蔣胡艷，肖福泉，龔柳菲，薛新穎，邵 穎，涂 健，祁克宗，宋祥軍

禽致病性大腸桿菌基因缺失對(duì)雛雞氣管黏膜細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路的影響

蔣胡艷，肖福泉，龔柳菲，薛新穎，邵 穎，涂 健，祁克宗，宋祥軍*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

為探究基因在禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic, APEC）感染雛雞氣管黏膜過(guò)程中發(fā)揮的作用及機(jī)制。將APEC野生株（DE17）及其基因缺失株（DE17Δ）感染7日齡雛雞氣管，12、24 h后收集雛雞氣管黏膜細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序，篩選野生株和缺失株的差異表達(dá)基因，進(jìn)行GO和KEGG富集分析。結(jié)果顯示，在感染12 h后，共篩選到108個(gè)差異表達(dá)基因（36個(gè)上調(diào)，72個(gè)下調(diào)）；在感染24 h后，共篩選到59個(gè)差異表達(dá)基因（34個(gè)上調(diào)，25個(gè)下調(diào)）。GO分析表明，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程；蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP合成、DNA結(jié)合等分子功能類(lèi)；生物膜及膜的組成成分、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞組分功能；KEGG分析表明，差異表達(dá)基因主要富集在緊密連接通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用通路、內(nèi)吞通路、Wnt信號(hào)通路等。結(jié)論為基因缺失后，會(huì)使部分差異表達(dá)基因的表達(dá)量下調(diào)，對(duì)細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等通路產(chǎn)生影響。

禽致病性大腸桿菌；VI型分泌系統(tǒng)；基因；轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序；氣管黏膜細(xì)胞

禽致病性大腸桿菌 (Avian pathogenic, APEC) 屬于腸道外致病性大腸桿菌，可引起局部或全身性感染[1]，從而導(dǎo)致禽類(lèi)多系統(tǒng)損傷，主要發(fā)病類(lèi)型有氣囊炎、肝周炎、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎等，嚴(yán)重可導(dǎo)致胚胎和幼雛死亡[2]，不僅對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展有巨大的影響，而且威脅人類(lèi)的健康。APEC的致病機(jī)制十分復(fù)雜，有研究表明多種毒力因子是促進(jìn)禽類(lèi)腸道外疾病的起因。已發(fā)現(xiàn)的毒力因子包括：黏附素、溶血素、侵襲素、二元調(diào)控系統(tǒng)、群體感應(yīng)系統(tǒng)和分泌系統(tǒng)等[3]，多種因子能協(xié)調(diào)運(yùn)作，增強(qiáng)APEC的致病力。其中，分泌系統(tǒng)能夠?qū)⒏鞣N效應(yīng)蛋白運(yùn)送至胞外或直接注入宿主細(xì)胞內(nèi)[4]，在細(xì)菌侵入宿主感染機(jī)體的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

VI 型分泌系統(tǒng) (type VI secretion system，T6SS) 是一種新型的細(xì)菌蛋白分泌系統(tǒng)，廣泛的存在于革蘭氏陰性菌中，可以介導(dǎo)致病菌與宿主的相互作 用[5]，在APEC 的致病過(guò)程中扮演重要角色。T6SS是一種多功能的蛋白質(zhì)注射裝置，核心組分是13種蛋白和若干附屬組件[6]，主要由膜復(fù)合物，尾部復(fù)合物和基座復(fù)合物三部分組成[7]。T6SS通過(guò)跨雙層膜管道以注射器的形式將分泌效應(yīng)蛋白從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞或胞外環(huán)境中[8]，以接觸依賴的方式主要靶向競(jìng)爭(zhēng)菌以參與菌間競(jìng)爭(zhēng)或靶向真核宿主從而致病[9]。T6SS的核心組分包括溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(Hcp)、纈氨酸谷氨酸重復(fù)蛋白 (VgrG)、細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)鞍?(DotU)、ATP 水解酶 (ClpV) 等[10]。Hcp和VgrG既是T6SS的效應(yīng)蛋白又是分泌蛋白，Hcp形成六聚環(huán)結(jié)構(gòu)延伸至VgrG穿刺裝置將效應(yīng)蛋白注射到細(xì)胞內(nèi)[11]。分子伴侶ClpV是T6SS中的能量結(jié)合蛋白，為T(mén)6SS 的運(yùn)行提供能量[12]。

ClpV屬于ATP酶超家族，與VgrG和Hcp蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而為 T6SS分泌效應(yīng)蛋白提供 ATP[13]。T6SS 基因簇編碼的 ClpV蛋白在對(duì) T6SS 提供能量過(guò)程中占主導(dǎo)地位，與整個(gè)系統(tǒng)能量供給相關(guān)。其與ATP結(jié)合后，利用水解獲得的能量以六聚體形式水解底物蛋白，拆解T6SS，完成T6SS的回收和組裝[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，Hcp1的分泌需要ClpV AAA- 1結(jié)構(gòu)域水解ATP，ClpV是在Hcp分泌過(guò)程中所必需的[15]。

