慕靜怡　胡發(fā)廣　張珍珍　董文江　李亞男　畢曉菲　胡榮鎖　陳小愛

關(guān)鍵詞：綠咖啡油；微膠囊；復(fù)合凝聚法；結(jié)構(gòu)表征；熱穩(wěn)定性

中圖分類號：S571.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

咖啡是我國重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國咖啡種植主要分布在云南、海南、四川、臺灣等地[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2021 年我國咖啡種植面積已達(dá)9.39 萬hm²，總產(chǎn)量達(dá)10.91 萬t[2]。云南省咖啡面積和產(chǎn)量分別占全國的98.84%和99.61%。中國的咖啡消費(fèi)正在以每年超過15%的速度增長，2021 年中國咖啡市場規(guī)模突破1700億元，居全球第8 位。與咖啡的食用價(jià)值相比，作為咖啡衍生產(chǎn)品之一的綠咖啡油（green coffeeoil， GCO）利用率很低，常用于化妝品行業(yè)[3]。綠咖啡油富含生育酚和不飽和脂肪酸，如油酸和亞油酸等，可用于生產(chǎn)營養(yǎng)制品[4]。然而其中多不飽和脂肪酸極不穩(wěn)定且易氧化，導(dǎo)致綠咖啡油保質(zhì)期縮短及感官、營養(yǎng)品質(zhì)下降，極大限制了其生物活性的發(fā)揮。因此，如何保證綠咖啡油的穩(wěn)定性，對綠咖啡油的應(yīng)用具有極其重要的價(jià)值。

微膠囊化能使液態(tài)的油脂轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂杏H水性的固體粉末，保護(hù)油脂免受外界因素的影響，不僅保持了油脂原有的營養(yǎng)價(jià)值，還使其具有穩(wěn)定的性質(zhì)和優(yōu)良的加工特性[5]。微膠囊制備的常用方法包括復(fù)合凝聚法、噴霧干燥法和分子包埋法等。韓婕妤等[6]用噴霧干燥法成功制備奇亞籽油微膠囊，有效延緩奇亞籽油的氧化，提高了奇亞籽油的貯藏穩(wěn)定性。張維等[7]用超聲波輔助分子包埋法制備榛子油微膠囊，減緩榛子油氧化速度的同時(shí)延長了其貨架期。COMUNIAN 等[8]通過噴霧干燥法制備綠咖啡油微膠囊，所制備的微膠囊具有良好的穩(wěn)定性，具有開發(fā)營養(yǎng)食品或化妝品配方的潛力。DE OLIVEIRA 等[9]用復(fù)合凝聚法制備綠咖啡油微膠囊并應(yīng)用到果汁中，綠咖啡油微膠囊可以有效改善果汁流變性，提高感官質(zhì)量。利用復(fù)合凝聚法制備綠咖啡油微膠囊具有操作簡單、重現(xiàn)性好、無需復(fù)雜設(shè)備且制備的產(chǎn)品熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[9]，目前國內(nèi)外利用復(fù)合凝聚法制備綠咖啡油微膠囊的報(bào)道較少。

目前復(fù)合凝聚技術(shù)最常用的壁材是明膠和阿拉伯膠（gum arabic， GA）[10]，但牛肉明膠因朊病毒病及其食品安全問題而使其應(yīng)用范圍下降。在食品領(lǐng)域，多種動、植物源蛋白已被開發(fā)為明膠的替代品，并與碳水化合物結(jié)合后作為復(fù)合凝聚微膠囊技術(shù)中的壁材[11]。在前期基礎(chǔ)中，譚睿等[12]初步評價(jià)了不同多糖與明膠組合復(fù)合凝聚法包埋綠咖啡油的微膠囊性能，而對動、植物源蛋白與阿拉伯膠為壁材復(fù)合凝聚制備綠咖啡油微膠囊還有待研究。

