許文武，侯梅芳，潘棟宇，周建

上海應用技術學院，上海 201418

多環(huán)芳烴（芘）對斜生柵藻的毒性研究

許文武，侯梅芳*，潘棟宇，周建

上海應用技術學院，上海 201418

多環(huán)芳烴是自然界中常見的有機污染物。以多環(huán)芳烴（芘）為研究對象，采用實驗室培養(yǎng)斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）的方法，測定藻細胞密度和光合色素（葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素）含量的變化，研究不同質量濃度芘對斜生柵藻的毒性效應，設置5個芘質量濃度梯度（5、10、20、30、50 mg·L-1）和1個對照組，通過同期生長的處理組與對照組的藻細胞數(shù)進行比較以及抑制率計算對實驗結果分析。結果表明：芘對斜生柵藻的生長有一定的抑制作用，隨著芘質量濃度增加，斜生柵藻生長受到抑制作用越明顯，呈現(xiàn)出良好時間-效應和劑量-效應的關系；經回歸分析，求得2 d，4 d和6 d芘抑制斜生柵藻生長的半抑制濃度（EC50）分別為44.07，29.23和20.99 mg·L-1。斜生珊藻的生長率隨處理濃度的增加而逐漸降低。同時通過肉眼和顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)斜生柵藻藻的顏色隨芘濃度增加從翠綠色變?yōu)榘咨?。芘處理斜生柵?d后，斜生柵藻光合色素含量和Ca/Cb隨芘濃度增加而明顯下降，并且變化趨勢與生長率基本一致。其中斜生柵藻的葉綠素a含量的減少比葉綠素b和類胡蘿卜素快。芘可能通過抑制藻的光合作用產生毒害效應，從而抑制藻類生長。

芘；斜生柵藻；急性毒性；光合色素；回歸分析

多環(huán)芳烴（PAHs）是由兩個或兩個以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列組合成的一類中性或非極性有機化合物，它是煤、石油、煙草等有機物不完全燃燒時產生的揮發(fā)性碳氫化合物（孫鐵珩等，2005；Liu et al.，2007）。因其具有致癌、致畸、致突變作用及生物難降解性而受到廣泛重視（萬寅婧等，2005；姜永海等，2009）。1979年，16種多環(huán)芳烴被美國環(huán)保局（EPA）列為優(yōu)先有機污染物（劉建武等，2002）。隨著現(xiàn)代工業(yè)和農業(yè)的迅速發(fā)展，我國湖泊普遍存在PAHs污染，且污染程度逐年呈上升趨勢（謝武明等，2004；Gao et al.，2007a；Zhu et al.，2008）。

藻類作為水生生態(tài)系統(tǒng)的主要初級生產者，對維持整個生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定起著十分關鍵的作用，因而成為監(jiān)測評價水環(huán)境質量的重要指標（鄧惜汝等，2014）。斜生柵藻是一種極為常見的浮游植物，易獲得、個體小、繁殖快且對毒物敏感，并能從水相中吸收有毒物質通過食物鏈將其轉移到上一級生物體中（Parr et al.，2002；Ma et al.，2002；Yu et al.，2014；楊彎彎等，2013），且急性毒性試驗在短期內可以獲得毒性數(shù)據(jù)。斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）是一種很好的受試生物，因此本實驗選擇斜生柵藻作為研究對象，以湖泊水中PAHs濃度較高的芘為PAHs代表污染物，探討芘對斜生柵藻生長的影響，為制定芘等PAHs相關的環(huán)境標準提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

芘（Pyrene），購自國藥集團化學有限公司。

斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）購自中國科學院水生生物研究所，藻液用HB-4培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 實驗用液的制備

HB-4培養(yǎng)基主要成分：(NH4)2SO42 g·L-1，K2HPO40.15 g·L-1，CaCl20.15 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.8 g·L-1，NaHCO31 g·L-1，KCl 0.25 g·L-1，F(xiàn)eCl31.5 mL·L-1和土壤浸提液20 mL。

土壤浸提液的制備：采取天然未污染土壤500 g，加蒸餾水1000 mL后攪勻，浸泡1 d，100 ℃水浴鍋加熱2 h，上清液過濾，滅菌，冷藏，保存。

1.3 馴化培養(yǎng)

