馬芮萍 蘇阿龍 朱艷

摘要：建立了UPLC-MS/MS法同時測定花椒中17種氨基酸和6種核苷的分析方法，并對不同產(chǎn)地的花椒樣品進(jìn)行主成分分析和聚類分析。樣品經(jīng)水提取后用超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，采用電噴霧電離源，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，17種氨基酸和6種核苷在各自的線性范圍內(nèi)線性良好，檢出限為0.001 3～0.087 8 μg/g，定量限為0.004 5～0.292 7 μg/g；加標(biāo)回收率為60.4%～120.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.6%～13.4%，操作方法簡便快速，靈敏度和穩(wěn)定性較好；14批次花椒樣品中TAA在333.5～569.9 mg/kg之間，平均含量為451.3 mg/kg，其中S4氨基酸總量最高；氨基酸中精氨酸含量最高，平均含量為172.7 mg/kg，占TAA的38.3%；核苷總量在14.4～38.5 mg/kg之間，平均含量為27.7 mg/kg，其中S3核苷總量最高；核苷中尿苷含量最高，平均含量為21.6 mg/kg，占核苷總量的77.9%；通過主成分分析和聚類分析發(fā)現(xiàn)來自甘肅省隴南市西和縣、甘肅省隴南市武都區(qū)、甘肅省天水市秦安區(qū)的花椒綜合品質(zhì)較高，位列該次測定的第一梯隊，測定的數(shù)據(jù)可為甘肅地方特色產(chǎn)業(yè)的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS/MS）；花椒；氨基酸；核苷；主成分分析

中圖分類號：TS264.2? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）04-0187-07

Abstract： UPLC-MS/MS method is established for the simultaneous determination of 17 amino acids and 6 nucleosides in Zanthoxylum bungeanum， and principal component analysis （PCA） and clustering analysis are conducted on Zanthoxylum bungeanum samples from different places of origin. After water extraction， the samples are determined by ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry， detected by electrospray ionization source in multiple reaction monitoring （MRM） mode， and quantified by external standard method. The results show that 17 amino acids and 6 nucleosides both have good linearity within their respective linear ranges， with the detection limit ranging from 0.001 3 μg/g to 0.087 8 μg/g and the quantification limit ranging from 0.004 5 μg/g to 0.292 7 μg/g. The spiked recovery rates are 60.4%～120.4%， and the relative standard? deviations （RSDs） are 0.6%～13.4%. The method is simple and rapid， with good sensitivity and stability. The TAA in 14 batches of Zanthoxylum bungeanum samples ranges from 333.5 mg/kg to 569.9 mg/kg， with the average content of 451.3 mg/kg， among which， the total amount of amino acids in S4 is the highest; among the amino acids， arginine content is the highest， with the average content of 172.7 mg/kg， accounting for 38.3% of TAA. The total amount of nucleosides ranges from 14.4 mg/kg to 38.5 mg/kg， with the average content of 27.7 mg/kg， among which， the total amount of nucleosides in S3 is the highest; among the nucleosides， the uridine content is the highest， with the average content of 21.6 mg/kg， accounting for 77.9% of the total amount of nucleosides. Through principal component analysis and clustering analysis， it is found that the comprehensive quality of Zanthoxylum bungeanum from Xihe County and Wudu District in Longnan City， Gansu Province and Qin'an District in Tianshui City， Gansu Province is higher， ranking in the first tier of this measurement. The measured data can provide data support for the development and utilization of local characteristic industries in Gansu Province.

