吳圣進(jìn)　張芳芳　陳雪鳳　劉增亮　張?chǎng)?/p>

關(guān)鍵詞：香菇；新型ISSR；雙單雜交；雜合子；分子鑒別

中圖分類號(hào)：S961.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

香菇是我國(guó)傳統(tǒng)的菜肴，其味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛(ài)。香菇的人工栽培歷史悠久，近20 年得到迅猛發(fā)展，已成為我國(guó)栽培規(guī)模最大的食用菌品種，年產(chǎn)量達(dá)900 多萬(wàn)t[1]。我國(guó)培育出的優(yōu)良香菇品種不斷增長(zhǎng)，為香菇產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展做出了卓越貢獻(xiàn)[2]。

香菇雜交育種是其新品種選育中最常用、最有效的技術(shù)手段，主要包括單單雜交與雙單雜交2 種方法。雙單雜交是以2 個(gè)親本中的一個(gè)親本的單核體作為受體，以能提供所需優(yōu)良性狀的另一個(gè)親本雙核菌株為供體，其一個(gè)核進(jìn)入受體細(xì)胞完成配對(duì)的非對(duì)稱雜交方法。雙單雜交具有雜交后代篩選工作量相對(duì)少、育種周期相對(duì)短等優(yōu)點(diǎn)，從而被廣泛應(yīng)用[3-6]。

雜交后代的鑒定篩選是香菇雜交育種過(guò)程中的關(guān)鍵步驟之一，傳統(tǒng)方法通過(guò)拮抗試驗(yàn)和顯微觀察菌絲是否存在鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)進(jìn)行判別，非常費(fèi)時(shí)、費(fèi)工，而且效率低、誤判率高。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)被越來(lái)越多的應(yīng)用于食用菌雜交育種中，其中ISSR（intersimplesequence repeat）作為一種常用的分子標(biāo)記，具有穩(wěn)定性好、可重復(fù)性高、引物通用等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食用菌的遺傳差異分析[7-9]。ISSR 標(biāo)記已成功應(yīng)用于香菇單孢雜交后代的分析，王麗寧等[10]應(yīng)用ISSR 標(biāo)記分析耐高溫的香菇單孢雜交子時(shí)，發(fā)現(xiàn)與親本存在一定遺傳差異；宋瑩等[11]利用ISSR 標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，香菇單孢雜交菌株0912 同時(shí)含有2 個(gè)香菇親本菌株的特異性條帶，從而判定0912 為兩親本的雜交后代；陳世通等[12]利用ISSR 標(biāo)記成功從84 個(gè)香菇單孢雜交菌株中篩選出45 個(gè)真正的雜合子。本研究將ISSR分子標(biāo)記技術(shù)拓展應(yīng)用于香菇雙單雜交后代的鑒別篩選，同時(shí)通過(guò)區(qū)分供體核對(duì)雜交子進(jìn)行歸類分組，以期為香菇優(yōu)異單核體菌株材料的創(chuàng)制和篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

香菇親本菌株808 和YX7 均由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所提供。菌株808 是廣西推廣栽培品種，具有外觀品質(zhì)好，栽培產(chǎn)量高等優(yōu)良性狀；菌株YX7 是廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所分離馴化自廣西野生香菇的菌株，具有較耐高溫、香味濃、出菇早等優(yōu)良性狀。PDA 培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 孢子單核體菌株的獲取 親本香菇菌株808 栽培出菇后，選擇菇形圓整、開(kāi)傘七八分的子實(shí)體，在無(wú)菌環(huán)境下采集孢子。采用稀釋涂板法分離單孢子[10， 13]，菌絲萌發(fā)并純化一次后，顯微鏡檢測(cè)3 次無(wú)鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)的判定為單孢菌株，試管培養(yǎng)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙單雜交及雜交菌株的獲得 參照程爽爽等[14]的方法，將分離自菌株808 的不同孢子單核體菌株，分別與供體親本雙核菌株YX7 同時(shí)接種到PDA 平板上進(jìn)行兩兩配對(duì)雜交，兩菌株接種點(diǎn)相距1.5 cm，于25℃下培養(yǎng)15 d，挑取單核體菌株遠(yuǎn)離供體親本菌株一邊的菌絲塊接種于新的PDA 平板上純化2 次，保存，作為候選雜交菌株。