實驗前一周，斜生柵藻于培養(yǎng)箱中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度(24±2) ℃，光照強度4000 lx，光暗比12 h∶12 h，每天搖動培養(yǎng)瓶3～5次，使藻類生長進入對數(shù)生長期。在整個培養(yǎng)過程，各操作步驟均經過滅菌處理。

1.4 多環(huán)芳烴（芘）對斜生柵藻的毒性作用

將芘溶于丙酮配置成一定質量濃度的母液，丙酮作為助溶劑。根據(jù)預實驗結果，設置芘對斜生柵藻的急性毒性試驗的質量濃度梯度為 5、10、20、30和 50 mg·L-1，用培養(yǎng)基進行稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。取對數(shù)生長期的斜生柵藻加入100 mL的錐形瓶中，再加入培養(yǎng)基稀釋已配置的芘母液到所需質量濃度，每個錐形瓶的培養(yǎng)藻液體積為50 mL，使各藻類的起始密度為6×105cells·mL-1左右，每組設3個重復，另各設未含芘培養(yǎng)的藻液作對照，將藻液放入上述條件下進行培養(yǎng)，實驗周期為6 d。每隔48 h取藻液采用血球計數(shù)板計數(shù)，測定藻細胞密度（cells·mL-1）和650 nm波長處的光密度值。

1.5 指標測定

1.5.1 芘對斜生柵藻EC50的測定

每隔48 h取藻液采用血球計數(shù)板計數(shù)，測定藻細胞密度（cells·mL-1），連續(xù)測定 6 d。用概率單位-質量濃度法計算出6 d半抑制效應濃度（EC50）。計算過程如下（許文武等，2011）：

抑制率(%)=(μck-μtox/μck)×100%

式中：μck為對照組藻的生長量（cells·mL-1），μtox為有共試化合物生長量（cells·mL-1）。

平均比生長速率（μ）計算公式為：μ=(lnNn-lnN1)/(tn-t1)

式中：N1為 t1時的藻細胞數(shù)（cells·mL-1），Nn為tn時的藻細胞數(shù)（cells·mL-1）。

根據(jù)芘對藻抑制率的概率單位和相應的質量濃度，用直線回歸法得到質量濃度效應方程，計算出半效應濃度EC50（mg·L-1）。

1.5.2 芘對斜生柵藻光合色素含量影響的測定

培養(yǎng)第6天，取各濃度組10 mL藻液，4000 r·min-1離心10 min，取上清液；加入5 mL體積分數(shù)80%（V/V）丙酮，搖勻，在4 ℃冰箱中避光抽提24 h；再10000 r·min-1離心10 min，取上清液置于1 cm石英比色杯中，以80%丙酮為參比，于721型分光光度計中測量663、645和470 nm波長處抽提液的吸光度值。葉綠素含量計算過程如下（戴榮繼等，2004）：

式中：Ca為葉綠素a含量（mg·L-1）；Cb為葉綠素 b含量（mg·L-1）；Ck為類胡蘿卜素含量（mg·L-1）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用Origin 8.0作圖分析和SPSS V17.0軟件包進行獨立樣本進行方差分析，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異，計算出EC50的95%置信限。

2 結果與討論

2.1 不同濃度的多環(huán)芳烴（芘）對斜生柵藻生長的影響

用不同質量濃度（5、10、20、30和50 mg·L-1）多環(huán)芳烴（芘）分別處理藻液，斜生柵藻的生長曲線發(fā)生改變見圖1。由圖1可以看出，加了芘的各實驗組中，藻細胞生長受到不同程度的抑制，低質量濃度（0～10 mg·L-1）的芘對藻細胞生長影響不大，高質量濃度（20～50 mg·L-1）組細胞的生長從第 2天開始就受到較強的抑制，細胞的死亡速度大于生長速度，藻細胞密度逐漸降低。隨著芘處理時間的延長，抑制作用越強。從表1也可以看出，斜生柵藻對照組中的比增長率一直是正值，說明藻的生長符合生長狀況。實驗組中只有兩組低質量濃度（5和10 mg·L-1）處理的比增長率是正值外，其他幾組均有負值出現(xiàn)，說明藻是呈負增長的，并呈現(xiàn)出良好時間-效應和劑量-效應的關系。

