王萌 饒佳薇 孟凡冰 李云成 劉達(dá)玉 鄒龍華

摘要：通過向甜面醬保溫發(fā)酵過程中添加不同種類（魯氏酵母和異常威克漢姆酵母）和不同比例（1∶2、1∶1、2∶1）的耐鹽產(chǎn)香酵母，對比不同產(chǎn)香酵母接種方式對甜面醬品質(zhì)及風(fēng)味的影響。結(jié)果表明，先添加魯氏酵母后添加異常威克漢姆酵母，且二者比例為1∶1時，更有利于氨基酸態(tài)氮和有機酸的積累，保溫發(fā)酵結(jié)束后，產(chǎn)品的還原糖含量為20.02 g/100 g，總酸含量為2.21 g/100 g，氨基酸態(tài)氮含量為0.49 g/100 g，有機酸含量為5.61 mg/g。產(chǎn)品中共檢測出揮發(fā)性風(fēng)味成分45種，含量為84.36×10-2 μg/g。綜合理化指標(biāo)及風(fēng)味成分指標(biāo)，甜面醬保溫發(fā)酵過程中最優(yōu)的酵母添加方式為先添加魯氏酵母后添加異常威克漢姆酵母，且二者添加比例為1∶1時更有利于保溫發(fā)酵甜面醬品質(zhì)和風(fēng)味的提升。

關(guān)鍵詞：甜面醬；保溫發(fā)酵；產(chǎn)香酵母；添加方式；品質(zhì)

中圖分類號：TS264.24? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）04-0073-07

Abstract： Different kinds （Zygosaccharomyces rouxii and Wickerhamomyces anomalus） and different proportions （1∶2， 1∶1， 2∶1） of salt-tolerant aroma-producing yeasts are added into sweet soybean paste during the insulation fermentation， and the effects of different aroma-producing yeast inoculation methods on the quality and flavor of sweet soybean paste are investigated. The results show that when add Zygosaccharomyces rouxii firstly and then add Wickerhamomyces anomalus， and the ratio of the two kinds of yeasts is 1∶1， the accumulation of amino acid nitrogen and organic acid is more favorable.After insulation fermentation， the content of reducing sugar， total acid， amino acid nitrogen and organic acid is 20.02 g/100 g， 2.21 g/100 g， 0.49 g/100 g and 5.61 mg/g respectively.A total of 45 kinds of volatile flavor components with the content of 84.36×10-2 μg/g are detected in the product.Based on the physicochemical indexes and flavor component indexes， the optimal adding method of yeasts in the insulation fermentation process of sweet soybean paste is adding Zygosaccharomyces rouxii firstly and then adding Wickerhamomyces anomalus， and the ratio of the two kinds of yeasts is 1∶1， which is more beneficial to improving the quality and flavor of fermented sweet soybean paste.

Key words： sweet soybean paste; insulation fermentation; aroma-producing yeast; adding method; quality

甜面醬是以小麥或面粉為主要原料，經(jīng)蒸煮熟化后，由微生物制曲和發(fā)酵制得的一種咸中帶甜的半固體醬類調(diào)味品。在發(fā)酵過程中，通過微生物及酶的作用，將蛋白質(zhì)、淀粉等大分子分解轉(zhuǎn)化成多種小分子營養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味成分[1-3]，賦予甜面醬獨特的滋味、濃郁的香氣和誘人的色澤[4-5]，因此甜面醬常用于佐餐、烹飪、食品加工中調(diào)味賦色[6]。甜面醬釀造主要分為制曲和發(fā)酵兩個階段，在每個階段都有豐富的微生物參與促進(jìn)各種生化反應(yīng)。發(fā)酵微生物是發(fā)酵制品在整個生產(chǎn)過程中至關(guān)重要的因素之一[7]，決定著其最終成品的品質(zhì)。目前甜面醬的釀造大多采用自然發(fā)酵，沒有采用人工強化接種發(fā)酵，同時由于大多數(shù)甜面醬生產(chǎn)企業(yè)的研究條件簡陋，對發(fā)酵微生物的選育和接種發(fā)酵工藝研究不足[8]。