1.2.3 雜交子的鏡檢和拮抗試驗(yàn) 挑取候選雜交菌株菌落邊緣不同部位菌絲，置于顯微鏡下觀察是否存在鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)。同時(shí)挑取候選雜交菌株菌絲塊，接種于新的PDA 平板上，分別與2 個(gè)親本菌株對(duì)峙，于25℃下培養(yǎng)15 d，觀察候選雜交菌株與兩親本菌株的拮抗反應(yīng)情況。

1.2.4 ISSR 分析 將親本菌株和候選雜交菌株分別接種至鋪有玻璃紙的PDA 平板上，于25℃下培養(yǎng)10 d，收集菌絲，采用吳圣進(jìn)等[9]的方法提取基因組總DNA。ISSR-PCR 反應(yīng)體系為：2×Taq PCR MasterMix 10 μL ， Primer 1 μL（10 μmol/L），模板DNA 1 μL（150 ng），ddH2O8 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，按表1 所列退火溫度下復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)35 次；72℃延伸7 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用含有GelRed 染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并于凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

1.2.5 ISSR 綜合分析 首先比較2 個(gè)親本菌株間的條帶（圖1），相同ISSR 引物下，2 個(gè)親本菌株的PCR 電泳條帶中，僅菌株808 擁有的DNA 條帶為該菌株的特異性條帶（圖1 中的箭頭a 所示條帶）；與此相同，僅菌株YX7 擁有的DNA 條帶則為菌株YX7 的特異性條帶（圖1 中的箭頭b 所示條帶）；相同大小位置，菌株YX7 和808 都有的DNA 條帶設(shè)為共同條帶（圖1 中的箭頭c 所示條帶）。檢測(cè)記錄每個(gè)雜交子菌株的電泳圖譜是（標(biāo)記為●）否（標(biāo)記為○）存在上述3 類條帶。如圖1 中雜交菌株1、2 和7 擁有3 類條帶（菌株808 和菌株YX7 特異性條帶、共同條帶）情況分別標(biāo)記為：○●●、●●●和●○○。將同一雜交菌株不同引物的結(jié)果進(jìn)行綜合分析，同一類型條帶只要有一個(gè)引物的結(jié)果為●，則該類型條帶綜合結(jié)果標(biāo)記為●，若所有引物的結(jié)果均為○，則該雜交菌株該類型條帶綜合結(jié)果標(biāo)記為○。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙單雜交子的鏡檢和拮抗測(cè)試

隨機(jī)挑取40 個(gè)雜交菌株進(jìn)行顯微檢測(cè)和與2個(gè)親本菌株的拮抗測(cè)試（表2）。顯微檢測(cè)結(jié)果表明，40 個(gè)雜交菌株中共有36 個(gè)菌株檢測(cè)出鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)，這些菌株可鑒定為雙核菌株，剩余4個(gè)雜交菌株未檢測(cè)出鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)，其可能是單核菌株，初步鑒定為非雜合子。拮抗測(cè)試結(jié)果表明，與2 個(gè)親本菌株的拮抗反應(yīng)均明顯的雜交菌株共有19 個(gè)，可初步鑒定為雜合子。對(duì)2 個(gè)親本菌株均有拮抗反應(yīng)，但拮抗反應(yīng)不明顯的雜交菌株共有5 個(gè)；與親本無(wú)拮抗反應(yīng)的雜交菌株共有16 個(gè)。不明顯的拮抗反應(yīng)與無(wú)拮抗反應(yīng)二者較難區(qū)分，如菌株808 自身應(yīng)無(wú)拮抗的菌落間也有不明顯的溝痕，菌株YX7 自身應(yīng)無(wú)拮抗的菌落間也有細(xì)微隆起（圖2）。因此，菌株15 與YX7 的菌落間有不明顯的溝痕，本研究判斷為不拮抗，菌株47 與808 菌落間有不明顯隆起而判斷為輕微拮抗，菌株24 與YX7、菌株49 與808 菌落間明顯隆起而判斷為明顯拮抗?？梢?jiàn)，拮抗反應(yīng)的判斷具有主觀性，存在誤判的可能。19 個(gè)與親本均拮抗明顯的雜交菌株同時(shí)檢測(cè)出鎖狀結(jié)構(gòu)，可確定為雜合子，分別是菌株2、3、7、8、9、13、23、24、31、34、35m、38、39、42、46、52、57、66 和67。與親本拮抗不明顯的5 個(gè)雜交菌株中，菌株1、52e 和68 檢測(cè)有鎖狀結(jié)構(gòu)，菌株47 和79 未檢測(cè)出鎖狀結(jié)構(gòu)。與親本不拮抗的16 個(gè)雜交菌株中，菌株15、36m、36e、37m、37e、49、52m、58m、58 e、60、70、70e、74 和78 共14個(gè)菌株存在鎖狀結(jié)構(gòu)，菌株56m 和73 未檢測(cè)出鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)。

