溫宏偉，張召賢，薛佳瑩*，段勁生，吳祥為

氟唑菌苯胺對蛋白核小球藻的立體選擇性毒性效應(yīng)

溫宏偉1,2，張召賢1，薛佳瑩1*，段勁生2*，吳祥為1

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036；2. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，合肥 230031)

為了探究氟唑菌苯胺對水生生物的立體選擇性毒性效應(yīng)，測定了氟唑菌苯胺對映體對蛋白核小球藻的急性毒性以及光合色素含量的影響。結(jié)果表明，-氟唑菌苯胺對蛋白核小球藻具有更高的急性毒性，是-氟唑菌苯胺1.2倍。高劑量暴露濃度下，-氟唑菌苯胺對小球藻葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素生物合成的抑制率分別為35%、28%、37%，是-對映體的2.1、1.9、2.8倍，表明氟唑菌苯胺對蛋白核小球藻的立體選擇性急性毒性可能是由于對映體對光合色素生物合成抑制差異造成的。降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低毒對映體-氟唑菌苯胺被優(yōu)先降解，第7天時-氟唑菌苯胺和-氟唑菌苯胺降解率分別為82.5%和65.8%，EF值為0.12，且對映體構(gòu)型穩(wěn)定。研究結(jié)果為氟唑菌苯胺水生生態(tài)風(fēng)險評價提供數(shù)據(jù)支撐，同時為手性農(nóng)藥立體選擇性機(jī)制研究提供新的思路。

氟唑菌苯胺；蛋白核小球藻；立體選擇性；急性毒性；光合色素，降解

手性農(nóng)藥對映體具有相同的理化性質(zhì)，但由于立體結(jié)構(gòu)的差異，手性農(nóng)藥對映體與生物大分子（受體、酶等）的作用方式可能不同，導(dǎo)致對映體在生物活性、生態(tài)毒性以及環(huán)境行為等方面存在立體選擇性[1-5]。研究表明手性殺菌劑雙炔酰菌胺其-對映體的抑菌活性是-對映體的118～592倍，而-雙炔酰菌胺對紫背浮萍的急性毒性高于-對映體；-雙炔酰菌胺在豇豆和辣椒中被優(yōu)先降解，而-對映體在土壤中被優(yōu)先降解[6-8]。因此，若將手性農(nóng)藥對映體視為同一種化合物，可能導(dǎo)致風(fēng)險評估不準(zhǔn)確、施用過量等問題，對人類健康與生態(tài)環(huán)境造成不良影響。

氟唑菌苯胺（5-氟-1,3-二甲基--[2-(4-甲基 戊-2-基)苯基]-1H-吡唑-4-甲酰胺）是拜耳公司研發(fā)的新型手性吡唑酰胺類殺菌劑，可防治擔(dān)子菌和子囊菌等病原菌引起的病害，兼具內(nèi)吸和保護(hù)作用，主要用于種子處理，目前已在歐盟、日本和中國等地區(qū)登記使用[9-10]。研究表明氟唑菌苯胺在環(huán)境中的持效期長，酸性和中性條件下其水解半衰期分為449.8和392.7 d；土壤中的半衰期分別為71.5～101.7 d[11]。氟唑菌苯胺對水生生物具有較高的生態(tài)風(fēng)險，且對映體之間存在明顯的立體選擇性差異。氟唑菌苯胺對斑馬魚急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明-氟唑菌苯胺和-氟唑菌苯胺96 h LC50分別為0.45和24.3 mg·L-1，-氟唑菌苯胺的急性毒性是-對映體的54倍，且-氟唑菌苯胺可增加-氟唑菌苯胺對斑馬魚的暴露風(fēng)險。慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高毒對映體-氟唑菌苯胺在斑馬魚體內(nèi)優(yōu)先富集，對斑馬魚琥珀酸脫氫酶生物活性的抑制顯著高于-對映體，從而引發(fā)更為嚴(yán)重的氧化應(yīng)激效應(yīng)[12]。氟唑菌苯胺對映體與重金屬Cd聯(lián)合暴露時，Cd促進(jìn)-氟唑菌苯胺在斑馬魚肝臟中的生物富集，從而增加其環(huán)境風(fēng)險[13]。

