農(nóng)倩　謝金蘭　林麗　莫璋紅　王澤平　宋修鵬　李長寧

關(guān)鍵詞：甘蔗；脫落酸；干旱脅迫；生理特征；基因表達(dá)

中圖分類號：S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

甘蔗是世界上重要的糖料作物，生長周期長、需水量大。但我國80%以上的甘蔗種植在丘陵旱坡地上，季節(jié)性干旱頻繁，已成為影響甘蔗糖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。植物能通過感受刺激和信號傳導(dǎo)，啟動各種生理生化反應(yīng)響應(yīng)水分脅迫。干旱脅迫下，植物葉片氣孔導(dǎo)度、葉綠素合成及電子傳遞會受到抑制，導(dǎo)致光合作用效率降低[1] 。干旱脅迫還導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species， ROS）大量積累，致使細(xì)胞發(fā)生膜脂過氧化作用和膜系統(tǒng)變性[2]。為此，植物抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶類如超氧化物歧化酶（ superoxide dismutase， SOD ）、過氧化物酶（peroxidase， POD）、過氧化氫酶（catalase， CAT）等的活性顯著增強(qiáng)，非酶類抗氧劑如谷胱甘肽、類黃酮、酚類、類胡蘿卜素等的含量顯著提高，以清除過量ROS 積累帶來的損害[3]。脯氨酸（proline，Pro）作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對干旱脅迫下植物細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)維持具有重要作用[4]。研究表明， 植物激素尤其是脫落酸（abscisic acid，ABA）在響應(yīng)水分脅迫中扮演重要角色[5-7]。干旱脅迫下，植物合成大量ABA，促使葉片氣孔關(guān)閉以減少水分散失，促進(jìn)根系吸收水分，調(diào)節(jié)ABA響應(yīng)基因并改變基因表達(dá)模式，增強(qiáng)植株抵抗逆境的能力[8-9]。研究顯示，植物對干旱脅迫響應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因中，約10%的基因受ABA 調(diào)控[10-11]。

干旱脅迫會干擾內(nèi)源激素平衡從而阻礙植物的正常生長發(fā)育，通常情況下植物能通過自身的調(diào)節(jié)機(jī)制減輕外界脅迫帶來的影響。但這種機(jī)制具有滯后性，往往不能滿足植物對外界環(huán)境變化的要求而使植物受損害，特別在一些抗脅迫能力弱的作物品種上表現(xiàn)得尤為突出。外源植物生長調(diào)節(jié)劑能在一定程度上彌補(bǔ)上述調(diào)節(jié)機(jī)制的缺陷，從而提高植物耐受脅迫的能力[12-14]。研究證實(shí)，干旱脅迫下外施ABA 后，植物可溶性糖和Pro 等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量上升，細(xì)胞滲透勢下降，保水能力增強(qiáng)，有利于根系吸收水分和降低膜脂過氧化程度，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性[5， 7]。ABA預(yù)處理可以增強(qiáng)植物在應(yīng)對干旱[13]、低溫[14]、鹽害[15]、重金屬[16]脅迫條件下的抗氧化防護(hù)能力。甘蔗生長期長達(dá)12～18 個(gè)月，受季節(jié)性干旱威脅嚴(yán)重，若甘蔗苗期發(fā)生旱情，則會直接影響后續(xù)分蘗和伸長，導(dǎo)致減產(chǎn)。本研究擬在干旱脅迫下，分析外源ABA 對苗期甘蔗生理特性和抗氧化酶編碼基因表達(dá)的影響，探討外源ABA 提高甘蔗幼苗抗旱性的生理生化機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗品種為‘桂糖42 號（GT42），采用桶栽土培方式，塑料桶規(guī)格為直徑32 cm×高35 cm，每桶裝土18.5 kg（ 粘壤土， 土壤最大持水量41.6%，有機(jī)質(zhì)含量18.7 g/kg，全氮含量85.6 g/kg，有效氮含量89.4 mg/kg，有效磷含量63.2 mg/kg，有效鉀含量98.4 mg/kg，pH 5.8），桶底鉆孔以增強(qiáng)透氣性。單芽蔗種用甲基托布津浸種，于泥沙混合培養(yǎng)基質(zhì)上先育苗，30 d 后，選取生長一致的甘蔗苗移栽至桶中，每桶2 株，將桶置于智能溫室，按照日常管理。待植株生長至5～7 片完全葉時(shí)，設(shè)CK（正常淋水）、CK+ABA、干旱、干旱+ABA 共4 組處理。在進(jìn)行干旱脅迫前連續(xù)2 d葉面噴施濃度為15 μmol/L 的ABA 溶液，程度為葉面濕透無滴水，其余2 組噴清水作對照，每個(gè)處理10 桶，3 次重復(fù)。正常淋水和干旱處理土壤含水量分別為最大持水量的60%～70% 、30%～40%，采用稱重法進(jìn)行控水。干旱處理開始后每隔3 d 和6 d 分別測定+1 葉的相對含水量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)。在干旱處理后18 d，測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)后，采集相應(yīng)+1 葉樣品，液氮速凍后，放入–80 ℃冰箱保存待用。

