孫淼,張玲,葛亞平,陳偉亮,劉波,劉文斌,李向飛*

(1.南京農業(yè)大學動物科技學院/江蘇省水產動物營養(yǎng)重點實驗室,江蘇 南京 210095;2.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心,江蘇 無錫 214081)

魚粉是水產動物的優(yōu)質蛋白來源,富含多種必需氨基酸、脂肪酸、礦物質和維生素,具有氨基酸平衡性好、適口性好、抗營養(yǎng)因子少及含有未知的生長因子等優(yōu)點[1]。隨著海洋漁業(yè)資源的衰減,魚粉的供求關系日趨緊張,價格不斷上漲,且魚粉中的磷含量較高,水產動物對其利用率相對較低以及魚粉在加工過程中產生的廢水和廢氣對環(huán)境造成不利影響等[2],種種原因限制了它在水產飼料中的應用。作為另一種動物性蛋白源——血粉,其粗蛋白含量較高(達80%以上)且磷含量低,富含氨基酸(尤其賴氨酸含量較高),但也存在著適口性差、可消化性差、氨基酸組成不平衡等缺陷。江星[3]研究發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)對血粉中蛋白質和能量的表觀消化率均較高,表明血粉是蟹的優(yōu)質動物蛋白源;而Abery等[4]的報道卻指出血粉的添加量受魚種影響而差異較大,且大多數(shù)魚種對血粉的耐受量不超過20%。植物蛋白源中,豆粕粗蛋白含量較高,必需氨基酸組成合理,抗營養(yǎng)因子易消除,且適口性和消化吸收率均較高,是甲殼動物優(yōu)質植物蛋白來源。此外,棉粕、菜粕和花生粕也具有蛋白含量高的優(yōu)點,但由于抗營養(yǎng)因子的存在和黃曲霉毒素污染等問題,其在水產飼料中的應用尚無豆粕廣泛[5]。白燕等[6]研究了鯽魚腸道對4種蛋白質飼料的體外消化率,結果發(fā)現(xiàn)以花生粕消化率和氨基酸生成效率最高,類似的結果在凡納濱對蝦[7]中也有報道;此外,在對吉富羅非魚[8]的研究中發(fā)現(xiàn),雖然魚粉的表觀消化率最高,但其也能高效利用豆粕和菜粕中的粗蛋白。由此可見,不同物種對不同蛋白源的利用具有明顯差異。

消化率是評價飼料營養(yǎng)價值的重要指標之一[9],研究方法主要有體內和體外消化法2種。前者又分為直接法(收糞法)和間接法(指示劑法),然而這2種方法都需要收集糞便,不可避免地存在糞便中營養(yǎng)成分溶失的弊端;后者是在試管或錐形瓶中模擬動物體內消化的生理條件,以動物消化道酶提取液作為消化酶,對飼料物質進行消化水解,再通過測定消化后飼料物質及消化液中的相關成分來衡量某種營養(yǎng)成分消化率的研究方法。與體內消化率法相比,其具有工作量小、可批量試驗、大幅縮短試驗周期等優(yōu)點[10]。由于消化反應的環(huán)境條件及消化酶種類等的差異,離體消化率無法完全真實反映體內消化的進程,但仍具有較高準確度及參考價值。例如,Fox等[11]比較研究了凡納濱對蝦對單一蛋白原料的體外消化率和體內消化率,發(fā)現(xiàn)二者具有很高的相關性(R2=0.95)。而葉元土[12]也認為在求得二者的相關系數(shù)后,就可以利用離體消化率結果推算在體消化率。以上研究表明,離體消化率在水產動物優(yōu)質蛋白源篩選方面具有重要作用。

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)俗稱青蝦,是我國傳統(tǒng)淡水養(yǎng)殖的經濟蝦種之一。與其他蝦類相比,其個體較小,養(yǎng)殖產量相對偏低,營養(yǎng)需求與原料消化率等相關基礎數(shù)據(jù)較為缺乏,嚴重制約了其配合飼料的研發(fā)[13]。目前,張南南[14]比較了青蝦對魚粉和4種常用植物蛋白源中的干物質和粗蛋白離體消化率,但氨基酸及磷的消化率相關研究尚為空白。基于此,本試驗探究了日本沼蝦對6種蛋白原料中蛋白質、氨基酸及磷的離體消化率,以期為日本沼蝦高效配合飼料研發(fā)提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗蝦及飼料原料

