宋國紅,劉松濤,李林蔚,劉飛,張峰*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所,江蘇 南京 210014)

灰霉病是世界第二大真菌性病害,對作物產(chǎn)量造成了巨大損失[1],其病原菌灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea,簡稱灰霉菌)是一種死體營養(yǎng)型、廣寄主性的絲狀子囊真菌,可侵染蔬菜、果樹和花卉等200多種作物,如番茄和草莓,引起番茄灰霉病和草莓灰霉病[2-4]。生產(chǎn)上對灰霉菌的防治以化學(xué)防治為主,目前常用的化學(xué)藥劑主要有苯并咪唑類、氨基甲酸酯類、二甲酰亞胺類和苯胺類等,然而長期單一地使用某一類化學(xué)藥劑不僅會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性,而且會造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染[5-6]。因此,急需開發(fā)新型作用機制的化合物來解決以上問題。

肌球蛋白(Myosin)屬細胞骨架蛋白,在肌動蛋白絲上利用ATP水解產(chǎn)生的能量來轉(zhuǎn)運肌動蛋白絲并產(chǎn)生力量[7]。肌球蛋白在真核生物的多種生命過程中如胞質(zhì)分裂、內(nèi)吞作用、細胞形狀維持、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、胞內(nèi)運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要作用[8-10]。肌球蛋白主要由三部分結(jié)構(gòu)域組成:氨基端的馬達結(jié)構(gòu)域(頭部結(jié)構(gòu)域)、頸部結(jié)構(gòu)域、可變的羧基端尾部結(jié)構(gòu)域,其中氨基端的馬達結(jié)構(gòu)域是最保守的,具有ATPase活性[11]。

氰烯菌酯(2-氰基-3-氨基-3-苯基丙烯酸乙酯)是一種新型2-氰基丙烯酸酯類殺菌劑,其作用靶標(biāo)是Ⅰ型肌球蛋白(MyosinⅠ),主要用以防治禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌等引起的小麥赤霉病和水稻惡苗病,對其他病原菌如稻瘟病菌、灰霉菌和小麥白粉病菌等抑制作用較弱或幾乎沒有抑制作用[12-15]。本實驗室前期在氰烯菌酯化合物結(jié)構(gòu)骨架基礎(chǔ)上設(shè)計合成一批化合物,但這些化合物是否會對灰霉菌肌球蛋白具有抑制活性尚不清楚。

在本試驗中,我們利用SF9昆蟲細胞蛋白表達系統(tǒng)成功表達純化出具有活性的BcMyosinⅠ單體蛋白;從實驗室化合物庫中成功篩選出B1和B17兩個對灰霉菌肌球蛋白具有抑制活性的化合物。本文通過真核表達系統(tǒng)對BcMyosinⅠ蛋白進行體外表達和純化,并發(fā)現(xiàn)2個灰霉菌肌球蛋白抑制劑,未來可在B1和B17化合物結(jié)構(gòu)骨架基礎(chǔ)上優(yōu)化設(shè)計更高活性的肌球蛋白抑制劑,期望為灰霉病的綠色防控提供全新的解決方案,并延緩灰霉菌抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展速度。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株、載體及細胞灰霉菌B05.10菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院周明國教授惠贈。DH5α菌株、DH10Bac菌株、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)SF9細胞和桿狀病毒表達載體pFastBac由農(nóng)藥靶標(biāo)生物學(xué)實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器2×TaqMaster Mix酶、2×Vazyme Lamp Master Mix和反轉(zhuǎn)錄酶均購自南京諾唯贊生物技術(shù)公司;氨芐青霉素鈉和RNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司;高保真酶2×FastPfu Premix、ToloPrep 柱式DNA膠回收試劑盒、ToloPrep 柱式質(zhì)粒提取試劑盒、核酸染料ToLo Safered Nucleic Acid Stain、T4DNA連接酶、同源重組酶2×Ezmax-single CloneMix Plus和GoldBand 5000 DNA Marker均購自吐露港生物技術(shù)公司;限制性內(nèi)切酶購于大連寶生物工程(TaKaRa)有限公司;SF9昆蟲細胞培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染試劑Sinofection購自北京義翹神州科技股份有限公司;His抗體購自賽默飛有限公司;PMSF蛋白酶抑制劑購自源葉生物;ADP-GloTMKinase Assay試劑盒購自北京普洛麥格生物產(chǎn)品(Promega)有限公司;104μg·mL-1氰烯菌酯由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院周明國教授惠贈。Heal Force Trident 960 PCR儀;Cytiva AKTA pure 25 蛋白純化儀;Vilber FUSION FX7 RGB SPECTRA生物大分子分析儀;Molecular Devices多功能酶標(biāo)儀SpectraMax M5。

