林偉弟 楊松 王瑞安 孟靈 鐘青華 謝玲瑤 段霞霞 譚佳旋 蔣學余

〔摘要〕 目的 觀察電針頸夾脊穴對神經(jīng)根型頸椎病（cervical spondylotic radiculopathy， CSR）神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角CX3C趨化因子配體1（C-X3-C motif chemokine ligand 1， CX3CL1）、腺苷酸環(huán)化酶3（adenylate cyclase 3， AC3）、降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide， CGRP）和P物質(zhì)（substance P， SP）表達的影響，探討電針頸夾脊穴治療CSR引起的神經(jīng)病理性疼痛的相關鎮(zhèn)痛機制。方法 48只雄性SD大鼠隨機分為空白組、假手術組、模型組和電針組，每組12只。電針組給予電針雙側C6、C7夾脊穴，模型組和假手術組在電針組干預同時間點進行綁縛處置。觀察大鼠在術前第1天、術后第14 天、術后第28天患側前足熱刺激縮足反射潛伏期（paw withdrawal thermal latency， PWTL）的變化，采用Western blot法和Real time PCR法檢測患側脊髓背角CX3CL1蛋白和基因的表達，采用免疫熒光法檢測患側脊髓背角AC3、CGRP和SP的表達。結果 各時間點與空白組比較，假手術組患側前足PWTL差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；術后第14天，與假手術組比較，模型組和電針組大鼠患側前足PWTL均減少（P<0.01）；術后第28天，與模型組大鼠比較，電針組大鼠患側前足PWTL升高（P<0.01）；電針組大鼠術后第28天患側前足PWTL較術后第14天升高（P<0.01）。與空白組比較，假手術組大鼠患側脊髓背角CX3CL1、AC3、CGRP、SP蛋白和CX3CL1基因的表達差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與假手術組比較，模型組大鼠患側脊髓背角CX3CL1、AC3、CGRP、SP蛋白和CX3CL1基因的表達均明顯升高（P<0.01）；與模型組相比，電針組大鼠患側脊髓背角CX3CL1、AC3、CGRP、SP蛋白和CX3CL1基因的表達均明顯降低（P<0.05）。結論 電針頸夾脊穴治能夠改善CSR神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠的熱痛覺過敏，并通過抑制脊髓背角初級感覺神經(jīng)元的CX3CL1、AC3、CGRP和SP合成表達，減輕了神經(jīng)炎性反應，降低脊髓背角初級感覺神經(jīng)元的興奮性，從而阻礙神經(jīng)中樞的敏化。

〔關鍵詞〕 神經(jīng)根型頸椎病；電針；神經(jīng)病理性疼痛；脊髓背角；CX3C趨化因子配體1；腺苷酸環(huán)化酶3；降鈣素基因相關肽；P物質(zhì)

〔中圖分類號〕R245 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.021

Effects of electroacupuncture at cervical points of Jiaji （EX-B2） on the expression levels of CX3CL1， AC3， CGRP and substance P in the spinal dorsal horn of rats with neuropathic

pain due to cervical spondylotic radiculopathy

LIN Weidi1， YANG Song1， WANG Rui'an1， MENG Ling1， ZHONG Qinghua1， XIE Lingyao1，

DUAN Xiaxia1， TAN Jiaxuan1， JIANG Xueyu2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. Yueyang Hospital of Chinese Medicine， Yueyang， Hunan 414000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of electroacupuncture at cervical points of Jiaji （EX-B2） on the expression levels of C-X3-C motif chemokine ligand 1 （CX3CL1）， adenylate cyclase 3 （AC3）， calcitonin gene-related peptide （CGRP） and substance P （SP） in the spinal dorsal horn of rats with neuropathic pain caused by cervical spondylotic radiculopathy （CRS）， and to investigate its analgesic mechanism in such condition. Methods A total of 48 male SD rats were randomly divided into blank group， sham-operated group model group， and electroacupuncture group， with 12 rats in each group. Electroacupuncture was performed at bilateral C6-C7 Jiaji （EX-B2） points of rats in electroacupuncture group. At the same time， rats in model group and sham-operated group were only bundled， without any other intervention. The changes of paw thermal withdrawal latency （PWTL） of the affected rat forefoot after thermal stimulation were observed 1 d before operation， as well as 14 and 28 d after operation. Western blot and real-time PCR were used to test the expression levels of CX3CL1 protein and gene in the spinal dorsal horn of the affected side， respectively. The expression levels of AC3， CGRP and SP in the same spot were determined by immunofluorescence. Results Compared with the blank group at each time point， there was no statistically significant difference in PWTL of the affected rat forefoot in sham-operated group （P>0.05）; on the 14th day after operation， compared with sham-operated group， the PWTL of the affected rat forefoot in model group and electroacupuncture group decreased （P<0.01）; on the 28th day after operation， compared with model group， the PWTL of the affected rat forefoot in electroacupuncture group increased （P<0.01）， and it was higher than that on the 14th day after operation （P<0.01）. Compared with blank group， there was no significant difference in the expression levels of CX3CL1， AC3， CGRP， SP proteins， and CX3CL1 gene in the dorsal horn of the affected rat spinal cord in sham-operated group （P>0.05）; compared with sham-operated group， those indices in model group significantly went up （P<0.01）; compared with model group， those indices in electroacupuncture group significantly dropped （P<0.05）. Conclusion Electroacupuncture at cervical points of Jiaji （EX-B2） can improve the thermal hyperalgesia of rats with CSR neuropathic pain， and reduce the neuroinflammatory response and excitability of the primary sensory neurons in the spinal dorsal horn by inhibiting the synthetic expressions of CX3CL1， AC3， CGRP and SP， thus impeding the sensitization of the nerve center.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 ecervical spondylotic radiculopathy; electroacupuncture; neuropathic pain; spinal dorsal horn; C-X3-C motif chemokine ligand 1; adenylate cyclase 3; calcitonin gene-related peptide; substance P