本研究以3種疏水性蛋白和阿拉伯膠為壁材，采用復(fù)合凝聚法制備綠咖啡油微膠囊，考察不同壁材對綠咖啡油微膠囊包埋效果、表觀形貌、結(jié)構(gòu)組成的影響；探究壁材及其微膠囊內(nèi)部的相互作用力及熱穩(wěn)定性。該研究為制備綠咖啡油微膠囊提供新的思路和途徑，也為綠咖啡油穩(wěn)定性提升和高值化利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 綠咖啡油（C16：0， 5%～20%；C18：0， <7.0%; C18：1， 20%～35%; C18：2， 50%～70%）由雅克耶提芳香醫(yī)藥（青島）有限公司提供；阿拉伯膠、大豆分離蛋白（soybean proteinisolate， SPI）、尼羅紅（用于熒光分析，≥95.0%）、戊二醛為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；HilmarTM 9410 乳清分離蛋白（whey proteinisolate， WPI; 89%）為美國Hilmar 公司產(chǎn)品；酪蛋白酸鈉（sodium caseinate， SC; >90%）、異硫氰酸熒光素（偶聯(lián)級，90%標(biāo)記率）、異硫氰酸玫瑰紅B（偶聯(lián)級，70%標(biāo)記率）為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 Seven Compact S220 pH 計(jì)[Mettler Toledo 儀器（上海）有限公司]，F(xiàn)J200-SH型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)（上海標(biāo)本模型廠），數(shù)顯懸臂式恒速強(qiáng)力電動攪拌機(jī)（江陰市保利科研器械有限公司），DF-101 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），SynergyH1全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（美國BioTek 有限公司），Mastersizer 3000 激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司），Phenom Prox 臺式顯微能譜一體機(jī)（荷蘭復(fù)納科學(xué)儀器有限公司），Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Fisher 公司），F(xiàn)V10i 激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司），Ultima IV X 射線衍射儀（日本理學(xué)株式會社），DSC25 差示掃描量熱儀（美國TA公司）。

1.2 方法

1.2.1 濁度的測定 采用大豆分離蛋白（SPI）、乳清分離蛋白（WPI）和酪蛋白酸鈉（SC）與阿拉伯膠（GA）分別配制總濃度為0.1%（W/V）的溶液（表1），將溶液置于45 ℃的恒溫水浴環(huán)境下，逐滴緩慢滴加鹽酸（0.1、1.0、10.0 mol/L、），調(diào)節(jié)混合體系的pH，以0.1 梯度調(diào)節(jié)pH 至2.0左右，分別測定pH 和波長為600 nm 處吸光度。

1.2.2 復(fù)聚物的制備工藝 根據(jù)表2 混合均勻制備總生物聚合物濃度為1%的溶液，將混合溶液轉(zhuǎn)移至三口燒瓶，保持體系溫度50 ℃，置于恒溫加熱磁力攪拌器中， 攪拌備用。以攪拌速率400 r/min，在30 min 內(nèi)緩慢滴加1%或10%鹽酸調(diào)節(jié)乳液的pH 至前述濁度的最優(yōu)pH。關(guān)閉加熱源，2 h 內(nèi)自然冷卻至室溫后，用冰水浴降溫至4 ℃，繼續(xù)反應(yīng)1 h。然后將反應(yīng)體系置于冰水浴中使溶液降溫至15 ℃以下保持30 min，以結(jié)束復(fù)合凝聚反應(yīng)。用1% NaOH 溶液調(diào)節(jié)體系pH 至6.0，然后加入5 mL 戊二醛（1%）進(jìn)行固化，反應(yīng)時(shí)間為3 h。固化后即為綠咖啡油微膠囊懸浮液，靜置分層、離心分離上清液后在溫度為–80 ℃的超低溫冰箱預(yù)凍24 h，在–50 ℃和20 kbar 下真空冷凍干燥48 h。所得樣品盛放于高密度聚乙烯袋中，并保存于棕色干燥器中備用。

1.2.3 微膠囊的制備工藝 采用復(fù)合凝聚法制備綠咖啡油微膠囊（圖1）。按表2 分別配置壁材儲備液，以芯壁比1∶1 添加綠咖啡油，10 000 r/min均質(zhì)5 min，得到O/W 乳液；再緩慢加入GA 儲備液，10 000 r/min 二次均質(zhì)5 min，得到生物聚合物濃度為1%的乳液，室溫下以500 r/min 速度攪拌，并用1.0 mol/L HCl 緩慢滴加調(diào)節(jié)pH 至固定值后，凝聚30 min。后續(xù)制備過程同1.2.2。

1.2.4 粒度分布 參照YANG 等[13]的方法，采用Mastersizer 3000 激光粒度儀測定綠咖啡油微膠囊的尺寸分布。每個樣品重復(fù)測定3 次。

1.2.5 微膠囊產(chǎn)率、包埋率的測定 根據(jù)以下公式計(jì)算微膠囊產(chǎn)率（YE）：

微膠囊表面含油量（SO）測定：稱取m0 微膠囊粉末，分次加入30 mL 石油醚快速洗滌，然后過濾至恒重圓底燒瓶m₁，在45 ℃和100 Mpa壓力下進(jìn)行溶劑回收，收集完畢于恒溫干燥箱中干燥1.5 h，冷卻稱重，重復(fù)操作直至恒重m₂。根據(jù)以下公式計(jì)算表面含油量：