試驗蝦為雜交日本沼蝦太湖1號,運回后暫養(yǎng)于室內的循環(huán)系統(tǒng)中,饑餓24 h以排空消化道內容物。

試驗原料包括進口魚粉、血粉、豆粕、菜粕、花生粕和棉粕等6種常規(guī)蛋白質原料,均購自江蘇海普瑞飼料有限公司,產地分別為秘魯以及中國的山東、黑龍江、四川、河北、新疆。原料經粉碎后過178 μm孔徑篩,于-20 ℃冰箱保存。飼料原料的概略養(yǎng)分含量見表1。

1.2 粗酶液的制備

粗酶液的提取參照葉元土等[15]的方法。選取約2 g的健康個體,快速剖取出蝦的胃、肝胰腺和腸道。用超純水清洗去除組織內容物后,吸干表面水分。然后,分別稱取肝胰腺和胃腸道質量并分別加入其質量9倍體積的磷酸鹽緩沖液(PBS,0.2 mol·L-1,pH7.4),用玻璃勻漿器在冰浴中勻漿。最后,勻漿液在4 ℃、5 000 r·min-1下離心10 min,上清液即為粗酶提取液,于-80 ℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料原料的概略養(yǎng)分含量Table 1 The proximate composition of feed ingredients %

1.3 干物質、粗蛋白及總磷消化率的測定

稱量過180 μm 篩的飼料原料樣品各0.50 g,放入100 mL具塞錐形瓶中,加入0.2 mol·L-1、pH7.4的PBS 47.5 mL,各消化道部位的粗酶提取液2.5 mL。每組原料酶解時設3個重復,并以消化道各部位的煮沸粗酶提取液為對照組。參照王子淑[16]的方法加入雙抗(青霉素和硫酸鏈霉素)各150 IU·mL-1,置于30 ℃恒溫水浴振蕩器中反應8 h,振蕩頻率為50次·min-1,間隔4 h補充1次,以防止外界微生物的干擾。

酶解反應結束,反應殘渣用定量濾紙過濾,用超純水沖洗3～4次后,在105 ℃下烘至恒重并稱重。采用凱氏定氮法測定消化后殘渣的粗蛋白含量,殘渣中總磷含量參照《分光光度法:GB/T 6437—2002》測定。飼料原料中干物質、粗蛋白及總磷體外消化率計算公式如下:

干物質消化率(%)=(飼料樣品初重-殘渣樣品質量)/飼料樣品初重×100;

粗蛋白消化率(%)=(飼料樣品初重×樣品中粗蛋白的含量-殘渣樣品質量×濾渣樣品中粗蛋白的含量)/(飼料樣品初重×樣品中粗蛋白的含量)×100;

總磷消化率(%)=(飼料樣品初重×樣品中總磷的含量-殘渣樣品質量×濾渣樣品中總磷的含量)/(飼料樣品初重×樣品中總磷的含量)×100。

1.4 氨基酸生成量的測定

采用葉元土[17]的茚三酮法測定酶解液中的氨基酸含量。按照前述方法對飼料進行酶解,分別于1、2、4、6、8 h取各組的水解液0.2 mL,加入等體積的100 g·L-1三氯乙酸沉淀蛋白后,于6 000 r·min-1離心20 min。取上清液0.2 mL,加入0.2 mol·L-1的醋酸鹽緩沖液(pH5.5)1.8 mL,再加入20 g·L-1茚三酮溶液2 mL顯色。置于沸水浴20 min后冷卻至室溫。加入50%乙醇7 mL,以不加樣品為空白對照組,用分光光度計在570 nm處測定吸光值(A570)。用亮氨酸標準溶液制作標準曲線,以此來測定酶解液中氨基酸總量。