神經(jīng)根型頸椎病（cervical spondylotic radiculopathy， CSR）是由于頸椎間盤退變或突出及骨質(zhì)增生等病變使椎間孔變窄，卡壓頸神經(jīng)從而引起各種癥狀和體征的綜合征，以頸部不適和手臂放射性根性神經(jīng)痛、麻木和肌力減退等為主要臨床表現(xiàn)[1-2]。CSR是由于頸神經(jīng)根被壓迫或受刺激等引起的常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病，引起的放射性根性神經(jīng)痛屬于神經(jīng)病理性疼痛的范圍[3-4]。由于現(xiàn)代生活和工作模式的改變，長期低頭伏案工作等造成頸椎病的發(fā)病率逐年上升，且表現(xiàn)出年輕化的趨勢，其中CSR的分型占頸椎病所有分型的60%～70%[5]。治療上有手術治療和非手術治療，最近研究表明首選非手術治療，如針灸、推拿等均可取得良好療效，但其作用機制仍未明確[6-7]。本實驗通過觀察電針夾脊穴對CSR模型大鼠患側前足熱刺激縮足反射潛伏期（paw withdraw thermal latency， PWTL），脊髓背角CX3C趨化因子配體1（C-X3-C motif chemokine ligand 1， CX3CL1）、腺苷酸環(huán)化酶3（adenylate cyclase 3， AC3）、降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide， CGRP）、P物質(zhì)（substance P， SP）表達的影響，探討電針頸夾脊穴治療CSR引起的神經(jīng)病理性疼痛的相關鎮(zhèn)痛機制。

1 材料與方法

1.1 ?實驗動物

48只雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物中心實驗室，飼養(yǎng)濕度為50%～70%，溫度為24～26 ℃。本實驗通過動物福利倫理會審批（審批號：SLBH-201910140006）。

1.2 ?主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：30092436）；電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，型號：SDZ-V型）；Anti-CX3CL1抗體、Anti-CGRP抗體、Anti-AC3抗體、Anti-Substance P抗體（英國Abcam公司，批號：ab235110、ab235031、ab214122、ab223125）；熒光標記二抗、RIPA裂解液、緩沖液（碧云天生物工程有限公司，批號：A0208、202105071、D7182L）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號：JR00532）；反轉錄試劑盒（日本Takara公司，批號：RT0213-01）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：ab92742）；熒光定量PCR儀（美國Roche公司，批號：11684817923）。

TGL-16B型離心機（上海安亭科學儀器廠）；EMFC7冰凍切片機、TCSSP8型激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）；ZH-200型熱刺痛儀（安徽正華生物儀器設備有限公司）；D1524R型低溫高速離心機（大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）；MULTISKAN MK3型酶標儀（美國Thermo公司）；GNP-9050型恒溫孵育箱（上海精宏實驗設備有限公司）；MDF-339型超低溫冰箱（日本SANYO公司）；SK-1型微量振蕩器（金壇市醫(yī)療器械廠）；VE-680微型垂直電泳槽、ESP-100型電泳儀、VE-186型轉移電泳槽（上海天能科技有限公司）。