微膠囊總含油量（TO）測定：稱取1.0 g 微膠囊粉末，用10 mL 蒸餾水（45～50 ℃）分次溶解，加入1.25 mL 濃氨水混勻，置于60 ℃水浴加熱5 min，冷卻加入10 mL 無水乙醇充分搖勻，再加入25 mL 無水乙醚輕輕振蕩1 min 排氣，加入25 mL 石油醚劇烈振蕩30 s 后靜置30 min 分層，待上層澄清時(shí)讀取上層清液總體積（V₀），吸取一定體積的上清液（V₁）于已恒重的圓底燒瓶（m₁）中。在45 ℃和100 Mpa 壓力下進(jìn)行溶劑回收，收集完畢于恒溫干燥箱中干燥1.5 h，冷卻稱重，重復(fù)操作直至恒重m₂。根據(jù)以下公式計(jì)算總含油量：

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析 參照周麟依等[14]的方法，利用OMNIC 32 軟件對光譜進(jìn)行平滑和基線校正處理，光譜數(shù)據(jù)輸出格式為透光率，重復(fù)測定3 次。

1.2.7 掃描電鏡（SEM）分析 參照LAN 等[15]的方法，用掃描電鏡觀察綠咖啡油微膠囊及復(fù)聚物的微觀形貌。

1.2.8 激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）分析 通過激光共聚焦顯微鏡在雙波長下觀察復(fù)聚物和微膠囊的樣品形態(tài)。復(fù)聚物和微膠囊油滴觀察分別采用DUHORANIMANA 等[16]和BAKRY 等[17]的方法。

1.2.9 X 射線衍射分析（XRD） 參照ALI 等[18]的方法，使用Jade 軟件下對樣品的結(jié)晶度進(jìn)行計(jì)算，相對結(jié)晶度（relative crystallinity）為衍射峰面積與總衍射峰面積之比。

1.2.10 差示掃描熱量法（DSC） 參照SHI 等[19]方法并稍作修改，采用差示掃描量熱儀分別對綠咖啡油微膠囊和空囊樣品進(jìn)行掃描，并作差示掃描分析曲線，測定玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 96（Northampton， MA， USA）軟件繪圖，利用SPSS 26.0 軟件（IBM Corporation，New York， NY ） 進(jìn)行樣品間的顯著性分析（P<0.05）。每個樣品重復(fù)測定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 及壁材混合比例對不同蛋白質(zhì)與阿拉伯膠體系濁度的影響

由圖2 可知，濁度曲線的起始階段為體系初始pH（pH 為7.0）下的狀態(tài)，3 種蛋白質(zhì)與阿拉伯膠體系濁度均隨pH 的減小呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)pH 下降至3.0～4.0 時(shí)，濁度急速上升至峰值1.20～1.60，溶液呈現(xiàn)清晰的乳白色，并逐漸轉(zhuǎn)向非透明狀。濁度跨越峰值后迅速進(jìn)入下降階段，與濁度上升過程相比，下降階段趨勢相對平緩且出現(xiàn)拐點(diǎn)，隨后進(jìn)入一個更為遲緩的下降過程。

此外，隨著不同蛋白質(zhì)與阿拉伯膠二者間混合比例的不同，其濁度曲線也存在較大差異。SPI∶GA、WPI∶GA 和SC∶GA 的壁材質(zhì)量比分別設(shè)定為1∶1、2∶1 和2∶1 用于后續(xù)微膠囊制備的最優(yōu)條件，其濁度最高點(diǎn)所對應(yīng)的pH 3.5、3.7和3.8 分別為相應(yīng)微膠囊形態(tài)的最佳理論值。

2.2 復(fù)聚物的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 傅里葉變換紅外光譜分析 由圖3 可知，1610.27 cm^?1和1018.23 cm^?1是屬于阿拉伯膠的峰值，前者在3 種復(fù)聚物的光譜上左移，后者消失。此外，SPI 在3293.82 cm^?1處的吸收帶于SPIGA 復(fù)聚物中移至3208.96 cm^?1處，WPI 位于3299.60 cm^?1處的吸收帶在WPIGA 復(fù)聚物中移至3276.40 cm^?1，SC 位于3208.96 cm^?1處的吸收帶在SCGA 復(fù)聚物中移至3203.18 cm^?1 處。在SPI光譜中，1671.98、1535.05、1247.71 cm^?1處的峰對應(yīng)酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ吸收帶，分別轉(zhuǎn)移到SPIGA 光譜中1643.05、1536.98、1245.79 cm^-1處；在WPI 光譜中，1641.12、1544.70、1249.64 cm^-1處的峰對應(yīng)酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ，分別轉(zhuǎn)移到WPIGA 光譜中的1646.91 、1538.91 、1243.86 cm?1 處。

2.2.2 掃描電鏡分析 采用掃描電鏡對未加入綠咖啡油的干燥凝聚物形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行評價(jià)（圖4），所有樣品圖像均顯示粉末尺寸較大，形狀不規(guī)則，呈團(tuán)聚狀存在，也有類似碎玻璃或片狀結(jié)構(gòu)。微粒表面較為完整，無明顯的裂縫。