1.5 酶解液中無機磷含量的測定

采用鉬黃比色法測定酶解液中無機磷含量。分別取1、2、4、6和8 h酶解液2 mL于50 mL容量瓶中,加入釩鉬酸銨顯色劑10 mL,加水稀釋至刻度,搖勻,放置10 min后置于10 mm比色皿,用分光光度計測得試樣酶解液的吸光值A400,再根據(jù)磷標準曲線查得酶解液的含磷量。其中,血粉、菜粕、棉粕和花生粕因在顯色反應過程中易產生沉淀而出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象而影響樣品的吸光值,需在4 000 r·min-1條件下離心15 min后再測定吸光值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 日本沼蝦肝胰腺和胃腸道粗酶液對原料中干物質、粗蛋白及總磷離體消化率的影響

如表2所示,日本沼蝦肝胰腺粗酶提取液對豆粕中干物質的消化率最高,顯著高于血粉、菜粕和花生粕(P<0.05),但與棉粕和魚粉間無顯著差異(P>0.05)。棉粕中粗蛋白消化率最高,其與豆粕間無顯著差異(P>0.05),但顯著高于其他原料(P<0.05)。此外,花生粕中總磷消化率最高,其與棉粕和血粉間的差異不顯著(P>0.05),但顯著高于其他原料(P<0.05)。

如表3所示,日本沼蝦胃腸道粗酶提取液對菜粕中的干物質消化率最高,其顯著高于棉粕和血粉(P<0.05),但與豆粕、花生粕與魚粉間無顯著差異(P>0.05)。粗蛋白消化率和總磷的消化率均以棉粕最高,其中,棉粕粗蛋白消化率顯著高于魚粉、血粉和花生粕(P<0.05),而與其他2種原料間無顯著差異(P>0.05);總磷消化率則顯著高于其他各組原料(P<0.05)。

表2 日本沼蝦肝胰腺粗酶提取液對原料中干物質、粗蛋白及總磷離體消化率的影響Table 2 Effect of the hepatopancreas enzyme extract of Macrobrachium nipponense on the in vitrodigestibility of dry matter,crude protein and total phosphorus in feed ingredients %

表3 日本沼蝦胃腸道粗酶提取液對原料中干物質、粗蛋白及總磷離體消化率的影響Table 3 Effect of the gastrointestinal tract enzyme extract of M. nipponense on the in vitro digestibility ofdry matter,crude protein and total phosphorus in feed ingredients %

2.2 日本沼蝦肝胰腺和胃腸道粗酶液對6種飼料氨基酸生成量的影響

由圖1可知:原料類別、酶解時間及其交互作用均極顯著影響日本沼蝦消化道粗酶提取液酶解原料蛋白生成的氨基酸總量(P<0.001)。其中,氨基酸的生成量隨消化道粗酶提取液酶解時間的延長而顯著升高(P<0.05)。在肝胰腺酶解過程中(圖1-A),魚粉生成的氨基酸總量最高,且顯著高于其他原料(P<0.05);4種植物蛋白源中以棉粕生成的氨基酸生成量最高。胃腸道酶解生成的氨基酸總量(圖1-B)以血粉最高,其顯著高于其他原料(P<0.05)。4種植物蛋白源中仍以棉粕的氨基酸生成量最高,且顯著高于其他植物原料(P<0.05)。

圖1 日本沼蝦肝胰腺(A)和胃腸道(B)粗酶提取液酶解6種飼料蛋白生成的氨基酸總量變化Fig.1 Total amino acid production of six feed ingredients by the hepatopancreas(A)and gastrointestinal tract(B)enzyme extract of M. nipponensePt:酶解時間P值;PT:原料種類P值;Pt×T:交互作用P值。小寫字母不同表示同一飼料不同時間點間差異顯著(P<0.05),大寫字母不同表示同一時間點不同飼料間差異顯著(P<0.05)。下同。Pt:P-value for enzymatic time;PT:P-value for feed type;Pt×T:P-value for interaction effect. Different lower-case letters indicate significant differences(P<0.05)at different time points within each feed,whereas different capital letters indicate significant differences(P<0.05)at the same time point among different feed. The same below.