2.2 傳統(tǒng)ISSR 多引物綜合分析雙單雜交菌株

采用P1、P2、P4 和P9 引物的ISSR 數(shù)據(jù)對(duì)選用的40 個(gè)香菇雜交子菌株進(jìn)行綜合分析（表3）。40 個(gè)雜交菌株中，27 個(gè)雜交菌株2、3、7、8、9、13、23、24、31、34、35m、37m、37e、38、39、42、46、47、52、52e、57、58e、66、67、70、70e 和79 均具有兩親本的特異性條帶，確定為雜合子；13 個(gè)雜交菌株1、15、36m、36e、52m、49、56m、58m、60、68、73、74 和78 僅有單個(gè)親本菌株的特異性條帶，不能確定為真正的雜合子，但它們均具有兩親本的共同條帶，由于共同條帶無(wú)法確定源自哪個(gè)親本，因此也不能排除它們?yōu)殡s合子的可能性。

2.3 新型ISSR 技術(shù)單引物鑒別分析雙單雜交菌株

新型ISSR 技術(shù)采用篩選出的單個(gè)引物P1，該引物能擴(kuò)增出供體菌株YX7 的d、e 和f 3 條特異性條帶（圖3），其中f 條帶在所有雜交菌株中均有出現(xiàn)，而d 和e 條帶則分別出現(xiàn)在不同的雜交菌株中。說(shuō)明f 條帶位點(diǎn)同時(shí)分布在供體親本菌株YX7 的2 個(gè)細(xì)胞核中，而d 和e 條帶位點(diǎn)則分別分布在菌株YX7 的2 個(gè)細(xì)胞核中。因此，根據(jù)電泳圖譜可將待測(cè)菌株分成4 類，第1 類為擁有d 特異性條帶的雜合子（圖3 中的菌株2、3、13、23 和31），第2 類為擁有e 特異性條帶的雜合子（圖3 中的菌株7、24、34、39 和42），第3類為同時(shí)擁有d 和e 條帶的非雜合子（圖3 中的菌株1、49 和52m），第4 類為d 和e 條帶都沒(méi)有的非雜合子（圖3 中菌株56m）。第3 類非雜合子可能是誤挑取的供體親本菌株YX7 本身，第4 類非雜合子則是未獲得供體核的808 孢子單核體。

研究結(jié)果表明，40 個(gè)待測(cè)菌株中共有27 個(gè)為雜合子，其中擁有d 條帶的雜合子為菌株2、3、9、13、23、31、35m、37m、37e、38、46、52e、57、58e、66、67、70、70e 和79，擁有e 條帶的雜合子為菌株7、8、24、34、39、42、47、和52。11 個(gè)菌株1、15、36m、36e、49、52m、58m、60、68、74 和78 為誤挑取的供體親本YX7 雙核菌株；菌株56m 和73 則為未雜交成功的808 孢子單核體菌株。