2.2.3 激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）分析 采用CLSM 觀察蛋白質(zhì)和多糖在復(fù)聚物中的分布，蛋白質(zhì)（SPI/WPI/SC）和阿拉伯膠分別用熒光標(biāo)記物（FITC 和RBITC）染色。如圖5 所示，3 種復(fù)聚物大小不規(guī)則，凹陷較少且熒光分布均勻。圖5A、圖5D 和圖5G 標(biāo)記蛋白質(zhì)顯示綠色結(jié)構(gòu)，圖5B、圖5E 和圖5H 標(biāo)記阿拉伯膠為紅色通道，均獲得類似的顯微圖像，表明SPI/WPI/SC 和阿拉伯膠同時(shí)存在于凝聚的復(fù)聚物中；圖5C、圖5F和圖5I 可以清楚地看到復(fù)合凝聚體（黃色）的形成，說明阿拉伯膠與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，其中SCGA顆粒外圍有明顯的綠色熒光，可能是由于酪蛋白酸鈉分子比阿拉伯膠分子密度大造成的。

圖片共定位分析常用方法有散點(diǎn)圖（圖6）、共定位相關(guān)系數(shù)分析（表3），均可直觀說明分子間的相互作用、相對位置關(guān)系和空間距離[20]。如圖6 所示，WPIGA 的散點(diǎn)圖分布呈一條直線，說明2 個熒光通道在成像時(shí)強(qiáng)度相當(dāng)，相關(guān)性最強(qiáng)且r=0.945，越趨近于1，共定位程度最高；SPIGA共定位程度次之（r=0.930），而SCGA 的散點(diǎn)圖分布偏移對角線，相關(guān)性較低（r=0.902），共定位程度最低。共定位分析顯示3 種蛋白質(zhì)與阿拉伯膠分布相似，重合率>90%。

2.3 微膠囊的理化性質(zhì)

2.3.1 微膠囊的產(chǎn)率及包埋率 由表4 可知，SPIGA-GCO 微膠囊產(chǎn)率最高，平均為86.40%，WPIGA-GCO 的產(chǎn)率最低，SPIGA-GCO、SCGAGCO微膠囊產(chǎn)率與WPIGA-GCO 差異顯著（P<0.05）。不同壁材的微膠囊之間包埋率存在顯著差異（P<0.05），SPIGA-GCO 的包埋率最高，平均為69.26%，較SCGA-GCO 與WPIGA-GCO具有相對較好的包埋效果。以WPIGA-GCO 的表面含油量最高（15.96%），對應(yīng)包埋率最低。SCGA-GCO 的TO 含量為三者最高，但包埋率較低。

2.3.2 微膠囊的粒徑分析 3 種蛋白質(zhì)與阿拉伯膠為壁材制備的綠咖啡油微膠囊粒徑分布均勻，總體上呈正態(tài)分布，呈明顯的單峰分布（圖7）。3 種微膠囊的徑距隨壁材種類的不同而無明顯差異（P≥0.05），范圍為0.72～1.87（表5）。壁材種類對綠咖啡油微膠囊平均粒徑有顯著影響（P<0.05 ）， 平均粒徑范圍97.60～162.00 μm， 其中WPIGA-GCO 的粒徑最大（162.00 μm）。

2.4 微膠囊的微觀結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 FT-IR 分析 綠咖啡油微膠囊的紅外光譜如圖3 所示。綠咖啡油3464.45 cm^–1（O-H 拉伸）和2935.13、2850.27、1745.26 cm^–1（C=C 伸縮）呈強(qiáng)振動模式，其中1157.08 cm^–1對應(yīng)C-O-C 伸縮。3 種綠咖啡油微膠囊紅外光譜峰位于3542.00～3507.00 cm^-1區(qū)域內(nèi)，3 種蛋白質(zhì)在這個區(qū)域也存在類似的峰值范圍（3299.00～3208.00 cm^–1），是由于O-H 鍵的伸縮振動，且在GA 粉末中3392.17 cm^–1處發(fā)現(xiàn)相同峰，為多糖中O-H 相關(guān)的典型吸收帶伸縮（3550.00～3200.00 cm^–1）、脂肪族伯胺（N-H）伸縮（3400.00～3300.00 cm^–1）和仲胺（N-H）伸縮（3350.00～3310.00 cm^–1）。在游離綠咖啡油的光譜中出現(xiàn)吸收帶3465.45 cm^–1分別轉(zhuǎn)移到3 種綠咖啡油微膠囊光譜中3131.83、3139.54、3145.32 cm^–1處。比較綠咖啡油、3 種復(fù)聚物和綠咖啡油微膠囊的光譜， 在2933.00～2850.00 cm^-1處出現(xiàn)特征吸收帶，證明存在類黃酮的伸縮振動（2920.00～2970.00 cm^?1）和亞甲基的不對稱振動（2925.00～2853.00 cm^?1），表示綠咖啡油已成功封裝到3 種不同復(fù)聚物中。綠咖啡油光譜中出現(xiàn)1745.26 cm^?1吸收峰為甘油三酯羰基官能團(tuán)強(qiáng)烈特征吸收帶，且在3 種微膠囊FT-IR圖中1745.00～1743.00 cm^?1處也出現(xiàn)其峰值。