圖1 不同芘質量濃度（mg·L-1）對斜生柵藻的生長曲線Fig. 1 Growth curve of S. obliquus in different mass concentration (mg·L-1) of pyrene

根據(jù)圖1的生長結果，用上述方法得到不同時間的概率單位-質量濃度直線方程：概率單位(y)=b×質量濃度(x)+a，當概率單位為 5時，計算出 EC50值（見表2）。由表2可知，芘對斜生柵藻2、4和6 d的EC50分別為44.07、29.23和20.99 mg·L-1，觀察各個時間段的EC50值，第6天最敏感，其值最小。本研究結果表明EC50隨著暴露天數(shù)的延長，斜生柵藻對芘的抗性逐漸降低，藻細胞恢復速度緩慢。關于多環(huán)芳烴對藻類的毒性作用研究，先前已有報道，如Okay et al.（2002）研究表明芘對三角褐指藻的EC50為70～80 μg·L-1；李艷梅等（2012）研究指出低質量濃度萘對三角褐指藻生長的抑制作用不明顯，但當萘質量濃度達到8 mg·L-1時，藻細胞受抑制程度隨著萘質量濃度的升高而增大；王秀翠等（2014）以銅綠微囊藻為試驗對象，研究了萘、菲和芘對其生長的影響，發(fā)現(xiàn)萘質量濃度大于4.05 mg·L-1時，銅綠微囊藻生長有顯著的抑制作用，菲質量濃度達到3.28 mg·L-1時，銅綠微囊藻的生長完全受到抑制，而芘質量濃度在 0.15～8 mg·L-1之間時，銅綠微囊藻的生長抑制作用并不明顯，由此可以看出，芘對藻的敏感性要小于萘和菲；江晶（2010）研究了萘對斜生柵藻的生長影響，結果表明其EC50值為13.34 mg·L-1（4 d）；Djomo et al.（2004）研究表明苯并(a)芘、萘、蒽和菲對淡水藻7 d后的 EC50分別為 1.28～72 μg·L-1、54.32～102.90 μg·L-1、0.74～1.50 mg·L-1和34.88～72.50 mg·L-1；張朝等（1999）研究發(fā)現(xiàn)1-硝基芘對斜生柵藻的EC50為0.1824 mg·L-1（4 d）。綜上可知，不同的多環(huán)芳烴對于不同的藻類毒性存在很大差異，可能源于多環(huán)芳烴對藻類很多關鍵代謝活動產生不同的影響；藻類對多環(huán)芳烴的敏感性差異主要與藻的種類以及多環(huán)芳烴化學式不同有關（Singh et al.，2006）。在本研究中，這一實驗結果較其它多環(huán)芳烴對斜生柵藻的EC50值偏高，說明斜生柵藻對芘具有較低的敏感性或芘對斜生柵藻具有較低的毒性。

表1 斜生柵藻各處理組的比增長率的分析Table 1 The analysis of specific growth rate of S. obliquus

表2 毒性試驗的回歸方程、EC50(mg·L-1)和95%置信限Table 2 Regression equation, EC50values (mg·L-1) and 95% confidence limits of toxicity

2.2 多環(huán)芳烴(芘)對斜生柵藻光合色素的影響

光合色素是植物進行光合作用的物質基礎，可以判斷植物光合生理能力的依據(jù)，色素含量變化也能較好地反映植物各階段的生長發(fā)育是否正常（楊慧麗等，2010）。斜生柵藻被芘脅迫 6 d后，對葉綠素a, b及類胡蘿卜素的含量進行測定，結果見表3。

表3 芘質量濃度對斜生柵藻光合色素的影響（mg·L-1）Table 3 Effect of mass concentration (mg·L-1) of pyrene on the pigment in S. obliquus