在甜面醬的醬醪發(fā)酵階段，產(chǎn)香酵母的代謝對甜面醬的揮發(fā)性風(fēng)味形成至關(guān)重要[9-12]。酵母菌首先利用原料中的可發(fā)酵糖進(jìn)行糖酵解和三羧酸循環(huán)反應(yīng)，產(chǎn)生醇類、醛類、酮類、酸類等物質(zhì)，再進(jìn)一步反應(yīng)生成酯類等成分，這些揮發(fā)性成分最終構(gòu)成了醬制品的主體香氣[13]。醬制品的香氣不僅與酵母的種類密切相關(guān)，添加方式的不同對其品質(zhì)和風(fēng)味的影響也較大[14-15]。王從從等[16]研究了易變球擬酵母和魯氏酵母兩種酵母添加方式對甜面醬的影響，發(fā)現(xiàn)先添加易變球擬酵母后添加魯氏酵母的方式有利于改善甜面醬的品質(zhì)，但該研究沒有探究不同酵母接種比例對產(chǎn)品品質(zhì)的影響。

在前期研究中，從豆醬曲中分離出一株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Waro03，該菌株在產(chǎn)酯能力上較其他酵母有明顯的優(yōu)勢[17]，因此在醬制品釀造中具有較高的應(yīng)用價值。通過常壓室溫等離子體（ARTP）誘變和進(jìn)化工程選育，得到的工程菌株ZMS57能夠耐受20%的鹽濃度，已將其應(yīng)用于醬油釀造[18]。因此，在本研究中，將ZMS57與醬制品釀造常用的魯氏酵母AS2.180應(yīng)用于甜面醬保溫發(fā)酵，并探究了不同添加方式（添加順序、添加比例）對甜面醬品質(zhì)和風(fēng)味的影響。本研究可為甜面醬保溫發(fā)酵工藝開發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

麩皮、面粉、土豆：成都市好樂購超市；魯氏酵母AS2.180（CICC 1379）：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，經(jīng)本實驗室篩選培育；異常威克漢姆酵母ZMS57：由實驗室選育。

1.2 試劑

葡萄糖、酵母粉、蛋白胨：北京奧博星生物科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸（分析純）、草酸、奎尼酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、2-甲基-3-庚酮（均為色譜純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；吐溫80、氯化鈉、丙三醇、苯酚、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）、乙醇（色譜純）：成都科隆化學(xué)品有限公司；甲醛（分析純）：上海展云化工有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

BioTek酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；BSC-250恒溫恒濕箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；G7000D氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 7890B氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)基配制

PDA斜面培養(yǎng)基：將土豆切塊放入鍋中，加水100 mL，煮至土豆松散綿軟，用紗布過濾，棄濾渣，加入純水將濾液定容至100 mL，加入葡萄糖2 g、瓊脂2 g，121 ℃滅菌15 min。

種曲培養(yǎng)基：向麩皮中加入質(zhì)量相同的水，混合均勻，分裝后滅菌。

成曲培養(yǎng)基：將使用PDA斜面培養(yǎng)基活化后的米曲霉接種至種曲培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)2～3 d，直至培養(yǎng)基中孢子呈綠色。

1.4.2 甜面醬發(fā)酵工藝

種曲培養(yǎng)：將PDA斜面培養(yǎng)基活化后的米曲霉接種至種曲培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)2～3 d，直至培養(yǎng)基中孢子呈綠色。

面糕曲（成曲）制備工藝流程：小麥粉→加水拌和→蒸料→冷卻→接菌→培養(yǎng)→面糕曲[4]。

選擇特制一等小麥粉（蛋白質(zhì)含量17%）。緩慢加入30%的水進(jìn)行拌和形成絮狀，將和好的面料放入容器中蒸制20 min。蒸料結(jié)束后置于曲盤上，冷卻至40 ℃以下后接入米曲霉。

按照SB/T 10315－1999中的方法對成曲培養(yǎng)基中米曲霉孢子數(shù)進(jìn)行計算。計算后接入米曲霉孢子量為1×107個/g濕料，將計算好的孢子均勻鋪灑在熟制后的面絮料上，然后與之混勻，進(jìn)行制曲。制曲溫度32 ℃，濕度90%，時間48 h。