2.4.2 SEM 分析 3 種微膠囊粉末微觀結(jié)構(gòu)如圖8 所示。所有樣品粉末都具有碎玻璃結(jié)構(gòu)和萎縮的紋理，且顆粒形狀和大小不同，呈不規(guī)則片狀結(jié)構(gòu)。SPIGA-GCO、WPIGA-GCO 和SCGA-GCO微膠囊由于蛋白質(zhì)的乳化特性，油滴在光滑無孔的表面形態(tài)下分散，圖像顯示微粒表面沒有裂紋或裂縫的跡象。

2.4.3 CLSM 分析 由圖9 可以發(fā)現(xiàn)，綠咖啡油微膠囊是不規(guī)則粒子，由于CLSM 的景深有限，凹陷表面的掃描盲區(qū)顯示為黑色。綠色圖層（圖9A、圖9D、圖9G）為FITC 所染不同的蛋白質(zhì)，紅色圖層（圖9B、圖9E、圖9H）為尼羅紅所染的綠咖啡油， 后者的熒光強(qiáng)度反映油量。在WPIGA-GCO和SCGA-GCO顆粒表面有部分強(qiáng)烈的紅色熒光，說明表面油量較多且相對包埋率低（圖9E、圖9H）。SPIGA-GCO 圖像顯示的熒光強(qiáng)度較低且均勻，表明綠咖啡油被較好地包埋在顆粒內(nèi)部（圖9B）。此外，從圖9C、圖9F、圖9I 中觀察到油滴（紅色部分）被均勻地嵌入在蛋白質(zhì)基質(zhì)（綠色部分）中，無論是外層還是內(nèi)層，表明綠咖啡油被SPIGA、WPIGA 或SCGA 成功封裝。其中SPIGA-GCO 中紅色熒光分布更為均勻，說明綠咖啡油被有效包埋在SPIGA 中；而WPIGA-GCO 中部分油滴被組織成小液滴外露在壁材表面（箭頭所示）。

2.4.4 XRD 分析 圖10 所示，3 種壁材（SPIGA、WPIGA、SCGA）與其綠咖啡油微膠囊的衍射圖形大致相似，為一個較寬的漫反射峰，表明綠咖啡油微膠囊具有無定形結(jié)構(gòu)的特征；3 種綠咖啡油微膠囊衍射角（2θ）范圍為19.38～20.92°與壁材相比（19.18～19.58°），微膠囊的特征峰都發(fā)生了偏移。表明SPIGA-GCO、WPIGA-GCO 和SCGA-GCO 的絡(luò)合是成功的。此外，3 種壁材與綠咖啡油微膠囊的2θ 附近其峰值銳度和強(qiáng)度存在差距，綠咖啡油微膠囊峰值較窄且強(qiáng)度增加，表明添加綠咖啡油不會顯著改變主衍射峰的位置，但會使衍射峰變窄且強(qiáng)度增加。本研究中SPIGA-GCO、WPIGA-GCO 和SCGA-GCO 3 種微膠囊的相對結(jié)晶度分別為45.99%、46.37%和42.23%，其中WPIGA-GCO 顯示出很小的結(jié)晶傾向，與其他壁材相比具有較高的相對結(jié)晶度。

2.5 微膠囊的熱性能分析

由圖11 可知，3 種綠咖啡油微膠囊的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度均在100 ℃ 以上， SPIGA-GCO 、WPIGA-GCOH 和SCGA-GCO 分別在107.60、108.33、103.93 ℃有明顯的吸熱峰，而3 種壁材分別在112.12、110.21、109.46 ℃達(dá)到熱變性溫度，三者變化趨勢相似，峰位略有移動。