Key words： ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry（UPLC-MS/MS）; Zanthoxylum bungeanum; amino acids; nucleosides; principal component analysis

花椒（Zanthoxylum bungeanum）是蕓香科花椒屬小落葉喬木，一般4～5月份開花，8～10月份結(jié)果，是一種藥食兩用的經(jīng)濟(jì)作物，其果皮被譽(yù)為“八大調(diào)味品”之一[1]?；ń分泻猩飰A、蛋白質(zhì)、脂肪酸、生物活性成分、芳香物質(zhì)等營養(yǎng)成分，不僅可以作為調(diào)味品，而且具有抗炎鎮(zhèn)痛[2-3]、殺蟲止癢[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6-7]、抑菌[8]、祛濕等[9]藥用價值。蛋白質(zhì)是花椒的主要營養(yǎng)成分[10]，氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元，是維持人體生命活動的重要營養(yǎng)成分，具有營養(yǎng)支持、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等作用[11]；核苷是核酸合成的前體，具有保護(hù)神經(jīng)、抗病毒和抗菌等生物活性[12]。目前關(guān)于花椒的研究主要集中在花椒精油的提取與分析、揮發(fā)性成分、麻味物質(zhì)等方面[13－15]，對于花椒中氨基酸和核苷的研究鮮見報道。

主成分分析（principal component analysis，PCA）是通過降低數(shù)據(jù)維數(shù)，將多個變量通過線性變換為少數(shù)綜合變量，用簡化的數(shù)據(jù)反映原始數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計分析方法。聚類分析利用歐氏距離或者馬氏距離聚類計算樣品之間的相關(guān)性，根據(jù)相關(guān)程度將其簡化合并，更直觀地對相似品種及組分進(jìn)行綜合比較[16]。

本研究以來自甘肅、陜西、四川等14個地區(qū)的花椒為研究對象，采用UPLC-MS/MS法建立了同時測定花椒中氨基酸含量和核苷含量的檢測方法，并利用Excel軟件進(jìn)行含量計算，SPSS 26.0軟件進(jìn)行主成分分析和聚類分析，比較不同地區(qū)花椒中氨基酸和核苷含量的差異性，以期為甘肅地方特色產(chǎn)業(yè)的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

花椒樣品分別購自不同地區(qū)共計14批次，見表1。

1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）、胱氨酸（Cys）、谷氨酸（Glu）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、組氨酸（His）、異亮氨酸（Ile）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（胱氨酸濃度為1.25 mol/L，其余濃度為2.5 mol/L）：上海安譜科技有限公司；腺苷（Ade）、尿苷（Uri）、肌苷（Ino）、鳥苷（Gua）、黃嘌呤（Xan）、次黃嘌呤（Hyp）（純度均≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國Merck公司；甲酸（色譜純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

QTRAP 4500超高效液相色譜-三重四級桿-線性離子肼串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國SCIEX公司；VXR渦旋振蕩器 德國IKA公司；KH30R-Ⅱ冷凍離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；KQ-600DE超聲波清洗器 東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司；十萬分之一天平（精確度為0.1 mg） 德國Sartorius公司；Milli-Q Gradient純水儀 美國Millipore公司。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動相：A為水溶液（含0.1%甲酸），B為甲醇（含0.1%甲酸）；流動相梯度洗脫程序：0～1.0 min，10% B；1.0～1.5 min，10%～90% B；1.5～4.0 min，90% B；4.0～4.1 min，90%～10% B；4.1～8.0 min，10% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI+）；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；氣簾氣（CUR）：35 psi；碰撞氣（CAD）：中；離子化電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；噴霧氣（GS1）：55 psi；輔助加熱氣（GS2）：60 psi。

1.4.3 溶液配制

一級核苷標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500 μg/mL）：分別準(zhǔn)確稱取單個核苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg（精確至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，加入適量水溶解，用水定容，混勻后于4 ℃保存。

二級核苷標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液（5 μg/mL）：分別準(zhǔn)確移取100 μL一級核苷標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用水定容，混勻后于4 ℃保存。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確移取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μL于5 mL容量瓶中，加入適量水溶解，用水定容，混勻后于4 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確移取200 μL二級核苷標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液及4.0 mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用水定容，作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，依次配成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.4 樣品前處理