甜面醬保溫發(fā)酵工藝流程：面糕曲（成曲）→入發(fā)酵容器→加鹽水→保溫發(fā)酵→加酵母→增香發(fā)酵[4]。

在無菌水中加入食鹽配制濃度為18%的鹽水[8]。將面糕曲置于發(fā)酵罐中，加入與面糕曲質(zhì)量為1∶1的鹽水。待鹽水全部滲入面糕曲后，蓋上發(fā)酵罐蓋，在45 ℃下高溫發(fā)酵15 d，每隔24 h攪拌一次。發(fā)酵結(jié)束后將甜面醬溫度降至30 ℃，將甜面醬平均分為9份，分別轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中，添加一定量酵母菌，發(fā)酵45 d，每隔5 d取樣進(jìn)行理化指標(biāo)的檢測。

酵母添加方式與添加量見表1，酵母先后添加時間差為10 d，酵母添加總量為1×107 CFU/g濕料。

1.4.3 理化指標(biāo)檢測

取2 g醬醪，加入50 mL的超純水混合均勻，50 ℃水浴20 min，水浴后以8 000 r/min離心5 min，取上清液，殘渣再加入超純水重復(fù)上述操作2次，收集上清液后定容至100 mL。

還原糖的測定：還原糖含量使用DNS法測定[4]：樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋，取0.5 mL稀釋液，加入1.5 mL DNS試劑、1 mL純水，沸水浴5 min，定容至10 mL，吸取200 μL反應(yīng)后溶液至96孔板，使用酶標(biāo)儀在540 nm下測量吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算還原糖含量。

總酸的測定：參考國標(biāo)GB 18186－2000中的方法測定總酸含量，吸取稀釋后樣品20 mL于250 mL燒杯中，加入60 mL純水，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至pH為8.20即停止滴定，記錄NaOH用量以計算總酸含量。

氨基酸態(tài)氮的測定：吸取稀釋后樣品20 mL于250 mL燒杯中，加入60 mL純水，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至pH為8.20，然后加入10 mL甲醛，繼續(xù)滴定至pH為9.20即停止滴定，用80 mL純水做空白對照。

氨基酸態(tài)氮含量=（V1-N）×C×0.014V3V2×100。

式中：V1為樣品滴定時消耗0.05 mol/L氫氧化鈉溶液毫升數(shù)；N為空白樣滴定時消耗0.05 mol/L氫氧化鈉溶液毫升數(shù)；C為氫氧化鈉溶液的當(dāng)量濃度（mol/L）；0.014為氮的毫克當(dāng)量；V2為取樣量；V3為稀釋倍數(shù)。

有機酸的測定：有機酸的測定參考王沛[19]的方法。

流動相的配制：準(zhǔn)確稱取KH2PO4 4.082 7 g，用適量純水溶解，定容至1 L，用磷酸調(diào)pH值至3.0±0.2，經(jīng)0.22 μm水系濾膜抽濾2遍，超聲脫氣30 min，冷卻至室溫備用。

樣品預(yù)處理：稱取甜面醬成品1.00 g，定容于25 mL容量瓶中。取一定量的稀釋液，離心后，取上清液，再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待上機檢測。

液相色譜條件：利用Agilent 1260高效液相色譜儀檢測，色譜柱：Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm），使用紫外檢測器檢測，檢測波長210 nm，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，流動相為KH2PO4溶液∶水為95∶5。

1.4.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

甜面醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC/MS）技術(shù)進(jìn)行測定。

HS-SPME萃取條件：稱取5.00 g的甜面醬樣品于15 mL頂空瓶中密封，加入內(nèi)標(biāo)2 μg/μL 2-甲基-3-庚酮1 μL。75 ℃下平衡45 min，樣品抽取20 min，解吸5 min。

色譜條件：采用石英毛細(xì)管柱Agilent 19091S-433UI HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為He，壓力32.0 kPa，流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣。升溫程序：40 ℃保持5 min后，以2 ℃/min的速率升至60 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min的速率升至150 ℃，最后以20 ℃/min的速率升至200 ℃。

質(zhì)譜條件：電子電離源（EI）；電子能量 70 eV；離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃；檢測器電壓350 V；質(zhì)量掃描范圍（m/z）：35～350。

