劉和平 巫登菊 余孝云 郭倫 蔡信福 尚強

摘 要：建立水梔子藥材超高效液相—質(zhì)譜聯(lián)用指紋圖譜，分析水梔子與梔子藥材指紋圖譜的差異.采用80%甲醇超聲提取，超高效液相色譜法測定指紋圖譜，結(jié)合質(zhì)譜、保留指數(shù)和相關(guān)文獻對部分色譜峰定性鑒別；并通過相似度評價和主成分分析水梔子與梔子藥材所含主要指標(biāo)性成分的差異.結(jié)果顯示，水梔子指紋圖譜共有24個共有峰，確定了其中的14個成分.水梔子與梔子藥材相似度較為一致，主成分分析可以準確區(qū)分水梔子與梔子藥材.所建立的指紋圖譜測定方法可以用于水梔子與梔子藥材的鑒別，研究結(jié)果為水梔子與梔子藥材真?zhèn)纹疯b定提供了實驗依據(jù).

關(guān)鍵詞：水梔子；梔子；指紋圖譜；液相色譜；相似度；主成分分析

中圖分類號：R284.1

文獻標(biāo)志碼：A

0 引 言

水梔子為茜草科（Rubiaceae）梔子屬（Gardenia Ellis）梔子（Gardenia jasminoides Ellis）多個變種藥材商品名的統(tǒng)稱.經(jīng)市場調(diào)研，目前市場流通的水梔子基源主要為茜草科植物大花梔子（Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.）和長果梔子（Gardenia jasminoides Ellis f.Longicarpa Z.W.Xie et Okada.）的干燥果實［1-3］.文獻報道，水梔子和梔子藥材均主要含有單萜（主要是環(huán)烯醚萜）、藏紅花素、三萜、黃酮、香豆素、有機酸和揮發(fā)類成分等［4］，所含成分具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎［5］、降血糖［6］、保肝［7］和抗抑郁［8］等藥理作用或生物活性.梔子為常用中藥材，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒和外用消腫止痛的功效，而水梔子現(xiàn)多用于提取食品黃色素，不作為中藥材使用，但市場常見有水梔子藥材冒充梔子藥材出售.近年來，針對水梔子的單一成分的質(zhì)量控制，大多集中在指標(biāo)性成分梔子苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量測定［9-11］.其他的文獻報道，主要是通過藥材性狀、橫切面顯微和薄層色譜等方面對水梔子與梔子藥材進行鑒別的研究［12-13］，未見有水梔子與梔子藥材超高效液相—質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF MS）指紋圖譜對比研究的文獻報道.本研究通過對水梔子果實超高效液相（UPLC）指紋圖譜方法的建立，研究了水梔子與梔子藥材所含主要成分組成和比例差異，為今后水梔子與梔子藥材基源鑒定提供數(shù)據(jù)支持.

1 材 料

1.1 儀 器

Agilent 1260型超高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），Xevo-G2-XS型四極桿—飛行時間高分辨質(zhì)譜儀（沃特世科技有限公司），KQ-500VDE型雙頻數(shù)控超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司），MS205DU型十萬分之一電子天平（梅特勒—托利多集團）.

1.2 材 料

西紅花苷Ⅰ對照品（批號，111588-201303）、西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枺?11589-201304）、梔子苷對照品（批號，110749-201316）、綠原酸對照品（批號，110753-201716）、京尼平苷酸對照品（批號，111828-201604），均購自中國食品藥品檢定研究院；京尼平龍膽雙糖苷對照品（批號，170510）、山梔子苷B對照品（批號，170518），均購自深圳健竹生物科技有限公司;水為自制超純水，乙腈為色譜純和質(zhì)譜純，甲醇等其他試劑均為分析純.從安徽宣城市（宣州區(qū)、廣德縣和郎溪縣），以及廣西玉林市水梔子人工種植基地收集了26批樣品，從安徽亳州、河北安國、廣州清平和江西樟樹等中藥材市場收集了22批不同產(chǎn)地的商品水梔子樣品和21批梔子樣品，共69批，樣本收集信息見表1.所有樣本的藥材基原，經(jīng)暨南大學(xué)藥學(xué)院周光雄教授鑒定，憑證標(biāo)本存于麗珠醫(yī)藥集團中藥研究院生藥資源中心.