3 討論

菌絲存在鎖狀聯(lián)合和與兩親本存在拮抗反應(yīng)，是鑒別異宗結(jié)合食用菌如姬菇[15]、杏鮑菇[16]、金針菇[17]、香菇[6]等品種雜交后代的最常用方法。本研究中，40 個(gè)雜交菌株中有19 個(gè)菌株同時(shí)與兩親本具有明顯的拮抗反應(yīng)并具有鎖狀聯(lián)合，可以確定是雜合子。但也有存在鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)而與親本拮抗反應(yīng)不明顯或無(wú)拮抗反應(yīng)的情況，如菌株1、52e、68、15、36m、36e、37m、37e、49、52m、58m、58e、60、70、70e、74、78 等。由于挑取雙單雜交后代時(shí)有可能取到雙核親本的菌絲，它們具有鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)，而自身又存在輕微拮抗反應(yīng)，此時(shí)很容易將這些非雜合子誤判為雜合子，所以有鎖狀聯(lián)合但與親本存在不拮抗或拮抗不明顯的菌株還有待進(jìn)一步的檢測(cè)確定。菌株47 和79 未檢測(cè)出鎖狀聯(lián)合，但與兩親本均有輕微拮抗反應(yīng)，這也有待于進(jìn)一步檢測(cè)，以免因鎖狀聯(lián)合未被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致將雜合子誤判為非雜合子?？梢?jiàn)，傳統(tǒng)的鎖狀聯(lián)合和拮抗反應(yīng)觀測(cè)結(jié)果只能確定部分雜合子，尚有許多不能確定的菌株，而且容易產(chǎn)生誤判。

為確保雜合子鑒別的準(zhǔn)確性和高效率，分子標(biāo)記技術(shù)被越來(lái)越多應(yīng)用于雜交子的鑒定。王麗寧等[10]和宋春艷等[18]分別采用傳統(tǒng)ISSR 和RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)比較香菇雜交子與親本間的遺傳差異，但由于孢子與親本本身存在遺傳差異，不能根據(jù)雜交子與親本存在遺傳差異而判斷其為雜合子。陳世通等[12]通過(guò)篩選出ISSR 引物6，將香菇單單雜交菌株中同時(shí)擁有2 個(gè)親本的特異性條帶的菌株成功判斷為雜合子。但傳統(tǒng)ISSR 技術(shù)需要多個(gè)引物進(jìn)行分析比較才能辨識(shí)出盡可能多的雜合子，而僅憑單個(gè)或少數(shù)引物的結(jié)果則有可能使部分雜合子不被辨識(shí)。本研究采用多個(gè)引物對(duì)香菇雙單雜交菌株進(jìn)行傳統(tǒng)ISSR 分析，根據(jù)雜交菌株是否擁有兩親本特異性條帶判斷其是否為雜合子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分菌株（如菌株8）單個(gè)引物（如P1、P2 或P9）的ISSR 圖譜僅有一個(gè)親本的特異性條帶，不能被標(biāo)識(shí)為雜合子，但綜合多個(gè)引物的結(jié)果則同時(shí)擁有兩親本特異性條帶，可判斷為雜合子?？梢?jiàn)，增加引物數(shù)量可提高傳統(tǒng)ISSR 技術(shù)對(duì)雜合子的辨識(shí)率。本研究采用4個(gè)引物對(duì)待檢雜交菌株進(jìn)行傳統(tǒng)ISSR 分析，結(jié)果從40 個(gè)雜交菌株中共辨識(shí)出27 個(gè)雜合子菌株，仍有13 個(gè)菌株尚無(wú)法判斷是雜合子還是非雜合子。可見(jiàn)，傳統(tǒng)ISSR 技術(shù)判斷出的雜合子具有較高的準(zhǔn)確性，但無(wú)法判斷非雜合子菌株。

雙單雜交的供體是雙核菌株，其2 個(gè)核的基因型是固定的，雜交時(shí)單核體只能接受其中一個(gè)核形成新的雜合子，不同雜合子接受到的核只有2 種，它們受單核體基因型的控制[3]。因此，可通過(guò)標(biāo)記區(qū)分供體2 個(gè)細(xì)胞核，對(duì)雜合子進(jìn)行鑒定。本研究構(gòu)建了一種新型ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)鑒別香菇雙單雜交雜合子，該技術(shù)利用單個(gè)引物（P1）可擴(kuò)增出雙單雜交中供體親本菌株的2 個(gè)細(xì)胞核的特異性條帶，擁有其中任意一條特異性條帶的雜交菌株可判斷為雜合子，無(wú)特異性條帶或同時(shí)擁有2 個(gè)細(xì)胞核的特異性條帶的雜交菌株均可判斷為非雜合子。本研究結(jié)果表明，新型ISSR 分子技術(shù)從40 個(gè)雜交菌株中檢測(cè)出27 個(gè)菌株為雜合子，檢測(cè)出的雜合子菌株與傳統(tǒng)ISSR 方法檢測(cè)的結(jié)果完全一致，同時(shí)確定其余13 個(gè)菌株為非雜合子。27 個(gè)雜合子中，有19 個(gè)雜合子接受了供體相同的一個(gè)細(xì)胞核，另外8 個(gè)雜合子則接受了供體的另外一個(gè)細(xì)胞核，從而可將雜合子分為2 類，有利于后續(xù)的農(nóng)藝性狀定位和遺傳分析。

