的微生物學(xué)檢驗，我國現(xiàn)行有效的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)均采用的是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定法。

2.2 免疫學(xué)檢測法

免疫學(xué)檢測法是一種根據(jù)抗原抗體的特異性反應(yīng)建立的檢驗與分析方法。酶聯(lián)免疫吸附法是目前發(fā)展較成熟、應(yīng)用較廣泛的免疫學(xué)檢測法，具有選擇性高、準(zhǔn)確高效、操作簡單等優(yōu)勢。該方法將抗原-抗體的特異性反應(yīng)與酶的催化作用相結(jié)合，用酶標(biāo)記抗原或抗體，在固相載體表面發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)洗滌后通過特定的酶促反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)來判定結(jié)果。但常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附法的檢測靈敏度容易受前處理方法和采樣時間等因素的影響，可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，而且對儀器設(shè)備和操作人員的要求也比較高[12]。

2.3 生物傳感器法

生物傳感器法是通過將某種生物活性物質(zhì)的濃度轉(zhuǎn)換為電信號來識別待測物質(zhì)的一種檢測方法。生物傳感器一般由生物感應(yīng)元件和信號轉(zhuǎn)換器兩部分組成。生物感應(yīng)元件是指酶、微生物、抗原/抗體、激素、細胞和組織等固定化的生物活性物質(zhì)。信號轉(zhuǎn)換器包括氧電極、場效應(yīng)管、光敏管和壓電晶體等[13]。根據(jù)信號轉(zhuǎn)換器的不同，生物傳感器可分為光學(xué)生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器和壓電生物傳感器。生物傳感器具有信號反應(yīng)快、設(shè)備成本低、樣品用量少等技術(shù)優(yōu)勢。

2.4 核酸檢測方法

基于核酸的檢測方法是利用分子生物學(xué)方法對微生物中特定的基因序列進行檢測的方法。應(yīng)用于食源性微生物中最常用的核酸檢測方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）。PCR技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種食源性致病菌的檢測，但由于常規(guī)PCR方法檢測通量較低，且無法實現(xiàn)定量，所以近年來在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上衍生出了基因膜芯片技術(shù)、多重PCR技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)（LAMP技術(shù)）等[14]。

3 即食果蔬中致病微生物檢測技術(shù)的研究進展

目前，我國對食源性致病菌的檢驗檢測最常采用的是傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離鑒定法。但這種方法耗費太多的人力、時間、物資等，不僅不適用于食源性致病微生物的快速檢測，也不利于對食品安全潛在風(fēng)險的即時排查與控制。所以，目前迫切需要一種高效率、高準(zhǔn)確度、低成本且單次實驗可滿足多指標(biāo)篩檢要求的快速檢測技術(shù)來對即食果蔬中的多種致病微生物進行同時檢測。

基因膜芯片法利用“反向斑點雜交”將基因中的特異性基因序列（DNA探針）固定在尼龍膜等載體上，然后待測靶標(biāo)基因與芯片上的探針特異性結(jié)合，最后通過酶-底物顯色判讀結(jié)果?；谀ば酒夹g(shù)，常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心聯(lián)合四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司開發(fā)了一種可以同時檢測即食果蔬中6種食源性致病微生物（4種細菌和2種病毒）的膜芯片檢測體系，即可用一種方法同時檢測多個致病微生物。

該方法采用獨特的多重PCR技術(shù)與反向斑點雜交技術(shù)相結(jié)合的檢測體系，同時提取細菌和病毒中的DNA和RNA，并且同時擴增其中的特異性基因片段，最終以大腸埃希氏菌O157、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核增生李斯特氏菌、諾如病毒和輪狀病毒中的特異性保守序列為檢測靶標(biāo)，在如圖1所示的膜芯片上形成肉眼可見的檢測靶點，實現(xiàn)所有檢測靶標(biāo)的共同檢測。該方法大大降低了相關(guān)檢測工作的技術(shù)門檻，顯著提高了檢測人員的工作效率，兼具高通量、高效率、高靈敏度等多重技術(shù)優(yōu)勢，達到了省時、省力又省成本的目的。與分離鑒定法等傳統(tǒng)檢測方法相比，該方法具有極大的競爭優(yōu)勢，如果廣泛應(yīng)用將會對食品質(zhì)量安全管理、食品市場秩序維護、區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展等領(lǐng)域都具有重要意義。

4 結(jié)語

食品安全是當(dāng)前最大的民生問題。對食品中致病微生物的快速檢測是有效控制食品安全事件發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著微生物檢測技術(shù)研究的不斷深入，對食源性致病菌的檢測從傳統(tǒng)的分離鑒定法發(fā)展到現(xiàn)在的酶聯(lián)免疫吸附法、生物傳感器法和分子生物學(xué)技術(shù)等。但傳統(tǒng)分離鑒定法操作煩瑣、耗時耗力；酶聯(lián)免疫吸附法的特異性和靈敏度有待提高；生物傳感器法檢測費用高，不利于推廣。未來我國微生物檢測技術(shù)的研發(fā)方向應(yīng)該是操作更加簡便快捷、特異性和靈敏度更高、對檢測人員的專業(yè)性要求更低的檢測技術(shù)及儀器產(chǎn)品，努力形成現(xiàn)代化的食源性致病菌快速檢測體系，最大限度地防止及控制食品安全突發(fā)事件的發(fā)生。

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