定性：將得到的數(shù)據(jù)在儀器的NIST 14譜庫中進(jìn)行檢索和匹配，選擇匹配度高于70%的物質(zhì)。同時在相同色譜條件下對正構(gòu)烷烴進(jìn)行掃描，計算線性保留指數(shù)（retention index，RI），將計算值與NIST Chemistry WebBook中檢索的已發(fā)表文獻(xiàn)中RI比對。RI計算公式如下：

RI=Ta-TnTn+1-Tn+n×100。

式中：Ta為a物質(zhì)的保留時間；Tn為a物質(zhì)前一個正構(gòu)烷烴的保留時間；Tn+1為a物質(zhì)后一個正構(gòu)烷烴的保留時間；n為碳原子數(shù)。

定量：絕對含量根據(jù)其在總離子圖中的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積進(jìn)行比較，結(jié)果以“×10-2 μg/g”的形式表示絕對含量；各揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對含量采用面積歸一化法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母接種方式對甜面醬還原糖含量的影響

甜面醬中的還原糖主要來自原料中多糖的水解，一方面可以賦予甜面醬滋味，另一方面在保溫發(fā)酵過程中參與美拉德反應(yīng)而賦予甜面醬“醬色”，此外，還原糖還是保溫發(fā)酵過程中微生物生長的重要碳源。

加入酵母后甜面醬中的還原糖含量呈明顯下降趨勢，見圖1。無論酵母的接種順序如何，當(dāng)兩種酵母添加比例為1∶1時，其還原糖含量均比其他組低。說明兩種酵母添加比例為1∶1的添加方式更有利于兩種菌利用甜面醬中的還原糖代謝產(chǎn)生其他物質(zhì)。而A組的還原糖含量總體較G組與S組的還原糖含量更低，表明先添加魯氏酵母后添加異常威克漢姆酵母的順序更有利于兩種酵母菌利用甜面醬中的還原糖。在發(fā)酵結(jié)束第45天，A2組中還原糖含量為所有樣品中最低（20.02 g/100 g），即先添加魯氏酵母后添加異常威克漢姆酵母且兩種酵母添加比例為1∶1的添加方式能使兩種酵母更好地利用甜面醬醬醪中的還原糖，以生成其他風(fēng)味成分。

總酸和有機酸含量對甜面醬柔和口感的形成亦十分重要。由圖2可知，在發(fā)酵過程中，總酸含量均隨發(fā)酵時間的延長而逐漸升高，兩種酵母添加比例為1∶1（A2、G2、S2）更有利于甜面醬中酸類物質(zhì)的產(chǎn)生。A組中所有樣品的總酸含量均較G組與S組高，表明先添加魯氏酵母后添加異常威克漢姆酵母的順序有利于甜面醬總酸的產(chǎn)生。在發(fā)酵終端第45天，A2組總酸含量為9組中最高，達(dá)2.21 g/100 g。

由表2可知，當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后，有機酸含量最高的為A2 組（5.61 mg/g），且A組整體的有機酸含量相對于G組和S組更高，說明兩種酵母按1∶1的比例添加更有利于甜面醬有機酸的合成，而除S2低于S1外，另外兩組樣品中A1、A3低于A2， G1、G3低于G2，說明先添加魯氏酵母后添加異常威克漢姆酵母的順序更有利于甜面醬有機酸的合成。

在9組甜面醬中均檢測出7種有機酸，其中檸檬酸含量最高，尤其在A2組中達(dá)到2.52 mg/g；其次為乙酸，同樣在A2組中含量最高，達(dá)1.43 mg/g，檸檬酸富有水果香氣，乙酸則可以調(diào)和甜面醬的口感和風(fēng)味。各種有機酸的組成為甜面醬提供了更加豐富的風(fēng)味。

2.3 不同酵母接種方式對甜面醬氨基酸態(tài)氮含量的影響

氨基酸態(tài)氮是醬制品的重要指標(biāo)之一，其含量與醬制品的滋味密切相關(guān)，同時還可以與還原糖發(fā)生褐變反應(yīng)，形成“醬色”[20]。

由圖3可知，9組甜面醬樣品中氨基酸態(tài)氮的含量變化趨勢基本一致，在整個發(fā)酵過程中逐漸上升，尤其前35 d上升趨勢明顯，主要是因為米曲霉與酵母的酶共同作用將蛋白質(zhì)原料快速分解，生成大量氨基酸態(tài)氮。而40 d后酶活力降低，在氨基酸態(tài)氮生成速率降低的同時，美拉德反應(yīng)和微生物代謝繼續(xù)消耗氮源，造成氨基酸態(tài)氮生成速率和消耗速率達(dá)成平衡，所以其含量在后期趨于平穩(wěn)。