在APEC感染宿主的過(guò)程中，細(xì)菌侵入并附著在禽類(lèi)的呼吸道，黏附氣管是APEC感染過(guò)程的一個(gè)重要步驟[16]。APEC感染雛雞氣管可導(dǎo)致氣管黏膜發(fā)生病理變化，并導(dǎo)致細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用通路基因表達(dá)量發(fā)生變化[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，基因缺失后，上清中無(wú)法檢測(cè)到效應(yīng)蛋白Hcp和VgrG，從而導(dǎo)致 APEC的T6SS功能的缺失[18]。基因?qū)PEC的致病性有著重要作用，但基因在APEC感染禽氣管黏膜過(guò)程中發(fā)揮的具體作用尚不清楚?；诖耍狙芯繉⒒蛉笔е晖ㄟ^(guò)氣管感染雛雞，并篩選氣管黏膜細(xì)胞差異表達(dá)的mRNA，進(jìn)行生物學(xué)信息分析。探究基因?qū)﹄r雞氣管黏膜上皮細(xì)胞的調(diào)控作用，為進(jìn)一步探究T6SS在APEC致病過(guò)程發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

禽致病性大腸桿菌野生株 (DE17) 和基因缺失株DE17Δ前期已由實(shí)驗(yàn)構(gòu)建得到[19]，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)雛雞為購(gòu)于安徽省安禽禽業(yè)有限公司的羅曼蛋雞（1日齡）。

1.2 主要試劑

酵母提取物，購(gòu)自上海生工公司；氯化鈉、氯霉素、氨芐青霉素，卡那霉素購(gòu)自上海生工公司；其他試劑有無(wú)菌PBS、液氮等。

1.3 雛雞氣管注射

將?DE17以1∶100的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)接，37 ℃培養(yǎng)至OD=1.0，無(wú)菌PBS洗滌菌液3遍，調(diào)整菌液濃度為1×106cfu·mL-1。購(gòu)入的1日齡雛雞同等條件下飼養(yǎng)至7日齡，將7日齡雛雞分成4組（野生株2組，缺失株2組），每組3只。將處理好的菌液分別通過(guò)氣管注射DE17和?的方式感染7日齡雛雞，按照50 μL、1×108cfu·mL-1的劑量感染，對(duì)照組注入等量的PBS。

1.4 雛雞氣管黏膜細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序

1.4.1 組織樣品準(zhǔn)備 分別于感染后的12、24 h刮取氣管黏膜，收集氣管黏膜上皮細(xì)胞，液氮冷凍后于﹣80 ℃保存，樣品送至杭州聯(lián)川生物公司，利用Illumina Novaseq? 6000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)測(cè)序的原始數(shù)據(jù)使用cutadap去除帶接頭 (Akdaptor) 的、無(wú)法確定堿基信息的比例大于5%的、低質(zhì)量的reads，統(tǒng)計(jì)原始測(cè)序量，對(duì)有效測(cè)序量，Q20（質(zhì)量大于20的堿基占總被測(cè)堿基的比值），Q30（質(zhì)量大于 30的堿基占總被測(cè)堿基的比值），GC含量（基因中鳥(niǎo)嘌呤 (G) 和胞嘧啶 (C) 的總量在雙股DNA 的4種堿基中的占比）進(jìn)行綜合測(cè)評(píng)，利用Hisat對(duì)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行參考基因組比對(duì)。

1.4.2 差異表達(dá)基因的篩選 根據(jù)FPKM (fragments per kilobase of exon per million fragments mapped) 算法度量基因表達(dá)的豐度值，進(jìn)行樣本間差異分析，以|log2foldchange|≥ 1，≤ 0.05為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選。

1.4.3 GO與KEGG的富集分析 根據(jù)篩選出的差異基因，進(jìn)行GO和KEGG富集分析，計(jì)算GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中各個(gè)條目映射的差異表達(dá)基因數(shù)目，并進(jìn)行超幾何檢驗(yàn)。對(duì)比整個(gè)基因組，篩選出差異表達(dá)基因顯著富集的GO條目和KEGG條目。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)基因的篩選

以|log2fold change| ≥ 1，≤ 0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，與野生株DE17相比，?在感染氣管的不同時(shí)間段均獲得差異表達(dá)基因。在感染12 h后，共篩選到108個(gè)差異表達(dá)基因，其中，36個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，72個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)，結(jié)果如圖1(a)所示；在感染24 h后，共篩選到59個(gè)差異表達(dá)基因，其中，34個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，25個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)，結(jié)果如圖1(b)所示。根據(jù)篩選出的差異表達(dá)基因，得到感染?組部分差異表達(dá)基因，結(jié)果如表1所示。