圖1 氟唑菌苯胺結(jié)構(gòu)式

Figure 1 Structure of penflufen

藻類是淡水生態(tài)系統(tǒng)中的初級生產(chǎn)者[14]，是水生食物鏈中的基本環(huán)節(jié)，任何外源性化合物對藻類的干擾都可能導(dǎo)致整個水生生態(tài)系統(tǒng)的失衡[15-16]。因此藻類被廣泛用于農(nóng)藥水生生態(tài)風(fēng)險的評價[17-20]。本研究利用蛋白核小球藻，探究了氟唑菌苯胺對水生生物的立體選擇性急性毒性，通過測定對映體對蛋白核小球藻光合色素生物合成的影響，以期揭示氟唑菌苯胺立體選擇性毒性差異的機(jī)制，進(jìn)一步利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜明確了氟唑菌苯胺在蛋白核小球藻中的立體選擇性降解。研究結(jié)果為氟唑菌苯胺的安全使用和風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 氟唑菌苯胺外消旋體（- penflufen，純度≥99.8%），購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；氟唑菌苯胺手性對映體（-penflufen和-penflufen）由大賽璐藥物手性技術(shù)（上海）有限公司制備；甲醇、乙腈和丙酮等試劑購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.1.2 供試材料 蛋白核小球藻（）購自中國科學(xué)院水生生物研究所，使用BG11培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，濕度65%，白色日光燈，光照強(qiáng)度4 000 lx左右，光暗比為12∶12 h，靜置培養(yǎng)，每日定時人工搖動3～4次[21]。

1.1.3 儀器 三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS 8030，島津中國）；手性色譜柱（CHIRALPAK?IG-3，大賽璐(中國)投資有限公司）；光照培養(yǎng)箱（GXZ-1000A，寧波東南儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 生長抑制實(shí)驗(yàn) 采用半靜態(tài)法測定目標(biāo)化合物（-氟唑菌苯胺，-氟唑菌苯胺和-氟唑菌苯胺）對蛋白核小球藻的急性毒性。在無菌操作臺中，配置氟唑菌苯胺濃度為0、1、3、5、7和10 mg·L-1的培養(yǎng)基溶液100 mL，將處于對數(shù)生長期的蛋白核小球藻接種至含氟唑菌苯胺培養(yǎng)基中，小球藻的初始密度為2×105個cell·mL-1，每個處理設(shè)置3個平行。同時設(shè)置對照組，以減少由于蛋白核小球藻自然死亡對實(shí)驗(yàn)造成的誤差。將蛋白核小球藻置于原培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每天定時搖動3～4次，分別在48 h、72 h和96 h時，利用紫外可見分光光度計(jì)測定690 nm時藻液的吸光度（OD690），計(jì)算不同暴露濃度對小球藻的藻抑制率，計(jì)算公式如下：

抑制率(%) = (對照組690-處理組690)/對照組690×100%

對濃度-抑制率數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性，計(jì)算不同時間-氟唑菌苯胺，-氟唑菌苯胺和-氟唑菌苯胺的有效中濃度（median effective concentration，EC50），用于評價氟唑菌苯胺對映體對蛋白核小球藻的急性毒性。

1.2.2 光合色素含量的測定 將處于對數(shù)生長期的蛋白核小球藻接種至250 mL錐形瓶中，加入氟唑菌苯胺及其對映體，暴露濃度分別為1、3和5 mg·L-1，每個處理設(shè)3個平行。置于人工氣候箱中培養(yǎng)96 h后，吸取5 mL藻液于離心管中， 5 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，加入5 mL丙酮（體積分?jǐn)?shù)80%），避光振蕩10 min，置于4 ℃冰箱中保存24 h，再以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液分別測定440、663、645和663 nm處的吸光值，計(jì)算藻液中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素的含量，計(jì)算公式如下[22]：

a=(12.7663-2.69645)/ρ

b=(22.9645-4.68663)/ρ

T=(1000652/34.5)/ρ

K=(4.7440-0.27a+b)/ρ

其中，C為葉綠素a含量（mg·cell-1），C為葉綠素b含量（mg·cell-1）；C為總?cè)~綠素含量（mg·cell-1），C為類胡蘿卜素含量（mg·cell-1）；為藻密度。