將收集到的花椒樣品去除雜質(zhì)，于45 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥1 h，粉碎過60目篩，置于干燥器中備用。

稱取花椒試樣2.0 g（精確至0.000 1 g）置于50 mL離心管中，加入30 mL超純水，渦旋混合1 min，40 ℃超聲提取30 min，4 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.4.5 方法學(xué)考察

1.4.5.1 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及檢出限

將“1.4.3”配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按照“1.4.1”和“1.4.2”色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到17種氨基酸和6種核苷的線性方程、相關(guān)系數(shù)。以信噪比（S/N）約為3計算各成分的檢出限（LOD），信噪比（S/N）約為10計算各成分的定量限（LOQ）。

1.4.5.2 精密度和加標(biāo)回收實驗

精密稱取試樣S1（青花椒）6份，每份2.0 g，加入2.5 mg/kg（胱氨酸1.25 mg/kg）、5.0 mg/kg（胱氨酸2.5 mg/kg）、10 mg/kg（胱氨酸5 mg/kg）標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用優(yōu)化后的實驗條件進(jìn)行測定，計算添加水平的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2016軟件對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計，計算相關(guān)數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRM模式下目標(biāo)化合物檢測方法的建立

離子化模式ESI+：采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），本研究在國家標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報道[16-17]的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了23種待測物質(zhì)的碰撞能量（DP）和去簇電壓（CE），最終得到的17種氨基酸和6種核苷的質(zhì)譜條件以及23種目標(biāo)化合物在MRM模式下的質(zhì)譜條件，見表2。在ESI+掃描模式下，流動相中加入少量甲酸提供酸性環(huán)境，可促進(jìn)目標(biāo)化合物的電離，提高質(zhì)譜響應(yīng)，結(jié)果顯示，乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相時各化合物的峰形較好，在該條件下17種氨基酸和6種核苷的MRM圖見圖1。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及檢出限

將“1.4.3”配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按照“1.4.1”和“1.4.2”色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到17種氨基酸和6種核苷的線性方程、相關(guān)系數(shù)。以各對照品信噪比（S/N）約為3時對應(yīng)的濃度為檢出限（LOD），各對照品信噪比（S/N）約為10時對應(yīng)的濃度為定量限（LOQ），結(jié)果見表3。

由表3可知，17種氨基酸和6種核苷在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）≥0.999 00，檢出限在0.001 3～0.087 8 μg/g范圍內(nèi)，定量限在0.004 5～0.292 7 μg/g范圍內(nèi)。

2.2.2 回收率和精密度

在花椒試樣中分別添加氨基酸和核苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個加標(biāo)水平做6次平行實驗，采用優(yōu)化后的實驗條件進(jìn)行測定，加標(biāo)回收率及精密度結(jié)果見表4。

由表4可知，17種氨基酸和6種核苷的加標(biāo)回收率范圍為60.4%～120.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.6%～13.4%，說明本方法的準(zhǔn)確性良好。

2.3 樣品測定

2.3.1 樣品中氨基酸含量分析

氨基酸在食物中大部分以蛋白質(zhì)的形式存在，花椒果皮干樣經(jīng)水解處理后，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成氨基酸[17]，從營養(yǎng)學(xué)角度上講蛋白質(zhì)質(zhì)量的高低在于它所含的氨基酸種類以及對應(yīng)的氨基酸含量。14批次花椒樣品中氨基酸含量的測定結(jié)果見表5。