1.2 方法

1.2.1 蛋白序列分析用Uniprot在線網(wǎng)站(https://www.uniprot.org/)搜索BcMyosinⅠ信息(Gene ID:BC1G_10821),利用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和ESPript(https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)在線網(wǎng)站與已解析的禾谷鐮刀菌MyosinⅠ(FgMyosinⅠ)氨基酸序列進行同源性比對,選取合適的蛋白表達長度。

1.2.2 載體構(gòu)建以灰霉菌cDNA為模板,設(shè)計引物對A1/A2擴增BcMyosinⅠ(1-737)片段,用EcoRⅠ和NheⅠ雙酶切pFastBac質(zhì)粒,膠回收試劑盒分別回收片段和酶切質(zhì)粒,同源重組酶連接目的片段和酶切質(zhì)粒,連接產(chǎn)物進行DH5α轉(zhuǎn)化,挑取單克隆菌落進行PCR驗證并送通用生物有限公司測序;以灰霉菌cDNA為模板,設(shè)計引物對A3/A4擴增BcCaM(1-149)片段,用EcoRⅠ和Hind Ⅲ分別雙酶切pFastBac質(zhì)粒和片段,用T4DNA連接酶連接產(chǎn)物和片段,進行DH5α轉(zhuǎn)化并挑單克隆送公司測序。測序結(jié)果用BioEdit軟件查看。引物序列見表1。

1.2.3 病毒液制備與蛋白表達挑選測序正確的質(zhì)粒導(dǎo)入DH10Bac感受態(tài)細胞,挑選PCR驗證正確的轉(zhuǎn)化子,提取桿粒DNA,轉(zhuǎn)染SF9昆蟲細胞,27 ℃ 細胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)6 d,4 ℃、2 000 r·min-1離心20 min,上清液即為P1代病毒液。將P1代病毒液按1∶100的體積比加入對數(shù)生長期的SF9細胞,27 ℃、125 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d,離心收集的上清液即為P2代病毒液。按同樣的方法收集P3代病毒液。將P3代病毒液pFast-BcMyosinⅠ(1-737)-H8和pFast-BcCaM(1-149)-H6按照2∶1的體積比加入對數(shù)生長期的SF9細胞,27 ℃、125 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d,離心后棄上清液,收集下部細胞碎片。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.2.4 親和層析與凝膠過濾層析純化將菌體用裂解緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl,300 mmol·L-1NaCl,25 mmol·L-1咪唑,5 mmol·L-1ATP,0.5% Triton X-100,10% 甘油,pH8.5)重懸后超聲波破碎儀破碎至澄清透明狀,超高速離心后收集上清液。上清液與提前用裂解緩沖液處理后的Ni-NTA Beads孵育2 h,用蛋白緩沖液W1(50 mmol·L-1Tris-HCl,300 mmol·L-1NaCl,25 mmol·L-1咪唑,10% 甘油,pH8.5)洗去雜蛋白,用蛋白緩沖液W2(50 mmol·L-1Tris-HCl,300 mmol·L-1NaCl,75 mmol·L-1咪唑,10% 甘油,pH8.5)洗去雜蛋白,用洗脫緩沖液E(50 mmol·L-1Tris-HCl,300 mmol·L-1NaCl,250 mmol·L-1咪唑,10% 甘油,pH8.5)洗脫目的蛋白,將目的蛋白上樣于提前用凝膠過濾層析緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl,200 mmol·L-1NaCl,10% 甘油,pH8.5)平衡后的Superdex 200 Increase 10/300GL柱子進一步純化,判斷蛋白狀態(tài)。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡分析取純化后的目的蛋白洗脫液20 μL上樣于150 g·L-1蛋白凝膠,設(shè)置120 V、2 h進行SDS-PAGE。切取凝膠,設(shè)置200 mA、2 h轉(zhuǎn)移凝膠上的蛋白至PVDF膜,膜用5%脫脂奶粉封閉過夜,抗體孵育后進行顯色,生物大分子分析儀拍照記錄結(jié)果。