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

取梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、綠原酸、京尼平苷酸、京尼平龍膽雙糖苷和山梔子苷B對照品適量，加80%甲醇制成每1 mL分別含0.05、0.01、0.05、0.1、0.1、0.5和0.15 mg的溶液，即得.

2.2 供試品溶液制備

取本品粉末0.2 g，精密稱定，放置三角瓶中，精密加80%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（功率500 W，頻率45 KHz），取出，放冷，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，溶液過0.22 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得.

2.3 色譜條件

液相色譜：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Waters，ACQUTTY UPLC BEH-C18 ，50 mm×2.1 mm，1.7 μm）.以乙腈（A）- 0.1%甲酸水溶液（B）為流動相，按梯度洗脫.洗脫程序為：0 min，5%A；2 min，8%A；4 min，12%A；6 min，18%A；10 min，18%A；12 min，30%A；16 min，33%A；20 min，90%A.流速0.4 mL/min；進樣量2 μL；柱溫30 ℃；按時間變換檢測波長，0～12.50 min為238 nm，12.51～20 min為440 nm.理論板數(shù)按西紅花苷Ⅰ計算應(yīng)不低于2 000.

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），離子源毛細管電壓負離子2 kV，追孔電壓35 V，碰撞能量20～50 eV，脫溶劑溫度350 ℃，源溫100 ℃，脫溶劑氣流速800 L/hr，質(zhì)量數(shù)范圍50～1 500 amu，數(shù)據(jù)采集為centriod模式.

2.4 色譜條件優(yōu)化

2.4.1 流動相篩選

相同條件下分別比較了不同梯度的乙腈-0.1%甲酸系統(tǒng)，最后確定流動相乙腈（A）- 0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脫.洗脫程序為：0 min，5%A；2 min，8%A；4 min，12%A；6 min，18%A；10 min，18%A；12 min，30%A；16 min，33%A；20 min，90%A的條件分離度最佳.

2.4.2 波長篩選

選擇梔子苷最大吸收波長238 nm和西紅花苷I最大吸收波長440 nm進行比較，為了能比較全面地表征水梔子藥材中環(huán)烯醚萜類和西紅花苷類成分，確定采取變波長的方法，即檢測波長：0～12.50 min為238 nm，12.51～20 min為440 nm.

2.4.3 柱溫篩選

在同一條件下，分別比較了不同柱溫（25、30和35 ℃）色譜圖的主要色譜峰分離度，確定柱溫為30 ℃時最佳.

2.4.4 流速比較

在同一條件下，分別比較了不同流速（0.3、0.4和0.5 mL/min）色譜圖的主要色譜峰分離度，確定流速為0.4 mL/min時最佳.

2.5 供試液制備方法考察

2.5.1 提取方式選擇

在相同條件下，提取方式分別比較了超聲提取與回流提取、超聲3次與超聲1次，按梔子苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ等12個主要特征峰計算峰面積（A）與稱樣量（M）的比值.結(jié)果表明，超聲提取與回流提取及超聲次數(shù)無明顯差異，考慮操作簡便，確定超聲提取1次.

2.5.2 提取溶劑選擇

在相同條件下，分別比較了用20%甲醇、50%甲醇、80%甲醇及100%甲醇提取，按梔子苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ等12個主要特征峰計算峰面積（A）與稱樣量（M）的比值.結(jié)果表明，80%甲醇的最佳，故確定80%甲醇作為提取溶劑.

2.5.3 提取體積選擇

在相同條件下，分別比較了用25、50和75 mL的溶劑提取，按梔子苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ等12個主要特征峰計算峰面積（A）與稱樣量（M）的比值.結(jié)果表明，50 mL溶劑提取效率高于25 mL，與75 mL溶劑提取效率無明顯差異，故確定提取溶劑的體積為50 mL.

2.5.4 提取時間選擇

相同條件下，分別比較了超聲15、30和45 min的提取時間，按梔子苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ等12個主要特征峰計算峰面積（A）與稱樣量（M）的比值.由結(jié)果可知，超聲處理30 min，基本可以提取完全，故確定提取時間為30 min.

