王婧雯 鄭淑霞 林晟 許金森

腹瀉型腸易激綜合征(irritable bowel syndrome-diarrhea,IBS-D)是一種反復(fù)發(fā)作、纏綿不愈的慢性功能性腸病,其在臨床上的特征主要是腹瀉、腹痛或腹部不適,根治較難。目前了解到的發(fā)病機(jī)制有胃腸功能紊亂、腦腸軸紊亂、內(nèi)臟高敏感性、腸道菌群失調(diào)等。有研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群失調(diào)與IBS-D的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,IBS-D患者的腸道菌群與正常人相比存在明顯差異,常表現(xiàn)為有益菌減少,有害菌增多[1]。臨床在治療IBS-D時(shí)采取了很多方法,然而效果卻不盡如人意,針灸以其安全有效簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)在眾多治療方法中嶄露頭角。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),電針不僅可以改善IBS-D患者的各項(xiàng)癥狀[2],降低內(nèi)臟高敏感性[3-4],而且對(duì)于改變腸道菌群結(jié)構(gòu)也有一定幫助[5],但是對(duì)于其中具體的分子機(jī)制仍存在疑惑。課題組前期研究已經(jīng)表明電針對(duì)于IBS-D大鼠具有良好的治療效果,能夠緩解大鼠癥狀,且對(duì)于辣椒素受體(TRPV1)以及蛋白酶激活受體-2(partition defective protein-2,PAR-2)通路有影響,但具體對(duì)大鼠腸道菌群的影響沒有做出研究,故本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上,從腸道菌群角度探討電針足三里治療IBS-D的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物

選用體質(zhì)量為(200±20)g雄性SPF級(jí)SD大鼠25只,由杭州醫(yī)學(xué)院提供[許可證號(hào):SCXK(浙)2019-0002],于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件:室溫26℃左右,濕度60%左右,自由飲食,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》等文件要求進(jìn)行。

1.2儀器、設(shè)備

R407型小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)(深圳瑞沃德生命科技公司)、電針儀(華佗牌SDZ-Ⅱ型)、0.25×13 mm的毫針(北京漢醫(yī)醫(yī)療器械有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)藥品和試劑

番瀉葉飲片(豪州市華鑫中藥飲片科技有限公司)、異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)、0.9 %氯化鈉注射液(江西科倫藥業(yè)有限公司)。

1.4動(dòng)物分組及處理

按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組8只、模型組8只、電針組9只。正常組不做處理,正常飲水進(jìn)食;模型組和電針組進(jìn)行為期兩周的造模后,對(duì)電針組做電針干預(yù)處理,模型組做同等抓取,不做電針處理。

1.5模型制備

采用慢性束縛應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉灌服法進(jìn)行造模[6-7],具體操作方法:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前10小時(shí)禁食不禁水,先給予番瀉葉煎劑(0.3 g/mL)灌胃給藥(10 mL/kg),每日1次,連續(xù)灌胃14天。灌服完番瀉葉煎劑后,即用自制鐵絲網(wǎng)將大鼠固定1小時(shí),期間限制大鼠活動(dòng),每日1次,持續(xù)14天。

1.6干預(yù)方法

造模結(jié)束后,電針組選擇雙側(cè)“足三里”穴進(jìn)行針刺干預(yù)。參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜》進(jìn)行定位,選取位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5 mm處的“足三里”穴。具體方法:采用自制固定器固定大鼠,暴露大鼠足三里的穴區(qū),用0.25 mm×13 mm毫針直刺,深度5 mm,進(jìn)針后不需要進(jìn)行手法刺激,連接電針儀進(jìn)行治療,設(shè)置連續(xù)波[8],頻率2 Hz,電壓2～5 V,強(qiáng)度以大鼠不嘶叫為宜,電針20分鐘,左右足三里交替進(jìn)行,每日1次,連續(xù)5天。

1.7內(nèi)臟敏感性檢測(cè)