由表5可知，14批次花椒樣品中氨基酸總量（total amino acid，TAA）在333.5～569.9 mg/kg之間，平均含量為451.3 mg/kg，其中S4氨基酸總量最高，其次為S3，S1氨基酸總量最低。14批花椒樣品均含有15種氨基酸，其中精氨酸含量最高，含量在69.9～251.1 mg/kg之間，平均含量為172.7 mg/kg，占氨基酸總量的38.3%；脯氨酸次之，含量在73.1～211.6 mg/kg之間，平均含量為148.5 mg/kg，占氨基酸總量的32.9%。李美鳳等[18]研究發(fā)現(xiàn)，花椒中精氨酸、脯氨酸含量較高，與本研究結(jié)果基本一致。脯氨酸在醫(yī)學(xué)上可以作為營養(yǎng)不良、蛋白質(zhì)缺乏癥、嚴(yán)重胃腸道疾病、燙傷及外科手術(shù)后的蛋白質(zhì)補(bǔ)充，植物抗寒性脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組分之一，無明顯毒副作用[19-20]。

花椒中檢測出6種人體必需氨基酸（essential amino acid，EAA），必需氨基酸的總含量在68.0～106.9 mg/kg之間，平均含量為81.9 mg/kg，占氨基酸總量的18.2%。必需氨基酸中賴氨酸含量最高，平均含量為47.5 mg/kg，占必需氨基酸總量的57.9%，占氨基酸總量的9.8%，與侯娜等的研究結(jié)果一致。14批花椒中必需氨基酸總量最高的是S4，占氨基酸總量（EAA/TAA）的18.8%。14批花椒樣品中必需氨基酸總量占氨基酸總量（EAA/TAA）在13.5%～26.8%之間，平均值為18.6%。必需氨基酸總量與非必需氨基酸總量（EAA/NEAA）的百分比為27.9%～60.0%，平均值為44.9%。

2.3.2 樣品中核苷含量分析

核苷類成分是生物細(xì)胞維持生命活動的基本組成成分，參與DNA代謝過程，尤其對維持免疫應(yīng)答、抗病毒和糖脂代謝等生物活性具有重要意義[21-23]。14批次花椒樣品中核苷含量的結(jié)果見表5。由表5可知，14批次花椒樣品中核苷總量在14.4～38.5 mg/kg之間，平均含量為27.7 mg/kg，其中S3核苷總量最高，其次為S7，S11核苷總量最低。14批花椒樣品均含有6種核苷，其中尿苷含量最高，含量在9.0～30.0 mg/kg之間，平均含量為21.6 mg/kg，占核苷總量的77.9%；鳥苷次之，含量在2.5～5.5 mg/kg之間，平均含量為3.5 mg/kg，占核苷總量的27.7%；肌苷含量最低，含量在0.1～0.3 mg/kg之間，平均含量為0.2 mg/kg，占核苷總量的0.6%。

2.4 主成分分析

采用SPSS 26.0軟件對14批花椒中氨基酸和核苷組分進(jìn)行主成分分析，以特征值大于1作為提取主成分的標(biāo)準(zhǔn)。由表6可知，從21種組分中提取了5個主成分，其特征值分別為9.485，3.203，2.343，2.062，1.022，方差貢獻(xiàn)率分別為45.167%、15.252%、11.159%、9.818%、4.865%，累計貢獻(xiàn)率分別為45.167%、60.419%、71.578%、81.396%、86.261%，5個主成分的累計貢獻(xiàn)率達(dá)到86.435%，表明這5個主成分能解釋大部分?jǐn)?shù)據(jù)。因此選擇這5個主成分進(jìn)行PCA分析，見表6。

由于任何單一主成分都無法代表花椒中21種成分的水平，以各主成分對應(yīng)的貢獻(xiàn)率作為權(quán)重，根據(jù)主成分得分進(jìn)行加權(quán)求和計算，構(gòu)建綜合評價模型：F=0.452F1+0.604F2+0.716F3+0.814F4+0.863F5，得到主成分綜合得分，結(jié)果見表7。

由表7可知，在第一主成分中，S4的得分最高；在第二主成分中，S4的得分最高；在第三主成分中，S13的得分最高；在第四主成分中，S3的得分最高；在第五主成分中，S6的得分最高。綜合得分排序為S4>S3>S6>S7>S14>S8>S11>S2>S12>S13>S5>S9>S10>S1，其中綜合得分最高的是S4（西和油椒），綜合得分最低的是S1（青花椒）。表7中的F值表明，這14批次花椒中氨基酸含量差異明顯。