兩種酵母添加比例為1∶1（A2、G2、S2）更有利于甜面醬中氨基酸態(tài)氮物質(zhì)的積累。而A組中所有樣品的氨基酸態(tài)氮含量均較G組與S組高，表明先添加魯氏酵母后添加異常威克漢姆酵母的添加順序有利于甜面醬中氨基酸態(tài)氮的產(chǎn)生。在發(fā)酵終端第45天，A2組為9組中氨基酸態(tài)氮含量最高的，為0.49 g/100 g，即先添加魯氏酵母后添加異常威克漢姆酵母且兩種酵母添加比例為1∶1更利于甜面醬積累氨基酸態(tài)氮。

2.4 不同酵母接種方式對甜面醬揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響

不同種類酵母發(fā)酵所產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)種類和含量各不相同，利用 HS-SPME-GC/MS測定9組甜面醬樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果見表3。

由表3可知，9組甜面醬樣品中共鑒定出49種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中共有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)包含27種。檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要包括酸類、醇類、酯類、醛類、酮類、烴類以及一些其他雜環(huán)類化合物或芳香族化合物，其中，酸類物質(zhì)含量占比為5.31%～9.50%，醇類物質(zhì)含量占比為30.78%～35.15%，酯類物質(zhì)含量占比為3.84%～5.48%，醛類物質(zhì)含量占比為36.41%～40.42%，酮類物質(zhì)含量占比為12.14%～15.34%，其他成分含量占比為0.72%～4.03%，即醛類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量最多，醇類次之。從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量來看，A組樣品中的風(fēng)味成分種類較G組和S組多，含量也更高，添加比例為1∶1時，揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類和含量更高。揮發(fā)性風(fēng)味成分絕對含量最高的為A2組，達(dá)到84.36×10-2μg/g，最低的為G3組，達(dá)到47.70×10-2μg/g。

由圖4可知，通過主成分分析（PCA），兩個主成分PC1和PC2解釋了總方差的58.6%（分別為43.4%和15.2%），表明樣品在兩個主成分上均發(fā)生分離，并且同組別中的平行樣本呈現(xiàn)明顯的聚攏趨勢。說明不同酵母添加方式和添加比例對風(fēng)味成分的影響較大。對3種不同甜面醬樣品風(fēng)味成分的積累模式差異通過聚類熱圖進(jìn)行顯示，見圖5。

結(jié)果表明，在不同組別中，48種物質(zhì)有明顯差異，其中A2組風(fēng)味成分種類最多，含量也最高，包括5-四氫呋喃-2-羧酸乙酯、3，3-二甲基-正己烷、2-甲基丁酸-3-甲基丁酯、5-甲基-庚酮、苯乙醛、苯甲醛、1-辛烯-3-醇等成分。這表明先添加魯氏酵母后添加異常威克漢姆酵母且兩種菌添加比例為1∶1時，甜面醬的風(fēng)味成分種類更多，含量更高，說明該接種方式更有利于甜面醬風(fēng)味的形成。

3 結(jié)論

對比甜面醬保溫發(fā)酵過程中不同耐鹽產(chǎn)香酵母的添加方式和添加比例，結(jié)果表明，先添加魯氏酵母后添加異常威克漢姆酵母且二者比例為1∶1時更有利于氨基酸態(tài)氮和有機酸的積累。對揮發(fā)性風(fēng)味成分而言，甜面醬樣品中醛類、醇類、酮類的相對含量占比前三。當(dāng)兩種菌的添加比例為1∶1時，對甜面醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生更有利。其中，揮發(fā)性風(fēng)味成分種類和數(shù)量最多的為A2組，共45種，含量達(dá)84.36×10-2 μg/g，最少的為G3組，共30種，含量為47.70×10-2 μg/g。以上結(jié)果表明，先添加魯氏酵母后添加異常威克漢姆酵母且兩種酵母添加比例為1∶1時時更有利于甜面醬品質(zhì)和風(fēng)味的提升。

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