2.2 GO功能分析結(jié)果

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，GO分析結(jié)果（表2）可得知，在感染Δ菌株12 h后，108個(gè)差異表達(dá)基因主要富集在RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程；蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP合成等分子功能類(lèi)；生物膜及膜的組成成分、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞組分功能。在感染Δ菌株24 h后，59個(gè)差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程；蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP合成、DNA結(jié)合等分子功能類(lèi)；生物膜及膜的組成成分、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞組分功能。

圖1 差異表達(dá)基因的篩選

Figure 1 Screening of differentially expressed genes

表1 感染?clpV組部分差異表達(dá)基因

表2 感染? clpV組GO條目富集列表

圖2 感染?clpV組KEGG功能分析

Figure 2 KEGG function analysis of group infected by ?

2.3 KEGG富集分析結(jié)果

通過(guò)計(jì)算差異表達(dá)基因，對(duì)其進(jìn)行KEGG富集分析。橫軸為Rich factor（富集因子），縱軸為pathway name（通路名稱）。KEGG分析結(jié)果表明感染?菌株12 h后，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路等，如圖2(a)所示。在感染?菌株24 h后，差異表達(dá)基因主要富集在內(nèi)吞通路、緊密連接通路、Wnt信號(hào)通路等，如圖2(b)所示。

3 討論與結(jié)論

禽致病性大腸桿菌是禽大腸桿菌病的主要病原菌，禽的大腸桿菌病是目前禽類(lèi)最為常見(jiàn)的細(xì)菌性傳染疾病之一[20]，世界各地的養(yǎng)禽業(yè)都受到它的嚴(yán)重威脅。T6SS在APEC的競(jìng)爭(zhēng)和致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。2006年，在銅綠假單胞菌和霍亂弧菌中首次發(fā)現(xiàn)T6SS，并且T6SS首次作為新型的細(xì)菌蛋白分泌系統(tǒng)被定義[21]。T6SS類(lèi)似于噬菌體尾鞘結(jié)構(gòu)，通過(guò)膜相關(guān)的復(fù)合物錨定在細(xì)菌的細(xì)胞表面，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鞘的收縮推動(dòng)由 Hcp蛋白組成的內(nèi)管道通過(guò)由VgrG和PAAR組成的刺穿裝置頂向靶細(xì)胞，與這個(gè)收縮結(jié)構(gòu)相關(guān)的效應(yīng)因子因此被轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞[22]。一旦效應(yīng)因子被傳遞至靶細(xì)胞，收縮鞘就會(huì)在ClpV的作用下拆解。ClpV是AAA+蛋白家族成員[23]，是六聚體ATP酶，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。ClpV 的N端無(wú)催化活性，C端具有ATP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，為T(mén)6SS提供 ATP，但其對(duì)APEC的調(diào)控作用目前尚不清楚[24]。

禽致病性大腸桿菌感染宿主首先要黏附定殖于宿主細(xì)胞表面，黏附素是病原菌重要的毒力因子，位于細(xì)菌的表面，通過(guò)結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體避免被宿主清除到體外[25]。因此，本研究將?菌株以氣管注射的方式感染雛雞，以注射菌株DE17為對(duì)照組，研究基因缺失后對(duì)雞氣管黏膜細(xì)胞mRNA表達(dá)譜的影響。注射?菌株12 h、24 h后，差異表達(dá)基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用通路、蛋白質(zhì)加工通路、緊密連接通路等。前期已有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)APEC感染影響雞氣管內(nèi)細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通 路[26]，本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，重點(diǎn)關(guān)注基因缺失后，對(duì)雛雞氣管內(nèi)細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路的影響。

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的一類(lèi)多功能蛋白多肽分子，種類(lèi)繁多，可分為白細(xì)胞介素、干擾素、趨化因子等，它們與細(xì)胞因子受體結(jié)合才能發(fā)揮作用。細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路具有免疫調(diào)節(jié)和免疫效應(yīng)相關(guān)功能，在細(xì)菌感染宿主的炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[27]。分析測(cè)序結(jié)果總結(jié)發(fā)現(xiàn)，在感染12 h和24 h后，富集在細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體通路的差異表達(dá)基因分別為4個(gè) (、、、) 和3個(gè) () ，且表達(dá)量均顯著下調(diào)。CCL5通過(guò)與其受體CCR1、CCR3、CCR4等結(jié)合時(shí)，發(fā)揮趨化活性[28]，參與免疫反應(yīng)。IL1β作為IL-1的重要成員之一，是由上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，可在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮作用[29]。當(dāng)IL1β與其受體結(jié)合后，即可誘發(fā)一系列炎癥介質(zhì)及相關(guān)趨化因子的釋放，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。IL1β不僅可以通過(guò)旁分泌的方式作用于局部，還可以通過(guò)內(nèi)分泌的方式引起全身免疫反應(yīng)，同時(shí)IL1β還可以誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子如IL6、IL8的表達(dá)[30]?；蛉笔е?，導(dǎo)致、表達(dá)量的下調(diào)，降低了機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