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度

取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，以第1針圖譜為對照圖譜，計算6針色譜圖相似度，結(jié)果相似度均在0.999 97以上.再以西紅花苷Ⅰ為參照峰，選面積相對較大的12個色譜峰，計算相對保留時間及相對峰面積的RSD值.結(jié)果相對保留時間RSD均小于0.05%，相對峰面積RSD均小于2.06%，表明儀器精密度良好.

2.6.2 穩(wěn)定性

取同一供試品溶液，分別在0、1、3、6、12、24和48 h進行測定，以0 h的圖譜為對照圖譜，計算7個時間點色譜圖相似度，結(jié)果相似度均在0.999 95以上.再以西紅花苷Ⅰ為參照峰，選面積相對較大的12個色譜峰，計算相對保留時間及相對峰面積的RSD值.結(jié)果相對保留時間RSD均小于0.04%，相對峰面積RSD均小于4.17%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.6.3 重復(fù)性

取同一樣本粉末，按“2.2”項下方法平行制備6份樣品溶液，按“2.3”方法測定.以第1份樣品的圖譜為對照圖譜，計算6個平行樣品色譜圖相似度，結(jié)果相似度均在0.999 93以上.再以西紅花苷Ⅰ為參照峰，選面積相對較大的12個色譜峰，計算相對保留時間及相對峰面積的RSD值，結(jié)果相對保留時間RSD均小于0.15%，相對峰面積RSD均小于1.66%，表明方法重復(fù)性較好.

2.7 樣品測定與共有模式建立

取69批樣本按“2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.3”項下色譜條件進行測定.將得到的UPLC圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似度評價系統(tǒng)（Chennind ChemPattern 2020專業(yè)版，北京科邁恩科技有限公司），以安徽宣城市水梔子種植基地的24批樣本為代表性樣品，采用峰面積的夾角余弦法確定特征峰，均數(shù)法計算特征值，篩選了24個共有峰，構(gòu)成了水梔子UPLC指紋圖譜共有模式（見圖1）.

各取1批水梔子和梔子供試液，按“2.3”項下質(zhì)譜條件用UPLC-Q-TOF MS進樣測定，采用負離子掃描模式，對樣本進行分析，得到其總離子流圖，如圖2所示.在指紋圖譜研究工作基礎(chǔ)上通過與標(biāo)準品比對保留時間，化合物2、化合物3、化合物6、化合物7、化合物9、化合物15和化合物18分別鑒定為京尼平苷酸、山梔子苷B、綠原酸、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ.在暨南大學(xué)藥學(xué)院周光雄教授課題組前期化學(xué)成分研究工作基礎(chǔ)上［14-15］，通過與二級質(zhì)譜高分辨分子量和質(zhì)譜裂解信息，化合物4、化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、化合物19和化合物23分別鑒定為Jasminoside B、rehmapicrogenin、6″-O-反-香豆酰基京尼平龍膽二糖苷、3，5-O-二咖啡?；?4-O-（3-羥基-3-甲基-戊二酰基）奎寧酸、6″-O-阿魏?；┠崞烬埬懚擒?、6"-O-反式-肉桂酰京尼平龍膽二糖苷和西紅花苷III.

水梔子藥材UPLC指紋圖譜總共有24個共有色譜峰，經(jīng)UPLC-MS方法鑒定了其中14個色譜峰的化合物結(jié)構(gòu)，其余10個化合物暫不能鑒定具體的結(jié)構(gòu).水梔子樣本特征峰信息及部分化合物解析結(jié)果見表2.

2.8 相似度評價

以安徽宣城市水梔子種植基地24批樣本建立的共有模式，計算不同產(chǎn)地水梔子藥材及梔子藥材的相似度，相似度計算結(jié)果見表1.結(jié)果安徽宣城市水梔子種植基地的24批樣本相似度均在0.95以上，表明安徽宣城市水梔子種植基地不同種植片區(qū)和不同年份的24批樣品所含的主要成分組分和比例均較為一致，樣品各批次間質(zhì)量較為均一；江西、廣西和河南等不同產(chǎn)地水梔子藥材的相似度也基本在0.90以上，表明不同省份種植的水梔子藥材所含的主要指標(biāo)性成分無明顯差異；21批梔子樣本的相似度，17批在0.90以上，其余4批相似度在0.80～0.90之間，表明梔子藥材與水梔子藥材所含的主要成分組分和比例也較為相似，不同產(chǎn)地的梔子藥材之間相似度有一定差異.