3 討論

本研究提出了綠咖啡油與3 種蛋白質(zhì)和阿拉伯膠復(fù)聚物作為微膠囊載體的結(jié)合條件。

3.1 復(fù)聚物最佳pH 和壁材比研究

3種蛋白質(zhì)與阿拉伯膠體系濁度均隨pH 的減小呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)pH 下降至3.0～4.0時(shí)，濁度急速上升至峰值，濁度跨越峰值后迅速進(jìn)入較為遲緩的下降階段。主要是由于隨著靜電相互作用的增強(qiáng)，先前形成的可溶性復(fù)合物發(fā)生了結(jié)構(gòu)間的重排，從而形成某種相對緊密的結(jié)構(gòu)。復(fù)聚物濁度的峰值還意味著不同蛋白質(zhì)與阿拉伯膠間的靜電相互作用達(dá)到了最大值，此刻發(fā)生相分離，具備了形成微膠囊的可能性[21]。濁度跨越峰值后迅速進(jìn)入下降階段，這可能是由于不可溶性復(fù)合物基本消失，體系過渡到可溶性復(fù)合物的解體過程中，發(fā)生“破乳”現(xiàn)象。不同蛋白質(zhì)與阿拉伯膠混合比例的不同，其濁度曲線也存在較大差異，說明pH 和壁材質(zhì)量比都極大地影響了蛋白質(zhì)和多糖的相互作用以及微膠囊的形成?；陟o電相互作用最大即等同于濁度最大的原理，各曲線濁度最大點(diǎn)均為各比例下的靜電中和點(diǎn)[22]，達(dá)到該點(diǎn)可使壁材最大程度被利用。本研究結(jié)果與賈聰?shù)萚23]和夏慧亭等[24]的報(bào)道一致，酪蛋白酸鈉和阿拉伯膠的最適pH 與劉春花等[25]的研究結(jié)果略有不同，可能是由于在制備蛋白儲備液時(shí)，鹽離子使得后續(xù)復(fù)合物體系發(fā)生改變，最佳條件也會發(fā)生細(xì)微影響。

3.2 蛋白質(zhì)與阿拉伯膠制備復(fù)聚物的結(jié)構(gòu)表征

3.2.1 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析 紅外光譜是生物聚合物結(jié)構(gòu)分析的有力工具，可提供蛋白質(zhì)和阿拉伯膠復(fù)雜凝聚過程中相互作用的信息[26]。本研究通過FT-IR 掃描圖譜和熒光共定位分析證實(shí)了蛋白質(zhì)與阿拉伯膠之間存在靜電相互作用，獲得了穩(wěn)定、表觀完整的復(fù)聚物，為后續(xù)的綠咖啡油包埋工作奠定了基礎(chǔ)。SPI、WPI 和SC 吸收帶在復(fù)聚物中發(fā)生偏移，表明SPI、WPI和SC 中的O-H 基團(tuán)與阿拉伯膠中的C=O 基團(tuán)之間形成了氫鍵[27]。3 種蛋白質(zhì)與阿拉伯膠形成復(fù)聚物，單一組分的壁材在形成復(fù)聚物后在酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的吸收峰分別有偏移，說明蛋白質(zhì)的氨基與阿拉伯膠的羧基確實(shí)發(fā)生靜電相互作用。QIU等[28] 通過紅外光譜發(fā)現(xiàn)綠豆蛋白吸收峰從3294.01 cm-1 移動到綠豆蛋白和杏皮果膠復(fù)聚物中的3293.46 cm?1 處，表明綠豆蛋白與杏皮果膠之間發(fā)生靜電相互作用，與本研究結(jié)論一致。

3.2.2 掃描電鏡（SEM）分析 SEM 下未加入綠咖啡油的干燥凝聚物微粒表面較為完整，無明顯裂縫。說明SPI、WPI、SC 與阿拉伯膠相互作用，構(gòu)建了致密性良好的壁材體系，促進(jìn)微膠囊的形成[17]。碳水化合物的添加使得壁材體系在結(jié)構(gòu)形態(tài)上更加穩(wěn)定，對于芯材的保護(hù)和避免氧化，提高微膠囊穩(wěn)定性至關(guān)重要。本研究復(fù)聚物形態(tài)結(jié)果與CHARLES 等[29]的研究結(jié)果一致，后者發(fā)現(xiàn)以麥芽糊精和乳清分離蛋白制備的復(fù)聚物其結(jié)構(gòu)不規(guī)則，缺乏正常的球形，呈現(xiàn)高度多孔。

3.2.3 激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）分析CLSM 下3 種復(fù)聚物大小不規(guī)則，凹陷較少且熒光分布均勻，這可能是因?yàn)樘妓衔锝M成的壁材體系具有更高的分子柔性，表現(xiàn)出更多的分子構(gòu)型，導(dǎo)致成膜均勻[18]，提高微膠囊穩(wěn)定性。DUHORANIMANA 等[16]研究表明，蛋白多糖復(fù)合凝聚的膠囊壁外部界面上高密度的明膠分子有利于保護(hù)芯材。CLSM 分析發(fā)現(xiàn)，3 種蛋白質(zhì)和阿拉伯膠在復(fù)聚物內(nèi)均勻分布，構(gòu)成穩(wěn)定的骨架，可賦予微膠囊壁一定的機(jī)械強(qiáng)度和致密性，對提高微膠囊的氧化穩(wěn)定性有重要作用。