1.2.3 降解實(shí)驗(yàn) 將處于對數(shù)生長期的小球藻接種至250 mL錐形瓶中，小球藻的初始濃度為2×105個cell·mL-1。添加氟唑菌苯胺對映體，初始暴露濃度為5 mg·L-1，每個處理設(shè)3個平行。將蛋白核小球藻置于原培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每天定時搖動3～4次，分別于0、1、2、3、4、5、6和7 d收集上清和藻細(xì)胞，測定氟唑菌苯胺對映體的濃度。

采用QuEChERS法提取蛋白核小球藻細(xì)胞和培養(yǎng)液中的氟唑菌苯胺對映體，并通過LC-MS測定樣品中氟唑菌苯胺對映體的殘留濃度[23]。添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，-氟唑菌苯胺和-氟唑菌苯胺的添加回收率分別為86.8%～93.2%和87.6%～91.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求。使用對映體分?jǐn)?shù)（enantiomer fraction，EF）評價氟唑菌苯胺在蛋白核小球藻中的立體選擇性[24-25]。使用生物富集因子（bioenrichment factor，BCF）評價氟唑菌苯胺在蛋白核小球藻中的富集性[24]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 運(yùn)用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，利用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 立體選擇性急性毒性

手性農(nóng)藥對映體對非靶標(biāo)生物的急性毒性往往具有立體選擇性[26-28]。本研究測定了48 h、72 h和96 h氟唑菌苯胺對映體對蛋白核小球藻的急性毒性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。隨著暴露濃度的增加，蛋白核小球藻受到不同程度的損傷，7 mg·L-1與10 mg·L-1暴露濃度下，24 h時藻液變黃，發(fā)生絮凝、沉淀等現(xiàn)象。隨著暴露時間的推移，氟唑菌苯胺對蛋白核小球藻的急性毒性增加，-氟唑菌苯胺、-氟唑菌苯胺和-氟唑菌苯胺96 h EC50分別為5.32、5.13和6.11 mg·L-1，-氟唑菌苯胺具有更高急性毒性，為-氟唑菌苯胺的1.2倍。根據(jù)農(nóng)藥對藻類急性毒性劃分等級，氟唑菌苯胺及其對映異構(gòu)體均屬于低毒化合物。

表1 氟唑菌苯胺對映體對蛋白核小球藻的生長抑制

2.2 氟唑菌苯胺對映體對蛋白核小球藻光合色素生物合成的影響

光合色素是植物光合作用中參與吸收、傳遞光能或引起原初光化學(xué)反應(yīng)的重要物質(zhì)[29-30]。研究表明農(nóng)藥脅迫條件下，蛋白核小球藻光合色素生物合成會受到不同程度的抑制[31-33]。本實(shí)驗(yàn)探究了氟唑菌苯胺對映體對蛋白核小球藻光合色素生物合成的影響，結(jié)果如圖1所示。低濃度（1 mg·L-1）暴露時，-氟唑菌苯胺、-氟唑菌苯胺和-氟唑菌苯胺對于葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素以及總?cè)~綠素的生物合成影響不顯著。暴露濃度為3 mg·L-1時，蛋白核小球藻光合色素的生物合成受到明顯的抑制，與對照組相比，氟唑菌苯胺處理的蛋白核小球藻葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素以及總?cè)~綠素含量分別降低了23%、22%、21%和32%；氟唑菌苯胺暴露組葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素以及總?cè)~綠素含量分別降低了35%、28%、37%和33%；氟唑菌苯胺暴露組中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素以及總?cè)~綠素含量約分別降低了17%、15%、13%和24%；暴露濃度為5 mg·L-1，氟唑菌苯胺對映體對光合色素生物合成的抑制程度顯著高于3 mg·L-1暴露組。測試濃度范圍內(nèi)，蛋白核小球藻光合色素含量與農(nóng)藥濃度呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，暴露濃度越高，光合色素含量越少。

氟唑菌苯胺對映體對于光合色素生物合成的抑制程度也具有明顯的立體選擇性差異。暴露濃度為3 mg·L-1時，-氟唑菌苯胺對于不同光合色素的抑制效應(yīng)是-氟唑菌苯胺的1.4～2.8倍；暴露濃度為5 mg·L-1時，-氟唑菌苯胺的抑制效應(yīng)顯著高于-氟唑菌苯胺。這與急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。因此，氟唑菌苯胺對蛋白核小球藻的立體選擇性急性毒性可能是由于對映體對光合色素生物合成抑制差異造成的。