2.9 PCA主成分分析

為了更好地分析不同產(chǎn)地水梔子藥材及水梔子與梔子藥材所含主要成分的差異，選擇48批水梔子和21批梔子藥材樣本進行PCA分析.用主成分分析軟件（Chennind ChemPattern 2020專業(yè)版，北京科邁恩科技有限公司），將69批樣本圖譜的數(shù)據(jù)進行標(biāo)準化后，以峰面積作為特征自變量，進行主成分分析，結(jié)果第一和第三主成分累積方差為93.86%，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）.

主成分分析結(jié)果（見圖3）表明，48批不同產(chǎn)地（24批安徽、7批江西、7批湖南、7批廣西和3批其他產(chǎn)地）的水梔子樣本均聚為一類，而21批梔子樣本聚為另外一類.第三主成分得分最高為7號色譜峰（京尼平龍膽雙糖苷），呈正相關(guān)；其次為3號色譜峰（山梔子苷B），呈負相關(guān).表明所有梔子藥材在其組成比例上與不同產(chǎn)地水梔子藥材存在明顯差異，21批梔子藥材所含京尼平龍膽雙糖苷含量明顯高于水梔子藥材，同時，梔子所含的山梔子苷B含量明顯低于水梔子藥材.其他色譜峰如15號和18號等，兩者的面積也存在較大差異，但色譜峰的組成比例較為一致，故PCA分析得分較低.PCA主成分分析體現(xiàn)出了水梔子與梔子藥材在化學(xué)成分組成比例方面的差異，可用于梔子與水梔子藥材的鑒別.水梔子和梔子藥材代表性樣品色譜圖如圖4與圖5所示，水梔子和梔子藥材代表性樣品24個共有峰的峰面積對比柱狀圖如圖6所示.

3 結(jié) 論

通過對水梔子和梔子藥材樣品UPLC指紋圖譜的相似度進行比較，可以看出，不同產(chǎn)區(qū)、不同基原的水梔子與梔子藥材的相似度較為一致，表明水梔子與梔子藥材所含主要指標(biāo)性成分組成和比例較為一致.進一步對水梔子和梔子藥材樣品的UPLC指紋圖譜進行PCA主成分分析，可以看出，水梔子和梔子藥材各自聚為一大類.數(shù)據(jù)研究表明，水梔子與梔子藥材所含特定指標(biāo)性成分京尼平龍膽雙糖苷和山梔子苷B比例有明顯差異，可以用于水梔子與梔子藥材的鑒別，并為今后水梔子藥材的研究提供測定方法和數(shù)據(jù)支持.

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［15］覃芳敏.水梔子化學(xué)成分研究 ［D］.廣州：暨南大學(xué)，2014.

（責(zé)任編輯：伍利華）

Abstract：

This paper aims to establish UPLC-Q-TOF MS chromatographic fingerprints of fructus Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai，and to analyze the fingerprints differences between Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.and Gardenia jasminoides Ellis.The sample was extracted by ultrasonic with 80% methanol，and the fingerprint was determined by ultra performance liquid chromatography.Some chromatographic peaks were qualitatively identified by MS，retention index and related literature;meanwhile，the main target components differences between Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.and Gardenia jasminoides Ellis were analyzed by similarity evaluation system and principal component analysis.The results show that there are 24 common components in the fingerprint of Gardenia? jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.and 14 of them are identified.The similarity is relatively consistent，but the sources of fructus Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.and Gardenia jasminoides Ellis.can be distinguished accurately by principal component analysis.The established fingerprint method can be used for the identification of the source of Gardenia? jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.and Gardenia jasminoides Ellis.The research results can provide experimental evidence for the identification of the authenticity of Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.and Gardenia jasminoides Ellis.

Key words：

Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai.;Grdenia jasminoides Ellis;fingerprint;liquid chromatography;similarity;principal component analysis