1.3 ?實驗分組與模型制備

大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為空白組、模型組、假手術組、電針組，每組12只。參照竇夏睿等[8]的方法制備CSR神經(jīng)病理性疼痛模型。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（45 mg/kg），俯臥位姿勢固定，標記第2胸椎棘突，以C7為中心，常規(guī)備皮，消毒，鋪巾，在大鼠后正中線做一長約3.5 cm的切口，暴露并咬掉左側C6/C7關節(jié)突，部分去除左側C6橫突，分離并暴露出左側C7脊神經(jīng)，C7背根神經(jīng)節(jié)遠端神經(jīng)根用6-0絲線結扎，結扎松緊度以倒置顯微鏡觀察神經(jīng)表面動脈受壓但仍有血流通過為度，由里到外逐層縫合切口?？瞻捉M不做造模處置，假手術組僅暴露神經(jīng)不結扎，模型組和電針組大鼠進行模型制備。為保證結扎力度一致、組間平衡和可比性，所有手術操作均由一人完成。

1.4 ?干預方法

空白組正常喂養(yǎng)標準飼料，未給予任何干預。電針組術后第15天開始電針干預，取雙側C6、C7夾脊穴（穴位定位參照中國針灸學會實驗針灸委員會制定的動物針灸穴位圖譜[9]），選用華佗牌一次性針灸針（0.35 mm×13 mm）直刺進針，進針深度0.3～0.6 cm，行輕捻轉提插手法，以單側腧穴為一組，針柄連接華佗牌SDZ-H型電子針療儀進行電針干預（波形：密波頻率50 Hz、疏波頻率10 Hz，電流以局部肌肉出現(xiàn)震顫為度），20 min/次，1次/d，連續(xù)干預14 d。模型組和假手術組在電針組干預同時間點進行捆綁處置。

1.5 ?檢測指標及方法

1.5.1 ?患側前足PWTL測定 ?分別在術前第1天、術后第14天、術后第28天對各組大鼠進行患側前足熱刺激誘發(fā)痛測定。將大鼠置于透明籠子中，用ZH-200型熱刺痛儀照射大鼠左前足底，大鼠若出現(xiàn)快速縮足、揚足或者舔足反應則停止照射，記錄照射持續(xù)時間。每隔5 min測量1次，重復測量3次，取3次讀數(shù)的平均值。

1.5.2 ?Western blot法檢測大鼠脊髓背角CX3CL1蛋白表達 ?大鼠完成熱刺激誘發(fā)痛測定后，腹腔注射過量1%戊巴比妥鈉處死。每組各取3只大鼠，參照杜俊英等[10]所述方法提取脊髓，取左側C6～C7脊髓背角組織，加入適量RIPA裂解液在4 ℃冰箱放置裂解20 min，4 ℃、11 000 r/min、半徑為8.61 cm離心10 min，取上清液（細胞總蛋白），BCA試劑盒蛋白定量。SDS-PAGE電泳，轉膜，0.5 mL麗春紅染色30 s，觀察轉印效果，去除染液，封閉，加入CX3CL1抗體（1∶1000），4 ℃過夜。TBST洗膜3次（每次10 min）。加入熒光標記的二抗，室溫1 h振蕩孵育。TBST洗膜3次（每次10 min）。ECL發(fā)光顯影，置于自動凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值。

1.5.3 ?Real-time PCR檢測大鼠脊髓背角CX3CL1基因的表達 ?大鼠完成熱刺激誘發(fā)痛測定后，腹腔注射過量1%戊巴比妥鈉處死。每組各取3只大鼠，提取脊髓，取左側C6～C7脊髓背角組織，采用Trizol法對樣本RNA進行提取，并按照反轉錄試劑盒要求反轉錄合成cDNA，在低溫下保存，并在PCR管中制備PCR反應混合液，混勻后于PCR機上進行擴增，每個樣品重復3個對照，利用2-ΔΔCT法計算CX3CL1基因的相對表達量。

1.5.4 ?免疫熒光法檢測大鼠脊髓背角AC、CGRP、SP表達 ?大鼠完成熱刺激誘發(fā)痛測定后，腹腔注射過量1%戊巴比妥鈉處死。每組各取5只大鼠，提取脊髓，取左側C6～C7脊髓背角組織，常規(guī)固定、脫水、液氮速凍、切片。取冰凍組織切片，室溫放置使其干燥后，組化筆圈好待測組織，PBS浸潤10 min，4%多聚甲醛室溫下浸泡10 min，PBS漂洗切片3遍，每遍5 min，0.5% Txiton X-100室溫通透5 min，PBS漂洗切片3遍，每遍5 min，室溫封閉1 h，加入一抗（Anti-AC3抗體、Anti-CGRP抗體、Anti-Substance P抗體，1/100）4 ℃孵育過夜，0.1% BSA/TBST漂洗3遍，每遍5 min，避光加入熒光二抗室溫孵育1 h，0.1% BSA/TBST漂洗3遍，每遍5 min，DAPI避光孵育5 min染核，PBS漂洗3遍，每遍5 min，封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡400倍下觀察并采圖。每只大鼠隨機取3張切片，每張切片觀察3個視野，運用Image-pro Plus 6.0軟件計算免疫熒光平均光密度值（平均光密度值=積分光密度/像素面積），取3張切片免疫熒光光密度的平均值為其密度值。