2.3 6種蛋白飼料在日本沼蝦肝胰腺和胃腸道粗酶液中無機磷含量的變化

由圖2-A可知:原料種類、酶解時間及其交互作用對日本沼蝦肝胰腺粗酶液中無機磷含量均無顯著影響(P>0.05)。

由圖2-B可知:原料類別、酶解時間及其交互作用均極顯著影響胃腸道酶解液中無機磷含量(P<0.01)。隨著酶解時間的延長,魚粉和血粉組胃腸道酶解液中磷含量均在6 h達到峰值,隨后血粉組顯著下降(P<0.05)?；ㄉ山M變化趨勢與之相似,區(qū)別在于其峰值在4 h處出現(xiàn)。豆粕和菜粕均在2 h達到最大值,而棉粕組在整個反應期間的磷含量均無顯著差異(P>0.05)。同時,在反應進行到8 h時,魚粉組的磷含量顯著高于其他各組(P<0.05)。

圖2 6種飼料在日本沼蝦肝胰腺(A)和胃腸道(B)粗酶提取液中的磷含量變化Fig.2 Phosphorus contents of six feed ingredients in the hepatopancreas(A)and gastrointestinal tract(B)crude enzyme extract of M. nipponense

3 討論

3.1 日本沼蝦肝胰腺和胃腸道粗酶液對原料中干物質、粗蛋白及總磷離體消化率的影響

干物質的消化率可反映動物對飼料總體的消化水平[18]。本試驗中,日本沼蝦肝胰腺粗酶液對豆粕中干物質的消化率最高,其次為棉粕和魚粉;而胃腸道粗酶液對菜粕的干物質消化率最高,豆粕和魚粉次之。上述結果表明,日本沼蝦對植物蛋白源中干物質的消化率高于動物蛋白源。張南南[14]的研究結果表明,日本沼蝦對5種飼料原料干物質的消化率分別為魚粉11.24%、豆粕11.47%、棉粕12.33%、菜粕12.32%、花生粕8.73%,本研究結果與之相符。此外,在凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[7]離體消化率相關研究中也發(fā)現(xiàn)了類似結果。究其原因,可能是因為魚粉中灰分含量較高,影響了蝦體對其中干物質的消化率[16]?；谏鲜鼋Y果,在魚粉資源短缺、飼料成本高昂的情況下,4種植物餅粕均可在一定程度上替代日本沼蝦飼料中的魚粉。

蛋白質是動物生長所需的關鍵營養(yǎng)物質。因此,在飼料營養(yǎng)價值評定中,動物對原料中蛋白質的消化率顯得尤為重要[19-20]。綜合來看,日本沼蝦對棉粕粗蛋白的消化率最高,豆粕次之,二者均高于魚粉,該結果與在鯽魚(Carassiusauratus)[6]和凡納濱對蝦[7]的研究結果類似,推測原因,可能與日本沼蝦的食性相關,一般情況下,與肉食性動物如卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[21]和蘭州鲇(Siluruslanzhouensis)[22]等相比,雜食性動物對動物性原料中蛋白的利用率相對植物蛋白偏低。此外,由于飼料原料氨基酸組成的差異,消化酶對蛋白水解的位點及數(shù)量也不同,同一條件下的消化酶便會產生不同的酶解速度和程度[18],同時,也可能是由于魚粉中蛋白質含量較高,超出了日本沼蝦蛋白酶作用的最大底物濃度,繼而造成其消化率相對偏低。相較于魚粉,棉粕在水產動物飼料中的添加量較少,主要原因在于棉酚的存在、賴氨酸不足及粗纖維含量較高導致動物對其利用率低。但本文的結果卻顯示日本沼蝦對棉粕具有較高的離體消化率。究其原因可能在于魚蝦相對低等,對棉粕中有害物質的耐受能力比家禽等恒溫動物強[23],類似結果同樣見于異育銀鯽[24]。這進一步表明,豆粕和棉粕等植物餅粕可能是日本沼蝦優(yōu)質蛋白來源。