1.2.6 ATPase活性的測定ATPase活性測定使用ADP-GloTM激酶檢測試劑盒。在100 μL PCR管中先加入由40 mmol·L-1Tris(pH7.5)、20 mmol·L-1MgCl2和0.1 mg·mL-1BSA 配制成的1×激酶反應(yīng)緩沖液A,再依次加入20 μmol·L-1化合物(B1和B17)、0.5 μmol·L-1BcMyosinⅠ(1-737)、0.1 μmol·L-1BcCaM和0.5 mmol·L-1ATP,吸打混勻后室溫孵育30 min,此時體系為16 μL;加入16 μL ADP-GloTMreagent,吸打混勻后室溫繼續(xù)孵育40 min;加入32 μL激酶檢測緩沖液吸打混勻,室溫孵育40 min后完成反應(yīng)。吸取20 μL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至384孔白板內(nèi),放于酶標(biāo)儀下讀數(shù)并記錄試驗結(jié)果。每個處理重復(fù)3次,試驗獨立重復(fù)3次。

1.2.7 化合物對菌絲生長的抑制速率測定將化合物配制成終濃度為104μg·mL-1的母液,再用溶劑稀釋為20 mmol·L-1的次母液,按照次母液與PDA培養(yǎng)基1∶1 000體積比制成最終濃度為20 μmol·L-1的含藥培養(yǎng)基?；罨玫腂05.10菌株用無菌打孔器打取直徑5 mm的菌碟反向接種于含藥培養(yǎng)皿中央,25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗倒置培養(yǎng)2 d后用十字交叉法測量菌落生長直徑,計算菌絲生長抑制率。每個處理重復(fù)3次,試驗獨立重復(fù)3次。菌落生長直徑=菌落直徑-菌餅直徑。抑制率=(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100%。

1.2.8 同源模建預(yù)測BcMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)基于灰霉菌與禾谷鐮刀菌的MyosinⅠ馬達結(jié)構(gòu)域82.2% 的序列同源性,以解析的FgMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)為模板(PDB:6UI4),使用Discovery Studio 3.5軟件同源模建預(yù)測BcMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu),并用Pymol視圖軟件查看,用PROCHECK評價BcMyosinⅠ結(jié)構(gòu)的立體化學(xué)質(zhì)量。

1.2.9 分子對接用AutoDock-Vina軟件[16]和拉馬克遺傳算法(Lamarckian genetic algorithm,LGA),以半經(jīng)驗勢函數(shù)作為能量打分函數(shù)對小分子的構(gòu)象和位置進行全局搜索。計算過程中受體格點盒子為22 ?×22 ?×22 ?,格點間距為1 ?,格點盒子包圍住配體活性腔;能量評估和生成最大值分別設(shè)為250 000 和25 000;選擇均方根偏差(RMSD)作為評價標(biāo)準(zhǔn)(最大容忍范圍為1 ?)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白表達序列的選取

根據(jù)同源比對結(jié)果和蛋白結(jié)構(gòu)域信息,選擇保留氨基端全長的馬達結(jié)構(gòu)域和IQ1結(jié)構(gòu)域,即第1至第737位氨基酸(1-737)作為BcMyosinⅠ蛋白表達長度;選擇灰霉菌鈣調(diào)蛋白(BcCaM)的全長序列作為共同表達蛋白(圖1)。

圖1 BcMyosinⅠ蛋白和BcCaM蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.1 Schematic diagram of BcMyosinⅠprotein and BcCaM protein domains

2.2 pFast-BcMyosinⅠ(1-737)-H8和pFast-BcCaM(1-149)-H6載體的構(gòu)建

用引物對A1/A2和A3/A4分別擴增出2 211 bp的BcMyosinⅠ(1-737)-H8 DNA片段和450 bp的BcCaM(1-149)-H6 DNA片段(圖2-A、B),分別用EcoRⅠ/NheⅠ和EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切pFast載體(圖2-C),用EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切BcCaM(1-149)-H6 DNA產(chǎn)物(圖2-D),用2×Ezmax-single CloneMix Plus酶和T4DNA連接酶分別連接2個片段的酶切質(zhì)粒和片段,進行DH5α轉(zhuǎn)化,挑取單克隆送公司測序后用BioEdit軟件比對測序結(jié)果。

圖3 BcMyosinⅠ(1-737)-H8和BcCaM(1-149)-H6 的表達純化結(jié)果Fig.3 Expression and purification of BcMyosinⅠ(1-737)-H8 and BcCaM(1-149)-H6A. Ni-NTA柱純化BcMyosinⅠ(1-737)-H8和BcCaM(1-149)-H6 的SDS-PAGE;B. BcMyosinⅠ(1-737)-H8 和 BcCaM(1-149)-H6的Western blot結(jié)果。M. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品;W1. 緩沖液1;W2. 緩沖液2;E. 洗脫緩沖液。A. SDS-PAGE of BcMyosinⅠ(1-737)-H8 and BcCaM(1-149)-H6 purified by Ni-NTA column;B. Western blot results of BcMyosinⅠ(1-737)-H8 and BcCaM(1-149)-H6. M. Protein marker;W1. Buffer 1;W2. Buffer 2;E. Elution buffer.