1.6 ?統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進行處理。計量資料用“ｘ±s”表示，組間比較若滿足正態(tài)性且方差齊時采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗，方差不齊時選擇Tamhane T2和Dunnett T3法進行方差檢驗和兩兩比較，若不滿足正態(tài)性時采用秩和檢驗，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ?各組大鼠患側前足PWTL比較

組間比較：術前第1天，4組大鼠患側前足PWTL比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各時間點與空白組比較，假手術組大鼠患側前足PWTL差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。術后第14天，與假手術組比較，模型組和電針組大鼠患側前足PWTL均減少（P<0.01）；模型組和電針組大鼠患側前足PWTL比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。術后第28天，與模型組大鼠比較，電針組大鼠患側前足PWTL升高（P<0.01）。組內(nèi)比較：空白組、假手術組和模型組術后第14天和術后第28天患側前足PWTL自身前后比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；電針組術后第28天大鼠患側前足PWTL較術后第14天升高（P<0.01）。詳見圖1。

2.2 ?各組大鼠脊髓背角CX3CL1相對表達水平比較

與空白組比較，假手術組大鼠脊髓背角CX3CL1蛋白和基因表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與假手術組相比，模型組大鼠脊髓背角CX3CL1蛋白和基因表達明顯增多（P<0.01）；與模型組相比，電針組大鼠脊髓背角CX3CL1蛋白和基因表達明顯減少（P<0.01）。詳見表1、圖2。

2.3 ?各組大鼠脊髓背角AC、CGRP、SP表達比較

與空白組相比，假手術組大鼠脊髓背角AC、CGRP、SP平均光密度值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與假手術組比較，模型組大鼠脊髓背角AC、CGRP、SP平均光密度值明顯增多（P<0.01）；與模型組相比，電針組大鼠脊髓背角AC、CGRP、SP平均光密度值明顯減少（P<0.05）。詳見圖3—5。

3 討論

CSR主要表現(xiàn)為頸肩部疼痛，伴有神經(jīng)根分布一致的放射性根性疼痛，嚴重者可能伴有功能障礙，影響人們的生活質(zhì)量[11]。中醫(yī)學認為，神經(jīng)根型頸椎病屬于“頸痹”“眩暈”范疇?！端貑枴た姶陶撈吩唬骸靶翱陀谔栔j，令人頭項痛……”本研究選取的頸夾脊穴位于膀胱經(jīng)和督脈之間。督脈總督一身之陽氣，有“陽脈之海”之稱?！鹅`樞·經(jīng)脈》曰“足太陽膀胱經(jīng)……是主筋所生病者”，且膀胱經(jīng)挾頸兩側循行于人體陽位腰背部，又為多氣多穴之經(jīng)，“經(jīng)脈所過，主治所及”，故針刺可以達到祛瘀散結、柔筋養(yǎng)脈、緩解肌肉疼痛的目的。從神經(jīng)區(qū)域分布出發(fā)，頸部夾脊穴每穴下都有從相應的椎骨下方發(fā)出的脊神經(jīng)后支及動靜脈叢，刺激夾脊穴可通過影響脊神經(jīng)的傳導調(diào)節(jié)肢體的感覺和運動功能[12]。研究表明，刺激夾脊穴抑制疼痛的機制可能是通過調(diào)節(jié)疼痛相關蛋白基因的表達[13]。

CSR的發(fā)病機制以機械壓迫學說[14]、自身免疫學說[15]和化學性神經(jīng)根炎學說[16]3種學說為主，但神經(jīng)炎癥損傷是其病理的共同基礎，屬于神經(jīng)病理性疼痛。DONNELLY等[17]研究表明，電針治療對神經(jīng)病理性疼痛有顯著鎮(zhèn)痛作用。本實驗通過電針C6、C7夾脊穴治療CSR大鼠，實驗結果顯示，經(jīng)電針干預后，大鼠PWTL顯著升高，表明電針能改善CSR所致神經(jīng)病理性疼痛的熱敏痛，與既往研究相同。