與傳統(tǒng)顯微觀察與拮抗試驗(yàn)方法相比，新型ISSR 技術(shù)可鑒定出待檢菌株中的全部27 個(gè)雜合子菌株，而傳統(tǒng)顯微觀測(cè)與拮抗試驗(yàn)方法只能確定19 個(gè)菌株為雜合子；傳統(tǒng)方法容易將有鎖狀聯(lián)合但無(wú)拮抗或拮抗不明顯的菌株（如菌株52e、37m、37e、58e、70 和70e），以及未檢測(cè)出鎖狀聯(lián)合的菌株（如菌株47 和79）誤判為非雜合子，而新型ISSR 技術(shù)可準(zhǔn)確鑒定它們?yōu)殡s合子，菌株47 和79 未檢測(cè)出鎖狀聯(lián)合可能是顯微檢測(cè)時(shí)視野數(shù)量不夠多所致；傳統(tǒng)方法有時(shí)也容易將非雜合子誤判為雜合子，如菌株1 與808 有明顯拮抗，與YX7 有輕微拮抗，且菌絲有鎖狀聯(lián)合，按傳統(tǒng)方法判斷應(yīng)為雜合子，但新型ISSR 技術(shù)結(jié)果表明，菌株1 同時(shí)具有供體2 個(gè)核的特異性條帶，為YX7 自身而非雜合子。可見(jiàn)，新型ISSR 分子技術(shù)可以完美解決傳統(tǒng)顯微觀察和拮抗試驗(yàn)對(duì)雜合子鑒別結(jié)果不夠全面和容易產(chǎn)生誤判的問(wèn)題。

與傳統(tǒng)ISSR 技術(shù)相比，新型ISSR 技術(shù)采用單個(gè)引物就可確定全部27 個(gè)雜合子菌株，而傳統(tǒng)ISSR 技術(shù)需采用4 個(gè)引物才能鑒別出27 個(gè)雜合子。新型ISSR 技術(shù)可確定剩余13 個(gè)菌株為非雜合子，其中有11 個(gè)菌株（分別為1、15、36m、36e、49、52m、58m、60、68、74 和78）同時(shí)擁有供體親本2 個(gè)核的特異性條帶，說(shuō)明它們是供體菌株YX7 本身，可能是挑取菌絲時(shí)誤取到供體菌絲所致；另外2 個(gè)非雜合子菌株56m 和73 不擁有供體任一核的特異性條帶，說(shuō)明是受體菌株808 的孢子單核體。而傳統(tǒng)ISSR 技術(shù)則無(wú)法確定剩余13 個(gè)菌株為雜合子還是非雜合子，更無(wú)法解釋非雜合子的來(lái)源。新型ISSR 技術(shù)能根據(jù)導(dǎo)入的供體細(xì)胞核類別將雜合子歸為2 類，而傳統(tǒng)ISSR則不能對(duì)雜合子進(jìn)行分類。

綜上所述，基于供體親本菌株雙核特異性條帶的單引物新型ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)可準(zhǔn)確鑒別待測(cè)菌株是雜合子還是非雜合子，解決了傳統(tǒng)顯微觀察和拮抗試驗(yàn)方法效率低、準(zhǔn)確性差的問(wèn)題，同時(shí)解決了傳統(tǒng)ISSR 技術(shù)需要采用多引物而程序復(fù)雜、雜合子鑒別結(jié)果全面性不確定、無(wú)法判定非雜合子、不能對(duì)雜合子歸類的問(wèn)題，是一種簡(jiǎn)便、快速和有效的香菇雙單雜交后代鑒定技術(shù)。該技術(shù)不僅可運(yùn)用在香菇雜交育種中，還可拓展到其他食用菌品種的雜交育種中，缺點(diǎn)是不能用于單單雜交中的雜合子鑒別。