表2 氟唑菌苯胺對映體降解動力學(xué)方程及半衰期

（a）S-氟唑菌苯胺；（b）R-氟唑菌苯胺。

Figure 2 Degradation curve of penflufen enantiomers in water with or without

圖3 EF值的變化

Figure 3 Variation of EF values

圖4 氟唑菌苯胺對映體在小球藻體內(nèi)濃度變化

Figure 4 Changes of the concentration of penflufen enantiomers ofin

2.3 立體選擇性降解與富集

2.3.1 立體選擇性降解 手性農(nóng)藥對映體在生物體內(nèi)的降解往往具有立體選擇性[35-36]。本實(shí)驗(yàn)測定了氟唑菌苯胺在有無蛋白核小球藻水中的消解動態(tài)。實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)氟唑菌苯胺對映體在水中未發(fā)生降解。當(dāng)水中含有蛋白核小球藻時，氟唑菌苯胺對映體在藻液中的降解符合一級動力學(xué)方程，決定系數(shù)2為0.912 4～0.952 6，-和-氟唑菌苯胺半衰期分別為2.6 d和4.2 d（表2），具有明顯的立體選擇性，EF值為0.12～0.50（圖4），表現(xiàn)為低毒對映體-氟唑菌苯胺被優(yōu)先降解，7 d時-氟唑菌苯胺和氟唑菌苯胺分別降解了65.8%和82.5%，

-氟唑菌苯胺降解過程中未發(fā)現(xiàn)S-對映體的生成，-氟唑菌苯胺降解過程中也未發(fā)現(xiàn)R-對映體的生成，表明氟唑菌苯胺的構(gòu)型是穩(wěn)定的（圖2）。

2.3.2 立體選擇性富集 如圖4所示，氟唑菌苯胺在蛋白核小球藻體內(nèi)的過程主要分為吸收和清除兩個階段，且對映體之間存在明顯的差異。實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，蛋白核小球藻中的氟唑菌苯胺濃度始終高于氟唑菌苯胺，3 d時-氟唑菌苯胺和-氟唑菌苯胺在蛋白核小球藻中的濃度達(dá)到最大值，分別為30 mg·kg-1和25 mg·kg-1，生物富集因子分別為19.5和10.7，表明-氟唑菌苯胺較S-對映體容易在藻體內(nèi)富集。根據(jù)GB/T 31270.7[37]，氟唑菌苯胺對映體屬于中等富集性。3 d后，兩個對映體在蛋白核小球藻代謝酶的作用下快速降解，7 d時蛋白核小球藻體內(nèi)-和-氟唑菌苯胺的濃度分別為3.26 mg·kg-1和1.66 mg·kg-1。

3 討論與結(jié)論

氟唑菌苯胺作為種子處理劑被廣泛應(yīng)用于防治有擔(dān)子菌門真菌和子囊菌門真菌引起的土傳或種傳病害[9]。由于種子處理劑直接應(yīng)用于土壤中，且在土壤中的持效期較長，而殘留在土壤中的農(nóng)藥可以通過遷移或地表徑流等方式進(jìn)入水體，從而影響水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡。先前的研究表明氟唑菌苯胺對水生生物具有較高的生態(tài)風(fēng)險。因此本實(shí)驗(yàn)從對映體水平上探究了氟唑菌苯胺對蛋白核小球藻的立體選擇性急性毒性，結(jié)果表明-氟唑菌苯胺具有更高的毒性。研究發(fā)現(xiàn)-氟唑菌苯胺對斑馬魚和非洲爪蟾96 h EC50分別為0.45 mg·L-1和0.3 mg·L-1，且急性毒性均大于-氟唑菌苯胺[12]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。同時，氟唑菌苯胺對于水生植物的毒性小于水生動物，根據(jù)農(nóng)藥對藻類毒性劃分等級（GB/T31270.14-2014）[38]，氟唑菌苯胺外消旋體及其對映體均為低毒。