1.2 方法

1.2.1 生理生化指標(biāo)測定 采用飽和含水量法測定葉片相對含水量[17]；葉綠素、脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）和過氧化氫（H2O2）含量分別按照孫哲等[18]、BATES 等[19]、HEALTH 等[20]和JALEEL 等[21]的方法進(jìn)行測定；使用羥胺氧化法測定超氧陰離子自由基（O2–）產(chǎn)生速率[22]；按照IRITI 等[23]的方法測定脫落酸（ABA）和生長素（IAA）含量；使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司商品化試劑盒測定過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbateperoxidase， APX）、過氧化物酶（POD）的活性，操作步驟按說明書。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 選取長勢一致植株的+1 葉， 使用FMS-2 脈沖調(diào)制式熒光儀（hansatech， UK）測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。將葉片充分暗適應(yīng)后，先打開測量光測定最小熒光Fo，后打開飽和脈沖光測定最大熒光Fm，再啟動1000 μmol/（m2·s）的作用光，每隔20 s 測定一次光下的熒光參數(shù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，描繪光系統(tǒng)II的實(shí)際光化學(xué)效率ΦPSII 啟動變化曲線。

1.2.3 基因表達(dá)量測定 以甘蔗GAPDH 為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異引物（表1），測定抗氧化酶CAT、SOD、APX、POD 編碼基因、ABA 合成限速酶9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）編碼基因、脯氨酸合成關(guān)鍵酶△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）編碼基因相比對照的表達(dá)量變化。采用TRIzol （Invitrogen）試劑提取葉片總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行基因表達(dá)量測定。反應(yīng)體系為：10 μL 2×All-in-One qPCR Mix （Gene Copoeia）、2 μL cDNA、4 μmol/L 的正反向引物各1、6 μL雙蒸水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 個(gè)循環(huán)。經(jīng)熔解曲線檢驗(yàn)后采用2–ΔΔCT 法進(jìn)行表達(dá)量計(jì)算[24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用DPS 軟件以Duncans 新復(fù)極差法（P≤0.05）進(jìn)行各處理平均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片相對含水量（RWC）變化

干旱脅迫顯著降低了甘蔗葉片相對含水量（圖1）。在處理的第3、6、9、12、15、18 天，分別比對照減少2.7%、9.0%、15.1%、22.5%、26.4和31.6%，降幅隨干旱時(shí)間延長而增大。干旱+ABA 處理能夠提高葉片相對含水量，分別比同期干旱處理增加了1.3%、4.0%、7.1%、11.1%、11.6%和14.6%，增幅逐漸變大。正常淋水條件下噴施ABA 處理（CK+ABA）的葉片相對含水量與對照間差異不顯著。

2.2 ABA和IAA含量變化

干旱、干旱+ABA 處理的ABA 含量均顯著高于對照，但增量不同（圖2A）。處理18 d 時(shí)，干旱處理的ABA 含量比對照增加75.2%，而干旱+ABA 處理比對照增加125.1%，干旱+ABA 處理比干旱處理增加了28.5%，差異顯著。相比對照，干旱、干旱+ABA 處理均提高了甘蔗葉片的IAA含量（圖2B），處理18 d 時(shí)，分別比對照提高了19.9%和18.2%，差異顯著，但干旱、干旱+ABA處理間的IAA 含量差異不顯著。

2.3 Pro和MDA含量變化

干旱脅迫使甘蔗葉片Pro 含量顯著高于對照，而干旱+ABA 處理可進(jìn)一步提高葉片Pro 含量，脅迫18 d 時(shí)干旱+ABA 處理的Pro 含量比干旱處理增加了23.2%，差異顯著，而CK+ABA 處理和對照間的Pro 含量差異不顯著（圖2C）。干旱處理提高了甘蔗葉片MDA 含量，在處理后18 d 比對照提高了68.7%，差異顯著。干旱+ABA 處理的MDA 含量比對照提高了34.1%，但比干旱處理降低20.5%，差異顯著（圖2D）。正常淋水條件下噴施ABA 處理（CK+ABA）的葉片MDA 含量與對照差異不顯著。