神經(jīng)病理性疼痛常由多種復雜機制引起，動物實驗表明，神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持與外周敏化和中樞敏化的發(fā)生關系密切[18]。CGRP為多功能神經(jīng)肽，可作為促炎神經(jīng)肽與其他炎性介質(zhì)相互作用，產(chǎn)生外周敏化的作用；或是與其受體結合，激活第二信使系統(tǒng)促進中樞敏化[19]。研究表明，結扎大鼠坐骨神經(jīng)，CGRP含量升高，并導致異常性疼痛和痛覺過敏[20]。而α-CGRP基因敲除的小鼠在熱刺激下疼痛敏感性降低，表明CGRP與痛覺過敏相關，且疼痛強度與CGRP含量表達呈正相關性[21]。AC是一種膜整合蛋白，為調(diào)控細胞內(nèi)第二信使cAMP的信號中樞[22]。SP是一種速激肽，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中，對神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生起關鍵作用。ZIEGLG？魧NSBERGER等[23]研究表明，SP作為疼痛遞質(zhì)在多種慢性疼痛中參與疼痛在脊髓中樞的傳導和調(diào)制。既往研究表明，SP可激活傷害感受神經(jīng)元完成疼痛信號的傳遞[24]。而CGRP可通過競爭SP的降解內(nèi)肽酶增強SP的生物活性[25]。本實驗結果顯示，模型組大鼠脊髓背角的AC3、CGRP和SP的表達量較假手術組明顯增加，表明造模成功后，脊髓背角的AC3、CGRP和SP表達水平較無損狀態(tài)高，其表達的強度與周圍神經(jīng)的損傷密切相關，說明AC3、CGRP和SP表達的升高與CSR所致的神經(jīng)病理性疼痛機制密切相關。與模型組比較，電針組的AC3、CGRP和SP的表達量明顯降低，而CGRP與相應受體的結合能夠激活AC的信號中樞促進中樞敏化，與SP競爭降解酶而增強SP的活性，實驗結果提示電針頸夾脊穴可能通過抑制CGRP的表達，從而抑制AC信號中樞的傳遞，或降低SP的活性和表達，從而抑制神經(jīng)元的興奮信號通路的傳遞，阻礙脊髓背角的中樞敏化，減輕神經(jīng)被壓迫引起的神經(jīng)病理性疼痛。故電針頸夾脊穴治療CSR相關機制可能與其抑制AC3、CGRP和SP的表達，從而抑制神經(jīng)元細胞的興奮性，降低疼痛信號的傳遞有關。

趨化因子及其受體介導的信號轉導通路是疼痛傳導和治療的重要分子機制[26]。研究表明，趨化因子在神經(jīng)炎性反應過程中的合成顯著升高，從而激活傳入感覺神經(jīng)中的趨化因子受體，活化的趨化因子受體能激發(fā)神經(jīng)元產(chǎn)生強烈的興奮從而引起疼痛[27-28]。CX3CL1通過傳遞神經(jīng)損傷產(chǎn)生的疼痛信息來調(diào)控疼痛[29]。神經(jīng)元釋放的CX3CL1介導的信號可刺激促炎細胞因子的釋放而促進疼痛的發(fā)生[30]。本實驗結果顯示，與假手術組比較，模型組和電針組的趨化因子CX3CL1蛋白和基因的表達水平均明顯上調(diào)；與模型組相比，電針組的趨化因子CX3CL1蛋白和基因的表達明顯降低。上述結果說明電針頸夾脊穴可以有效抑制趨化因子CX3CL1蛋白和基因的表達，使趨化因子CX3CL1及其相關受體介導的信號轉導通路傳導降低或中斷，因此，抑制了神經(jīng)炎性的反應從而抑制神經(jīng)元的興奮引起的疼痛。

綜上所述，電針頸夾脊穴治能夠改善CSR神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠的熱痛覺過敏，并通過抑制脊髓背角初級感覺神經(jīng)元的CX3CL1、AC3、CGRP和SP合成表達，減輕神經(jīng)炎性反應，降低脊髓背角初級感覺神經(jīng)元的興奮性，從而抑制神經(jīng)中樞的敏化。

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〔收稿日期〕2022-08-09

〔基金項目〕科技部研發(fā)計劃重點專項（2018YFC1707806）；湖南省自然科學基金面上項目（2019JJ40217）；湖南省臨床醫(yī)療技術創(chuàng)新引導項目（S2020SFYLJS0039）。

〔第一作者〕林偉弟，男，碩士研究生，研究方向：針刺作用機制的研究。

〔通信作者〕*蔣學余，男，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，E-mail：346252900@qq.com。