3.2.4 共定位分析 不同蛋白和阿拉伯膠復(fù)合凝聚后具有良好的相關(guān)性，其中WPIGA 相關(guān)性最強(qiáng)，說明乳清分離蛋白與阿拉伯膠之間有較強(qiáng)的靜電相互作用。本研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)和多糖在顆粒內(nèi)部均勻分布，構(gòu)成高穩(wěn)定性的骨架，共定位分析也顯示蛋白與多糖分布相似，重合率達(dá)到70%以上，與ZHANG 等[30]的研究結(jié)果類似。

3.3 蛋白質(zhì)與阿拉伯膠制備微膠囊的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及性能特點(diǎn)

3.3.1 理化性質(zhì) 不同壁材對微膠囊的產(chǎn)率有顯著影響，本研究結(jié)果與肖軍霞等[31]以大豆分離蛋白阿拉伯膠為壁材包埋甜橙油的結(jié)果一致。包埋率用來評價(jià)粉末狀微膠囊內(nèi)油脂的保護(hù)程度，是微膠囊粉末的重要特征。ILYASOGLU 等[32]通過冷凍干燥獲得的魚油微膠囊包埋率為29.40%～81.60%。與本研究所得包埋率相似，說明3 種壁材均有效包埋綠咖啡油。SHAO 等[26]以麥芽糖糊精-蛋白為壁材制備靈芝多糖微膠囊，與大豆分離蛋白和酪蛋白酸鈉相比，乳清蛋白和麥芽糖糊精絡(luò)合制備的微膠囊包埋率達(dá)到89.80%，說明適當(dāng)添加蛋白可改善麥芽糊精的性能，提高包封效率。由此可知，壁材的選擇也可改變微膠囊包埋率，且與壁材的種類無線性關(guān)系。表面油（SO）表示存在于微膠囊表面未被包埋的綠咖啡油，易發(fā)生氧化變質(zhì)，從而降低功能成分的保質(zhì)期[33]，是導(dǎo)致包埋率較低的主要因素之一。因此應(yīng)盡量減少脂質(zhì)封裝中的表面油量。WPIGA-GCO 的SO 較高，對應(yīng)包埋率較低。SCGA-GCO 的SO 含量為最高，但包埋率較低，由此可知，盡管粉末中的高含油量是理想的，但相對較高的包埋率也可能導(dǎo)致芯材損失[34]，因此還需最大限度保護(hù)油的同時(shí)減少表面油含量。

3.3.2 粒徑 粒徑大小是微膠囊應(yīng)用于食品基質(zhì)的一個主要特征。壁材種類對綠咖啡油微膠囊平均粒徑有顯著影響，本研究表明WPIGA-GCO 的粒徑最大，可能是由于WPI 的乳化和成膜能力在干燥過程中誘導(dǎo)微膠囊膨脹或膨化，通過增加封閉空氣含量來增加粒徑尺寸。這一結(jié)果與石澤棟等[10]對牛至精油微膠囊化的結(jié)果相似，其微膠囊平均粒徑為147.00 μm。

3.3.3 FT-IR FT-IR 是生物大分子及其聚合物結(jié)構(gòu)分析的有力工具，通過FI-TR 掃描分析，可以顯示各物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和特征化學(xué)鍵[35]，可以證明微膠囊的形成以及物質(zhì)之間是否存在相互作用。綠咖啡油微膠囊的紅外光譜顯示，綠咖啡油具有強(qiáng)烈的疏水性[36]，壁材和芯材之間發(fā)生氫鍵效應(yīng)，對應(yīng)酯的存在[28]，綠咖啡油成功包埋于3種復(fù)聚物中，且與壁材未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

3.3.4 微觀結(jié)構(gòu) SEM 顯示3 種微膠囊粉末微觀結(jié)構(gòu)，顯示微粒表面無裂紋或裂縫的跡象，但是不同微膠囊截面存在相似的微腔和孔隙，可能是由于乳狀液在冷凍過程中形成較小的冰晶，且在冷凍干燥過程中升華，從而形成多孔結(jié)構(gòu)。YANG等[37]研究解釋了微膠囊表面光滑是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)構(gòu)象會隨著蛋白質(zhì)與不同材料的相互作用而改變，趨向于更有利的相互作用，如通過靜電相互作用能夠穩(wěn)定復(fù)合物和降低系統(tǒng)的表面張力。本研究結(jié)果顯示，3 種配方制備的綠咖啡油微膠囊壁結(jié)構(gòu)相對完整，由此可推斷微膠囊對芯材具有良好的保護(hù)作用。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其表面油含量和包埋率的測定結(jié)果一致，以SPI 和阿拉伯膠為壁材制備的綠咖啡油微膠囊表面最平整光滑，其表面油含量最低，包埋率最好。SEM 顯示了綠咖啡油微膠囊的表觀形態(tài)，但不能直觀地觀察到微膠囊的油滴分布，因此，使用多重標(biāo)記的CLSM觀察3 種綠咖啡油微膠囊中油滴分布，CLSM 圖像證實(shí)了綠咖啡油已成功包埋在3 種復(fù)合壁材中，且印證了SEM 圖像的觀察結(jié)果。這一結(jié)果進(jìn)一步說明SPIGA、WPIGA 和SCGA 可作為包埋綠咖啡油的微膠囊壁材。