2.3 BcMyosinⅠ(1-737)的表達純化

將pFast-BcMyosinⅠ(1-737)-H8和pFast-BcCaM(1-149)-H6 載體的P3代病毒液按照2∶1的體積比共表達于SF9細胞,利用 His8 和His6 標(biāo)簽對 Ni-NTA 瓊脂糖樹脂的親和作用,使用Ni-NTA Beads對蛋白進行純化,用Anti-His單抗檢測發(fā)現(xiàn)BcMyosinⅠ和BcCaM蛋白均可正常表達純化(圖3)。

2.4 凝膠過濾層析檢測蛋白狀態(tài)

為進一步判斷目的蛋白存在狀態(tài),將上述洗脫的目的蛋白上樣于Superdex 200 Increase 10/300GL純化柱,收集管中樣品進行SDS-PAGE,參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白出峰圖推測BcMyosinⅠ(1-737)-H8和BcCaM(1-149)-H6復(fù)合體蛋白以單體形式穩(wěn)定存在(圖4),可用于后續(xù)測定ATPase活性。

圖4 BcMyosinⅠ(1-737)-H8 和BcCaM(1-149)-H6復(fù)合體蛋白凝膠過濾層析純化(A)和收集管SDS-PAGE電泳圖(B)Fig.4 Gel filtration(A)of BcMyosinⅠ(1-737)-H8 and BcCaM(1-149)-H6 complex proteinsand SDS-PAGE(B)for collectionsM. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Protein marker. 2～20. 收集管2～20 Collection 2-20.

2.5 化合物對BcMyosinⅠ的ATPase活性影響的測定

20 μmol·L-1條件下,化合物B1和B17對BcMyosinⅠ的ATPase活性抑制率分別為56.24% 和65.39%,較氰烯菌酯的抑制率(27.29%)均有明顯提高(圖5)。

圖5 20 μmol·L-1化合物對BcMyosinⅠ的ATPase活性抑制率Fig.5 Inhibition rates of ATPase activity of BcMyosinⅠby 20 μmol·L-1 compounds不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters represent significant differences(P<0.05).

2.6 抑制劑B1和B17對灰霉菌的活性測定

采用菌絲生長速率法測定肌球蛋白抑制劑B1和B17在20 μmol·L-1條件下對灰霉菌的抑制活性,結(jié)果表明抑制劑B1和B17對灰霉菌的菌絲生長抑制率分別為32.90% 和83.44%,較氰烯菌酯的抑制率(1.06%)均有明顯提高(圖6)。

圖6 20 μmol·L-1化合物對灰霉菌菌絲生長的影響Fig.6 Effect of 20 μmol·L-1 compounds on mycelial growth of Botrytis cinerea

2.7 預(yù)測的BcMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)

同源模建預(yù)測的BcMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)標(biāo)記為藍色,模板FgMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)標(biāo)記為綠色(圖7-A);PROCHECK統(tǒng)計數(shù)據(jù)(圖7-B)顯示 BcMyosinⅠ整體結(jié)構(gòu)98.7%的氨基酸殘基都存在于完全允許區(qū)域(紅色)和額外允許區(qū)域(黃色),表明預(yù)測的BcMyosinⅠ基本骨架構(gòu)象是合理的。

圖7 BcMyosinⅠ的三維結(jié)構(gòu)圖Fig.7 The 3D structure of BcMyosinⅠA. BcMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)圖的卡通模型The 3D structure of BcMyosinⅠin cartoon representation;B. BcMyosinⅠ模型的拉氏圖Ramachadran plot calculated for the BcMyosinⅠmodel.

2.8 抑制劑B1和B17與BcMyosinⅠ蛋白的分子對接

為研究抑制劑B1和B17與BcMyosinⅠ蛋白間的可能結(jié)合模式,我們進行了分子對接。圖8中灰白色條帶為同源模建預(yù)測的BcMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)局部圖,用不同顏色標(biāo)記的分別為化合物B1和B17。對接結(jié)果表明化合物B1與BcMyosinⅠ的氨基酸殘基Lys217和Cys424形成氫鍵,結(jié)合能為-35.53 kJ·mol-1;化合物B17與BcMyosinⅠ的氨基酸殘基Thr218、Lys376和Asp541形成氫鍵,結(jié)合能為-36.78 kJ·mol-1;對照藥劑氰烯菌酯與BcMyosinⅠ的氨基酸殘基Thr218和Asp541形成氫鍵,結(jié)合能為-29.26 kJ·mol-1。結(jié)合能的高低與化合物和靶蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性有關(guān),可用于評估化合物對靶點的抑制活性強弱,結(jié)合能越低,化合物活性越強,由分子對接結(jié)果也表明化合物B1和B17對BcMyosinⅠ的抑制活性均高于氰烯菌酯。