2.4 葉綠素含量變化

干旱脅迫顯著降低了葉綠素a 和葉綠素b 的含量，而干旱+ABA 處理能夠顯著緩解葉綠素的降解，脅迫18 d 時(shí)干旱+ABA 處理的葉綠素a 和葉綠素b 含量分別比干旱處理增加19.7%和25.5%。CK+ABA 處理的葉綠素含量與對照間差異不顯著（圖2E、圖2F）。

2.5 光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H量子效率（ΦPSⅡ）變化過程

由圖3 可知，干旱處理降低了葉片光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H量子效率ΦPSⅡ，破壞程度隨著干旱脅迫時(shí)間延長而加重，干旱+ABA 處理能減輕這種破壞作用，使光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H量子效率ΦPSII 始終高于干旱處理。CK+ABA 處理和CK 間的光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H量子效率差異不顯著。

2.6 活性氧（ROS）含量變化

干旱、干旱+ABA 處理的ROS 含量均顯著高于對照（圖4）。處理18 d 時(shí)，干旱處理的O₂^–產(chǎn)生速率比對照增加73.4%，而干旱+ABA 處理比對照增加44.8%，后者比前者降低16.5%，差異顯著（圖4A）。干旱、干旱+ABA 處理均顯著提高甘蔗葉片H₂O₂含量，處理18 d 時(shí)，分別比對照提高82.3%和38.7%，但后者H₂O₂含量比前者降低了23.9%（圖4B），差異顯著。

2.7 抗氧化酶活性變化

干旱脅迫處理18 d 時(shí)，甘蔗葉片CAT、SOD、APX、POD 的活性分別比對照提高52.1%、23.9%、40.1%和12.2%，而干旱+ABA 處理分別比對照提高113.6%、41.4%、43.7%和38.8%，差異顯著（圖5）。同時(shí)期干旱+ABA 的相關(guān)抗氧化酶活性比干旱處理分別增加40.5%、14.1%、2.5%和23.7%，除APX 外，活性均比干旱處理顯著增加（圖5）。

2.8 基因表達(dá)量的變化

由圖6 可知，處理18 d 時(shí)，正常淋水條件下噴施ABA 處理（CK+ABA）對甘蔗葉片抗氧化酶CAT、SOD、APX、POD 編碼基因、NCED1 基因、P5CS 基因的表達(dá)量影響不顯著。除CAT3 和APX1外，干旱脅迫提高了相關(guān)編碼基因的表達(dá)量，其中NCED1、P5CS1、P5CS2、CAT1、CAT2、SOD1、SOD2、APX2、APX3、POD1 和POD2 的表達(dá)量分別是對照的3.38 倍、2.21 倍、2.32 倍、1.67 倍、1.42 倍、2.33 倍、2.17 倍、1.55 倍、1.37倍、1.56 倍和1.49 倍，差異顯著。相比干旱處理，干旱+ABA 處理的NCED1、CAT2、CAT3、SOD2、APX1、APX2 和POD1 的表達(dá)量分別提高了58.3%、54.2%、57.7%、70.1%、16.9、26.5%和37.2%，差異顯著。

3 討論

干旱脅迫條件下，植物內(nèi)源ABA 的積累會促進(jìn)葉片氣孔關(guān)閉，減少水分蒸發(fā)，提高葉片相對含水量[8-9， 25]。本研究中，隨著脅迫加劇，干旱+ABA 處理甘蔗的葉片相對含水量比干旱處理顯著增加，表明ABA 處理能提高干旱條件下甘蔗葉片的保水能力。研究表明，干旱脅迫會顯著提高植物內(nèi)源ABA 含量，而脅迫下外源ABA 處理能夠進(jìn)一步促進(jìn)ABA 的合成和積累，使其含量處于更高水平[25-26]。本研究結(jié)果顯示，干旱處理18 d時(shí)甘蔗葉片ABA 含量比對照顯著增加，而干旱+ABA 處理的增幅又顯著高于干旱處理，與前人研究結(jié)果一致。研究顯示，9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxy carotenoid dioxygenase，NCED）催化類胡蘿卜素氧化裂解生成黃質(zhì)醛，是植物內(nèi)源ABA 生物合成途徑最重要的限速步驟，NCED 基因表達(dá)可被非生物脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，表達(dá)量與ABA 含量有著協(xié)同效應(yīng)[22]。本研究結(jié)果表明，干旱處理18 d 時(shí)NCED1 表達(dá)量為對照的3.38 倍，而干旱+ABA 又比干旱處理提高了58.3%，與ABA 含量變化一致。研究表明，ABA對植物眾多生理生化途徑的調(diào)控作用與其他內(nèi)源激素代謝密切相關(guān)[25-27]。本研究顯示，干旱脅迫下甘蔗葉片IAA 含量隨著ABA 含量顯著上升，但干旱+ABA 處理的IAA 含量與干旱處理間無顯著差異，顯示了ABA 和IAA 在響應(yīng)逆境脅迫時(shí)的重要聯(lián)系，但還需進(jìn)一步研究才能明確這2 種激素的相互調(diào)控作用。