磷是構成軟骨骼等的重要成分,是維持甲殼動物生長發(fā)育的必需礦物質之一。在飼料營養(yǎng)價值評定中,動物對原料中磷的消化也尤為重要。大量研究表明,植物原料中的磷大部分都以植酸磷形式存在,且其易螯合鈣、鎂、鋅等金屬元素,難以被動物腸道吸收利用。而在本研究中,日本沼蝦肝胰腺和胃腸道粗酶液對菜粕中磷離體消化率較高,而對魚粉中磷的離體消化率較低。究其原因,可能在于日本沼蝦體內堿性磷酸酶活性相對較高,在鈣、磷的消化吸收等過程中發(fā)揮重要作用[25],而堿性磷酸酶具有水解植酸磷的作用[26]。鮑蕾[27]的研究表明,適宜的日糧磷水平可顯著提高日本沼蝦腸道蛋白酶活性。由此可以推測,魚粉中高含量的磷對日本沼蝦腸道消化酶活性產生了抑制作用,影響了其對粗蛋白的消化率,符合上述結果。此外,魚粉中的磷多為羥基磷石灰和磷酸鈣形式,需要在酸性條件下才能被充分分解[28],因此胃腸道粗酶液對魚粉中磷的離體消化率略高于肝胰腺。

3.2 日本沼蝦肝胰腺和胃腸道粗酶液酶解飼料蛋白生成氨基酸總量的變化

蛋白質在被攝食后,需經消化生成氨基酸才能被動物吸收。因此,易于酶解的蛋白質才更易被動物利用?；诖?蛋白質酶解后氨基酸的生成率也可以用來評估蛋白質的營養(yǎng)價值。本研究結果表明,在經日本沼蝦肝胰腺和胃腸道粗酶提取液酵解后,魚粉和血粉的氨基酸生成量相對較高。究其原因,可能在于,與植物原料相比,動物原料中蛋白質的溶解度相對較高及氨基酸組成相對平衡。研究表明,飼料被酶解的速度除了與其組織結構和化學組成有關,還與飼料蛋白的溶解度及其氨基酸組成密切相關[29]。另外,魚粉和血粉酶解后的氨基酸生成量較高,而其粗蛋白消化率較低。結果看似矛盾,實則可能是由于兩者在酶解之前的游離氨基酸含量就遠高于其他蛋白飼料,而過高水平的氨基酸抑制了蝦體對粗蛋白的消化[6]。此外,棉粕和豆粕酶解后產生的氨基酸也相對較高,表明二者在日本沼蝦配合飼料的開發(fā)中具有廣泛的應用前景。粗酶液酶解后,血粉也具有較高的氨基酸生產量,但由于其干物質和粗蛋白消化率均較低,可通過補充限制性氨基酸及改善加工工藝(如噴霧干燥和日曬)等來提高其利用率[30]。

3.3 日本沼蝦肝胰腺和胃腸道粗酶液中無機磷含量的變化

動物消化道內的總磷由采食后進入消化道的外源磷、消化液和腸壁細胞分泌的磷及消化道脫落細胞中的內源磷等組成。其中,無機磷在消化道內溶解后可直接被吸收利用,而有機磷則需經過水解酶的作用釋放出無機磷后才可被吸收[31]。本試驗中,各種原料經日本沼蝦肝胰腺粗酶液處理后,無機磷含量均無顯著差異。究其原因,可能在于磷的主要消化部位為腸道[32]。胃腸道粗酶液酶解1 h后,6種原料在粗酶液中的磷含量均呈上升趨勢,可能是磷酸酶將有機化合物中的磷分離出來而逐漸溶解至粗酶液中所致[33];在酶解反應后期即6～8 h,除魚粉外的其他飼料原料中磷含量大致呈現(xiàn)下降的趨勢。究其原因,可能是隨著反應時間的延長,酶濃度逐漸降低,無法進一步消化原料中的磷而導致磷含量下降;而魚粉則由于其磷存在形式的影響,阻礙了酶解液對其消化而導致酶解液中磷含量不斷攀升,這與上述磷的體外消化率結果一致。另外,不同原料酶解液中的無機磷含量達到峰值的時間點也有差異,可能與不同原料中鈣水平及鈣磷比有關[34]。

綜上所述,4種植物性蛋白飼料中,日本沼蝦消化器官酶解液對棉粕中粗蛋白和總磷的離體消化率較高,同時其氨基酸的生成量也較高。因此,在配合飼料制作過程中,可用棉粕替代部分魚粉來降低飼料成本。另外,粗酶液酶解后,血粉氨基酸生成量較高,但干物質和粗蛋白消化率較低,可通過改善加工工藝等措施來提高其利用率。