2.5 聚類分析

采用SPSS 26.0軟件對14批花椒中氨基酸和核苷組分進(jìn)行主成分分析，以特征值大于1作為提取主成分的標(biāo)準(zhǔn)。

通過氨基酸和核苷含量等指標(biāo)分析，花椒氨基酸營養(yǎng)價值優(yōu)良程度并不一致，單一指標(biāo)比較花椒營養(yǎng)價值有一定的局限性，為了更準(zhǔn)確、合理地評價各種質(zhì)花椒營養(yǎng)價值優(yōu)良程度，綜合花椒中TAA、EAA、CEAA、NEAA、EAA/TAA、EAA/NEAA、核苷總量等指標(biāo)，對14批次花椒進(jìn)行聚類分析。

采用SPSS 26.0軟件對14個地區(qū)的花椒樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示在歐氏距離5處可將14份花椒樣品分為6類（見圖2）。第Ⅰ類為S2、S8、S9、S13、S14 5批次樣品；第Ⅱ類為S5、S11樣品；第Ⅲ類為S1樣品；第Ⅳ類為S12樣品；第Ⅴ類為S3、S4、S6、S7 4批次樣品；第Ⅵ類為S10樣品。由表5可知，6個分類中各營養(yǎng)成分存在差異，第Ⅴ類花椒中氨基酸總量和核苷總量高于其他類，綜合品質(zhì)較高；第Ⅲ類EAA/CEAA最高，但是綜合品質(zhì)一般，低于其他類；第Ⅳ類EAA/TAA最高，綜合品質(zhì)居于中下水平，綜合排第9；第Ⅵ類樣品NEAA含量最高且核苷總量較高，綜合品質(zhì)僅高于S1樣品。氨基酸含量、核苷含量和組分差異與當(dāng)?shù)赝临|(zhì)營養(yǎng)和氣溫條件有關(guān)，同時與管理方式和采收時間有關(guān)[24]，該聚類結(jié)果反映了不同產(chǎn)地樣品間的差異性，為花椒的開發(fā)利用及營養(yǎng)評價提供了一定的理論參考。

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-MS/MS建立了同時測定花椒中17種氨基酸和6種核苷的檢測方法。23種待測物質(zhì)在各自的線性范圍內(nèi)線性良好，檢出限范圍為0.001 3～0.087 8 μg/g，定量限范圍為0.004 5～0.292 7 μg/g；加標(biāo)回收率為60.4%～120.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.6%～13.4%。采用建立的方法對不同地區(qū)的14批次花椒中的氨基酸和核苷含量進(jìn)行了測定，結(jié)合主成分分析和聚類分析對樣品進(jìn)行了綜合評價，結(jié)果顯示，14批次花椒樣品中TAA在333.5～569.9 mg/kg之間，平均含量為451.3 mg/kg，其中S4氨基酸總量最高；氨基酸中精氨酸含量最高，平均含量為172.7 mg/kg，占TAA的38.3%；核苷總量在14.4～38.5 mg/kg之間，平均含量為27.7 mg/kg，其中S3核苷總量最高；核苷中尿苷含量最高，平均含量為21.6 mg/kg，占核苷總量的77.9%；通過主成分分析和聚類分析發(fā)現(xiàn)來自甘肅省隴南市西和縣、甘肅省隴南市武都區(qū)、甘肅省天水市秦安區(qū)的花椒綜合品質(zhì)較高，位列本次測定的第一梯隊。本研究建立的方法具有高效、簡便、穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點，可以廣泛應(yīng)用于花椒中氨基酸和核苷含量的測定，測定的數(shù)據(jù)可為甘肅地方特色產(chǎn)業(yè)的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。

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