在真核細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)錄后修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要細(xì)胞器，參與蛋白質(zhì)的加工以及運(yùn)輸。當(dāng)機(jī)體受到外源抗原侵襲時(shí)，機(jī)體需要大量的抗體來(lái)應(yīng)對(duì)抗原，機(jī)體產(chǎn)生抗體的過(guò)程中需要大量蛋白質(zhì)。在感染?菌株12 h后，富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路的差異表達(dá)基因表達(dá)量均上調(diào)，如等，這些基因參與蛋白質(zhì)的翻譯、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解改變，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工異常，宿主細(xì)胞發(fā)生病變[31]。大量的差異表達(dá)基因的上調(diào)，使得蛋白質(zhì)輸出增多，抗體增加，應(yīng)對(duì)外源抗體，加快機(jī)體的恢復(fù)。這為深入研究基因在APEC致病中的作用提供思路。

緊密連接位于相鄰細(xì)胞之間，維持著上皮細(xì)胞屏障和上皮細(xì)胞極性，是上皮和內(nèi)皮細(xì)胞間的重要屏障結(jié)構(gòu)[32]。細(xì)胞之間的緊密連接閉合了相鄰上皮細(xì)胞之間的間隙，阻止了病原微生物和抗原物質(zhì)進(jìn)入黏膜的固有層以激活免疫細(xì)胞，并維持了黏膜屏障功能的穩(wěn)定性[33]。在感染?菌株24 h后，緊密連接通路中有3個(gè)基因上調(diào)表達(dá)和2個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，這說(shuō)明基因可能通過(guò)影響緊密連接功能進(jìn)而導(dǎo)致黏膜屏障功能受損。

綜上所述，禽致病性大腸桿菌基因缺失株可以通過(guò)細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等通路影響機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫過(guò)程。本研究初步探究了基因缺失后感染雛雞后影響氣管黏膜細(xì)胞的mRNA表達(dá)，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路，為深入研究 T6SS 的功能及防控禽致病性大腸桿菌提供了參考。

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Effect of avian pathogenicgene deletion on the cytokine-cytokine receptor interaction pathway in chick tracheal mucosa

JIANG Huyan, XIAO Fuquan, GONG Liufei, XUE Xinying, SHAO Ying, TU Jian, QI Kezong, SONG Xiangjun

(School of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

To investigate the role and mechanism of thegene in the process of Avian pathogenic(APEC) infection of the chicks racheal mucosa. In this study, 7-day-old chicks were infected with the wild strain (DE17) and the deletion strain (DE17Δ) of APEC, and the chicks' tracheal mucosa cells were collected 12 and 24 h later for transcriptomic sequencing to screen the differentially expressed genes of the wild strain and the deletion strain. The results showed that a total of 108 differentially expressed genes (36 up-regulated and 72 down-regulated) were screened 12 h after infection and 59 differentially expressed genes (34 up-regulated and 25 down-regulated) were screened 24 h after infection. GO analysis showed that the differentially expressed genes were mainly enriched in biological processes such as intracellular signal transduction, positive regulation of RNA polymerase II transcription; protein binding, ATP synthesis, DNA binding and other molecular functional classes; cellular component functions such as biofilm and membrane components, cytoplasm. KEGG analysis showed that the differentially expressed genes were mainly enriched in the tight junction pathway, protein processing pathway in the endoplasmic reticulum, cytokine-cytokine receptor interaction pathway, endocytosis pathway and Wnt signalling pathway, etc. It was concluded that deletion of thegene resulted in the down-regulation of the expression of some of the differentially expressed genes, with effects on pathways such as cytokine-cytokine receptor interactions.

avian pathogenic; type VI secretion system;gene; transcriptome sequencing; tracheal mucosal cells

S852.612

A

1672-352X (2023)02-0255-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230511.007

2023-05-12 10:17:39

2022-04-29

安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(S202110364034)，國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(202110364009)和安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)(202110364027)共同資助。

蔣胡艷，碩士研究生。E-mail：1678207529@qq.com 肖福泉，本科生。E-mail：2044548530@qq.com

通信作者:宋祥軍，博士，副教授。E-mail：sxj@ahau.edu.cn

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20230511.1152.014.html