3.3.5 XRD為了研究復(fù)合壁材和綠咖啡油微膠囊的晶體結(jié)構(gòu)及其結(jié)晶度進(jìn)行了XRD 測定。一般來說，晶體材料的峰較尖，而非晶材料的峰較寬。本研究顯示，芯材和壁材之間具有高度相容性，且包埋后不會在很大程度上破壞壁材的無定形結(jié)構(gòu)，說明綠咖啡油微膠囊已經(jīng)形成，與曹俊英等[38]的研究結(jié)果一致。一般來說，無定形壁材比結(jié)晶壁材具有更強(qiáng)的吸濕性和水溶性，因此在貯藏過程中會吸附更多的水，并通過微觀結(jié)構(gòu)的破壞、營養(yǎng)物質(zhì)的降解和微生物的不穩(wěn)定性降低了微膠囊的貯藏穩(wěn)定性。為了研究綠咖啡油微膠囊的穩(wěn)定性，計(jì)算了微膠囊的結(jié)晶度。本研究中SPIGA-GCO、WPIGA-GCO 和SCGA-GCO 3 種微膠囊的相對結(jié)晶度分別為45.99%、46.37%和42.23%，表明該晶體結(jié)構(gòu)是理想的，所得結(jié)果與ALI 等[18]報(bào)道苦參提取物微膠囊的相對結(jié)晶度（34.03%～46.52%）類似。其中WPIGA-GCO 顯示出很小的結(jié)晶傾向，與其他壁材相比具有較高的相對結(jié)晶度，可能是由于分子間相互作用，結(jié)晶度和游離體積均會影響勢壘的滲透率，具有相對較好的貯藏穩(wěn)定性。

3.3.6 熱性能 采用DSC 測定樣品在控溫過程中吸收或釋放的熱量，以評價(jià)樣品的熱力學(xué)性質(zhì)。在DSC 測量中，熱分析譜上的吸熱峰代表了試樣的熱變性溫度區(qū)，該峰值對應(yīng)的溫度即為熱變性溫度（玻璃化轉(zhuǎn)變溫度），樣品的變性溫度越高，熱穩(wěn)定性越高[39]。本研究中，3 種綠咖啡油微膠囊的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度均在100 ℃以上，說明微膠囊化對綠咖啡油具有良好的保護(hù)作用。SPIGA-GCO、WPIGA-GCOH 和SCGA-GCO 出現(xiàn)明顯的吸熱峰與達(dá)到熱變性溫度時(shí)二者趨勢相似，峰位略有移動，其原因可能是2 種體系的孔隙率和微觀結(jié)構(gòu)的差異。BURHAN 等[39]制備的肉桂精油納米微膠囊具有較高的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)高熱穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)和多糖分子間的相互作用有關(guān)，與本研究結(jié)果相似。

綜上，微膠囊實(shí)驗(yàn)表明，不同蛋白質(zhì)與阿拉伯膠的組合對微膠囊的粒徑和包埋率有顯著影響；通過傅里葉紅外光譜發(fā)現(xiàn)壁材和芯材之間存在較強(qiáng)的氫鍵效應(yīng)；SEM 和CLSM 表征結(jié)果證明綠咖啡油最終包埋在3 種壁材中；XRD 圖譜表明3 種微膠囊具有無定形結(jié)構(gòu)，且綠咖啡油的嵌入對微膠囊的結(jié)晶狀態(tài)無顯著影響；通過DSC 對不同蛋白質(zhì)與阿拉伯膠形成的復(fù)聚物熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析，得出其微膠囊產(chǎn)品性質(zhì)比較穩(wěn)定，整體結(jié)構(gòu)完整，表明3 種復(fù)合壁材可對綠咖啡油有良好的保護(hù)作用。其中SPIGA-GCO 的產(chǎn)率最高（86.40%）、粒徑最?。?7.60 μm）、包封率最大（69.26%）、油滴能夠均勻嵌入壁材并具有更好的熱穩(wěn)定性（107.60 ℃），表明用大豆分離蛋白和阿拉伯膠對綠咖啡油包埋效果更優(yōu)，更有利于綠咖啡油的儲存和使用。以3 種疏水蛋白質(zhì)與阿拉伯膠為壁材，通過復(fù)合凝聚法制備綠咖啡油微膠囊具有可行性，所制備的綠咖啡油微膠囊表現(xiàn)出優(yōu)良的熱穩(wěn)定性，為綠咖啡油在食品領(lǐng)域的深加工利用提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。