圖8 B1、B17和氰烯菌酯與BcMyosinⅠ的結(jié)合模式Fig.8 The binding patterns of B1,B17 and phenamacril with BcMyosinⅠA. B1與BcMyosinⅠ的結(jié)合模式圖Diagram of binding pattern of B1 and BcMyosinⅠ;B. B17與BcMyosinⅠ的結(jié)合模式圖Diagram of binding pattern of B17 and BcMyosinⅠ;C. 氰烯菌酯與BcMyosinⅠ的結(jié)合模式圖Diagram of binding pattern of phenamacril and BcMyosinⅠ.條帶表示BcMyosinⅠBands indicate BcMyosinⅠ;化合物(綠色)和關(guān)鍵殘基(白色)用棍狀圖表示Compounds(green)and key residues(white)are shown in stick plots;氫鍵用黃色虛線表示Hydrogen bonds are shown in dotted yellow lines.

3 討論

肌球蛋白屬于細胞骨架蛋白,在生命活動中發(fā)揮重要作用。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,肌球蛋白功能障礙與心肌病、耳聾、失明、腎病和神經(jīng)系統(tǒng)缺陷等疾病有關(guān)[17]。目前已開發(fā)出一些肌球蛋白抑制劑,如五氯修地林(pentachloropseudilin,PCIP)、N-芐基-對甲苯磺酸胺(N-benzyl-p-toluenesulfonamide,BTS)和2,3-丁烷二酮一肟(2,3-butanedione monoxime,BDM)等[18]。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,目前僅有氰烯菌酯一個肌球蛋白抑制劑,然而氰烯菌酯的選擇性極強,僅對禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌引起的小麥赤霉病和水稻惡苗病有效,對農(nóng)業(yè)上為害很重的稻瘟病菌和灰霉菌等沒有抑制活性或活性很低。氰烯菌酯這一藥劑特征,嚴(yán)重限制其在植物病害化學(xué)防控中的大范圍應(yīng)用。

從本實驗室設(shè)計合成的氰烯菌酯衍生物庫中篩選得到對灰霉菌Ⅰ型肌球蛋白具有顯著抑制活性的B1和B17兩個化合物。從ATPase活性和菌絲生長試驗可以看出,B1和B17的可能作用位點為灰霉菌Ⅰ型肌球蛋白(BcMyosinⅠ)。另外,分子對接的結(jié)果也表明化合物B1和B17與BcMyosinⅠ分子對接的結(jié)合自由能均低于對照藥劑氰烯菌酯,證實B1和B17對BcMyosinⅠ的結(jié)合活性優(yōu)于氰烯菌酯。

本文首次報道了灰霉菌MyosinⅠ的體外表達純化方法,并以此作為靶標(biāo)成功篩選得到對灰霉菌肌球蛋白具有顯著抑制活性的化合物B1和B17,其中化合物B17的生物活性高于B1。將B1與氰烯菌酯的分子結(jié)構(gòu)式進行對比,發(fā)現(xiàn)B1中取代芳環(huán)替代酯基可提高化合物對灰霉菌肌球蛋白的抑制活性,且磺酰胺基可作為電子等排體替換氰烯菌酯中的取代雙鍵;將B17與氰烯菌酯的分子結(jié)構(gòu)式進行對比,發(fā)現(xiàn)在芳環(huán)對位引入取代基可使小分子與BcMyosinⅠ蛋白Lys376殘基間形成氫鍵,增強蛋白與小分子化合物間的相互作用,有利于化合物活性的提高;通過比較B1和B17與BcMyosinⅠ的分子對接結(jié)果,發(fā)現(xiàn)B1與BcMyosinⅠ的氨基酸殘基Lys217和Cys424形成氫鍵,B17與BcMyosinⅠ的氨基酸殘基Thr218、Lys376和Asp541形成氫鍵,B17與較多氨基酸形成氫鍵從而降低結(jié)合自由能,推測B17對灰霉菌具有更高的抑制活性,與菌絲生長和ATPase活性測定結(jié)果一致。今后可在氰烯菌酯的芳環(huán)對位引入其他取代基以增強與BcMyosinⅠ蛋白間的相互作用,以期得到更高活性的灰霉菌肌球蛋白抑制劑,進而為灰霉病的綠色防控提供新的解決方案,為新農(nóng)藥創(chuàng)制提供新的發(fā)展方向。