由表 3可以看出，隨著芘質量濃度（0～50 mg·L-1）增加，各種光合色素以及Ca/Cb均呈下降趨勢，在各種光合色素中葉綠素a受到影響最大。Qin et al.（2012）在研究恩諾沙星對斜生柵藻的毒性機制過程中表明，隨著恩諾沙星濃度的增加，斜生柵藻各種光合色素以及 Ca/Cb均呈不同程度的下降趨勢。洪華嫦等（2003）在研究五氯酚對斜生柵藻的毒性效應時指出，總的光合色素隨五氯酚濃度的增加而減少，這與本研究結果相一致。引起光合色素下降可能是因為芘脅迫條件下引起葉綠體膨脹破裂，類囊體膜解體，葉綠體從組織中流失（Gao et al.，2007b）；也可能是因為芘進入藻細胞內部產生活性氧，細胞內活性氧的積累，使藻細胞葉綠體結構受到損傷，葉綠素合成受阻（Geoffroy et al.，2003；Gurbuz et al.，2009）。光合色素下降勢必會直接影響光合作用的正常進行，進而影響到藻細胞體內其它有機物質（如各種蛋白質）的合成（劉濤等，2006）。在本研究中，通過肉眼和顯微鏡觀察到藻細胞顏色隨著芘濃度增加由翠綠色逐漸變成淡綠色，高濃度組變?yōu)榘咨?/p>

3 結論

（1）被芘脅迫后，在低質量濃度組（5和 10 mg·L-1）中斜生柵藻生長速率與對照組相比有限制作用。在較高質量濃度（>10 mg·L-1）時，表現(xiàn)明顯的抑制作用，芘質量濃度繼續(xù)增大達到50 mg·L-1時，其對斜生柵藻的毒性效應會導致其完全停止生長，呈現(xiàn)出良好時間-效應和劑量-效應的關系，其對斜生柵藻的6d-EC50為20.99 mg·L-1。

（2）多環(huán)芳烴（芘）濃度對斜生柵藻的各種光合色素均有較大的影響。隨著芘質量濃度（0～50 mg·L-1）的增加，各種光合色素的含量和Ca/Cb均呈下降趨勢，并且變化趨勢與生長率基本一致，說明藻細胞在芘的脅迫作用下，葉綠素結構受到損害。由于多環(huán)芳烴在世界范圍內的廣泛存在，進入水體后，必將對藻的生存、生長、繁殖帶來一定的影響，繼而危害整個水生態(tài)系統(tǒng)。本研究對于了解多環(huán)芳烴對單種藻類的毒性效應以及評價其生態(tài)風險是很重要的。

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Study on the Toxicity of PAHs (pyrene) to Scenedesmus Obliquus

XU Wenwu, HOU Meifang*, PAN Dongyu, ZHOU Jian
Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are common contaminants in nature. In this study, a laboratory culture was conducted to examine the toxicity effects of pyrene under different mass concentrations on the growth and the contents of pigments of Scenedesmus obliquus. The exposure mass concentrations of pyrene were 0, 5, 10, 20, 30, 50 mg·L-1. Comparing the numbers of the cells of the treatment with that of the control group at the same time, the data were analysed by the calculating of IR so on. The results showed that the growth of algae was inhibited by pyrene and decreased with the increase of pyrene mass concentration, exhibiting a good time-effect and concentration-effect manners. The 2 d, 4 d and 6 d-EC50of Scenedesmus obliquus were 44.07, 29.23 and 20.99 mg·L-1respectively by regression analysis, The algae growth rates decreased with the increasing of pyrene mass concentration. It can be seen that the color of algal cells changed from green to white. Meanwhile, the contents of the pigments were examined. The total content of pigments and the ratio between chlorophyll a and chlorophyll b decreased significantly with the increasing of pyrene mass concentration and the trends of change were coincident with their specific growth rate. The experimental results indicated that chlorophyll a contents of Scenedesmus obliquus reduced faster than those of chlorophyll b and carotenoid. The ecotoxic effects of pyrene might be ascribed to the inhibition of the algal photosynthesis by pyrene.

pyrene; Scenedesmus Obliquus; acute toxicity; pigments; regression analysis

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.08.016

X171.5

A

1674-5906（2015）08-1361-05

許文武，侯梅芳，潘棟宇，周建. 多環(huán)芳烴（芘）對斜生柵藻的毒性研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學報, 2015, 24(8): 1361-1365.

XU Wenwu, HOU Meifang, PAN Dongyu, ZHOU Jian. Study on the Toxicity of PAHs (pyrene) to Scenedesmus Obliquus [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(8): 1361-1365.

國家自然科學基金項目（41171250；20907011）；上海應用技術學院引進人才基金項目（YJ2013-16）

許文武（1986年生），男，碩士研究生，研究方向為土壤及水環(huán)境修復。E-mail: xuwenwu423@126.com *通信作者。E-mail: mfhou@sit.edu.cn

2015-03-31