農(nóng)藥影響藻類的光合作用。研究表明戊唑醇可有效抑制藻細(xì)胞中葉綠素a和總?cè)~綠素的生物合成，光合色素含量與暴露濃度呈劑量依賴型。隨著農(nóng)藥濃度的增加，蛋白核小球藻光合色素含量逐漸降低[36]。光合色素含量的降低可能是由于戊唑醇脅迫對色素生物合成途徑的破壞導(dǎo)致的。本研究測定了氟唑菌苯胺對映體對蛋白核小球藻光合色素含量的影響，結(jié)果表明氟唑菌苯胺對映體對光合色素的生物合成具有明顯的立體選擇性抑制作用，-氟唑菌苯胺的抑制效果更為明顯。光合作用是藻類吸收光能，把二氧化碳和水合成賦能有機(jī)物，同時釋放氧氣的過程，對于藻類的生長具有重要意義。光合作用受阻，導(dǎo)致藻類呼吸作用底物不足，從而影響能量供給，最終導(dǎo)致藻類死亡，結(jié)合急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測氟唑菌苯胺對蛋白核小球藻的立體選擇性毒性可能是由于對映體對光合色素生物合成的抑制程度差異所導(dǎo)致的。

手性農(nóng)藥對映體在生物體內(nèi)的降解往往具有選擇性，Zhang等探究了蛋白核小球藻對手性三唑類殺菌劑丙硫菌唑的立體選擇性降解[39]，結(jié)果表明高毒對映體-丙硫菌唑被優(yōu)先降解，從而降低丙硫菌唑?qū)λ锏亩拘?。然而本?shí)驗(yàn)中，蛋白核小球藻優(yōu)先降解低毒對映體-氟唑菌苯胺，導(dǎo)致氟唑菌苯胺的水生生態(tài)風(fēng)險增加。

生物富集實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，-氟唑菌苯胺被蛋白核小球藻優(yōu)先吸收，因此，水中氟唑菌苯胺的立體選擇性降解與蛋白核小球藻選擇性吸收有關(guān)。另外，由于-氟唑菌苯胺急性毒性較大，對于蛋白核小球藻的光合作用的抑制高于-氟唑菌苯胺，從而導(dǎo)致小球藻能量生成不足，影響小球藻主動吸收及代謝酶的活性，最終導(dǎo)致水中-氟唑菌苯胺的濃度高于-對映體。

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Stereoselective toxic effects of penflufen against

WEN Hongwei1,2，ZHANG Zhaoxian1, XUE Jiaying1，DUAN Jinsheng2,WU Xiangwei1

(1. School of Resources and Environment, Anhui Agricultural University, Hefei 230036；2. Institute of Plant Protection and Agro-Products Safety, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031)

The acute toxicity of penflufen enantiomers and the effects of photosynthetic pigment content towere measured to investigate the stereoselective toxic effect for aquatic organism. The results showed that the EC50of-penflufen towas 1.2 times that of-penflufen, indicating that acute toxicity of-penflufen was higher than that of-penflufen. At the high exposure concentration, the inhibition rates of-penflufen on the biosynthesis of chlorophyll A, chlorophyll B, and carotene were 35%, 28% and 37%, respectively, which were 2.1, 1.9 and 2.8 times that of-penflufen. These results suggested that the enantioselective acute toxicity of penflufen tomight be caused by the difference in the inhibition of biosynthesis of photosynthetic pigments by enantiomers. The degradation percentages of-penflufen and-penflufen at 7 d were 82.5% and 65.8%, respectively, suggesting that the low toxic-penflufen preferred to be degraded with the enantiomer fraction value of 0.12. In addition, the configuration of penflufen enantiomer was stable. These results provide an important basis for the aquatic ecological risk assessment of penflufen and a novel insight into the study of the enantioselective mechanism of chiral pesticides.

penflufen;; enantioselectivity; acute toxicity; photosynthetic pigments; degradation

X592; S481.1

A

1672-352X (2023)02-0283-06

2022-06-23

國家自然科學(xué)基金（32072465）和安徽省高校協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目（GXXT-2021-057）共同資助。

溫宏偉，碩士研究生。E-mail：shengtaiwhw@163.com

通信作者:薛佳瑩，副教授。E-mail：xuejiaying0715@163.com 段勁生，研究員。E-mail：djszbzas@126.com

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230511.002

2023-05-12 10:33:30

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20230511.1149.004.html