植物生長代謝過程中ROS 的產(chǎn)生不可避免，自穩(wěn)態(tài)水平的ROS 在植物正常生長發(fā)育及應(yīng)對環(huán)境脅迫中起著重要作用，干旱脅迫常導(dǎo)致植物細(xì)胞ROS 含量急劇上升[28]。本研究結(jié)果顯示，干旱處理18 d 時(shí)甘蔗葉片的O₂^–產(chǎn)生速率和H₂O₂含量分別比對照顯著增加73.4%和82.3%，表明此時(shí)植物抗氧化防護(hù)系統(tǒng)已無法及時(shí)清除過量的ROS 而導(dǎo)致其積累。過量的ROS 積累打破了植物體內(nèi)的氧化還原平衡，引起膜質(zhì)過氧化作用，膜脂中不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)生MDA，導(dǎo)致膜系統(tǒng)被破壞，MDA 含量高低反映了膜脂過氧化程度[25， 29]。前人研究表明，逆境脅迫下外源ABA 處理可以誘導(dǎo)植物抗氧化酶基因的表達(dá)，提高相關(guān)抗氧化酶的活性[30-32]。本研究結(jié)果表明，同時(shí)期干旱+ABA處理的CAT、SOD、POD 活性均比干旱處理顯著提高，同時(shí)CAT2、CAT3、SOD2、APX1、APX2和POD1 基因的表達(dá)量也比干旱處理顯著增加。相關(guān)抗氧化酶活性的提高，增強(qiáng)了植物清除過量ROS 的能力，降低膜脂過氧化程度，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整性。本研究結(jié)果表明，干旱+ABA 處理的ROS 和MDA 含量雖比對照顯著增加，但仍然顯著低于干旱處理，證實(shí)外施ABA 處理能有效緩解干旱脅迫對膜系統(tǒng)的損害。研究表明，Pro 作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，干旱脅迫下Pro 含量增加有利于維持滲透調(diào)節(jié)，增強(qiáng)細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性及過量ROS 的清除[4， 33]。本研究中，干旱、干旱+ABA 處理的Pro 含量均比對照顯著性增加，但干旱+ABA 處理的增量水平高于單純干旱處理，說明ABA 處理能進(jìn)一步加強(qiáng)干旱脅迫下Pro 的生物合成，將有助于增強(qiáng)葉片保水能力，提高葉片相對含水量。干旱、干旱+ABA 處理Pro 合成關(guān)鍵調(diào)控酶基因P5CS1 和P5CS2 的表達(dá)量比對照顯著提高，與Pro 含量變化一致。但這2 個(gè)基因的表達(dá)變化在上述兩處理間差異不顯著，與Pro 含量變化不一致，這可能與基因的轉(zhuǎn)錄后修飾有關(guān)，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

光合作用是作物生長和產(chǎn)量形成的重要代謝過程，干旱脅迫會導(dǎo)致植物葉綠體膨脹，順序排列紊亂，基質(zhì)片層模糊，基粒間連接松弛，類囊體層腫脹或解體，致使葉綠素含量下降，過量的ROS 積累還會破壞光合器官的超微結(jié)構(gòu)，影響光合作用過程[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱處理使甘蔗葉綠素含量顯著降低，而噴施外源ABA 處理能夠減緩干旱條件下葉綠素的降解程度，與前人的研究結(jié)果一致[18， 35]。干旱脅迫下外源ABA 處理提高了相關(guān)抗氧化酶的活性，增強(qiáng)了過量ROS 的清除能力，減輕了ROS 的積累對光合作用系統(tǒng)造成的傷害，此外，干旱+ABA 處理Pro 含量顯著提高，葉片保水能力顯著增強(qiáng)，可能是該處理甘蔗葉綠素含量、光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H量子效率（ΦPSⅡ）始終高于干旱處理的重要原因。