檢測(cè)前,大鼠禁食不禁水18小時(shí),給予異氟烷麻醉各組大鼠后,用自制工具(三通管連接自制球囊、血壓計(jì)、針筒)進(jìn)行檢測(cè)。在球囊上涂充足的液體石蠟后將球囊緩慢插入大鼠肛門約4.5 cm處,然后把大鼠放進(jìn)自制的20 cm×8 cm×8 cm大小的亞克力透明盒中。等待大鼠完全清醒后,約30分鐘左右檢測(cè)大鼠的內(nèi)臟敏感性。測(cè)量腹壁回撤反射評(píng)分(abdominal withdrawa reflex,AWR)時(shí)由針筒向球囊內(nèi)注入空氣,使血壓計(jì)讀數(shù)短時(shí)間內(nèi)分別達(dá)到20、40、60、80 mmHg。不同容積的壓力每個(gè)持續(xù)20秒,重復(fù)3次。

AWR評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]:0分,無明顯行為變化;1分,大鼠身體不動(dòng)或僅有簡(jiǎn)單的頭部運(yùn)動(dòng);2分,大鼠腹部肌肉開始收縮;3分,大鼠下腹壁抬離地面或明顯收縮變平;4分,大鼠腹壁拱起或伴身體、骨盆躬起,臀部抬離地面。

1.8樣本采集與指標(biāo)檢測(cè)

干預(yù)結(jié)束后,大鼠禁食不禁水18小時(shí),用高溫烘烤過的手術(shù)器械進(jìn)行操作。先將大鼠放入小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)誘導(dǎo)盒中使其吸入異氟烷后至麻醉狀態(tài),接著于冰上迅速剪開大鼠的結(jié)腸組織,將留存在大鼠腸道內(nèi)的糞便取出1到2顆裝入備好的無酶EP管內(nèi),隨后置于液氮中保存。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將取材得到的大鼠糞便采用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行腸道菌群的檢測(cè)由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成?；玖鞒?從樣品中提取總基因組DNA,進(jìn)行16SrDNA區(qū)段擴(kuò)增,PCR產(chǎn)品定量和鑒定,混合和純化PCR產(chǎn)物,使用無鏈?DNA PCR 樣品制備法生成測(cè)序文庫(kù),測(cè)序結(jié)果最終進(jìn)行生物信息分析。

測(cè)序完成后,對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,隨后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs 聚類。根據(jù) OTUs 聚類結(jié)果,先做物種注釋,接著進(jìn)行Beta多樣性分析,比較樣本群落組成的相似性或差異性。糞便基因測(cè)序以及生物信息分析流程由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供,根據(jù)公司平臺(tái)生成的數(shù)據(jù)和圖片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1內(nèi)臟敏感性檢測(cè)結(jié)果

由表1可以看出,與空白組相比,模型組大鼠腹壁回撤反射評(píng)分明顯升高(P<0.05),提示造模成功。經(jīng)過電針治療后,與模型組相比,在20 mmHg的壓力下,電針組腹壁回撤反射評(píng)分明顯降低(P<0.05),而在更大壓力下的變化并不明顯,說明電針可以有效改善IBS-D大鼠的內(nèi)臟敏感性,對(duì)于更大壓力變化不明顯的原因有待進(jìn)一步探索。

表1 三組大鼠電針后不同壓力下腹壁回撤反射評(píng)分結(jié)果

2.2OTU分類韋恩圖

通過三組樣本的OTU分布,對(duì)樣本的物種分布情況初步判斷,如圖1所示,空白組OTU個(gè)數(shù)共有2106,模型組共有1739個(gè),電針組共有2047個(gè)OTU數(shù)目;其中模型組與空白組相交疊的OTU數(shù)目明顯低于電針組與空白組交疊數(shù)目。說明經(jīng)過治療后,電針組總OTU數(shù)目以及與空白組交疊數(shù)目均有所上升。

注:K:空白組;M:模型組;D:電針組。

2.3大鼠糞便菌群測(cè)序量分析

Shannon稀釋曲線可以用來反應(yīng)各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性,如圖2所示,各組大鼠OTUs不會(huì)隨著測(cè)序量增加而上升,曲線趨于平坦,說明可以反應(yīng)該樣本絕大多數(shù)微生物多樣性信息,足夠可靠。

圖2 三組大鼠糞便菌群測(cè)序量分析Shannon-Wiener圖

2.4大鼠糞便菌群物種組成分析

根據(jù)OTU聚類結(jié)果,分別在綱、屬、種水平上發(fā)現(xiàn),三組的腸道菌群群落結(jié)構(gòu)基本相似,只是構(gòu)成比有差異。通過比較三組大鼠的菌群物種分布情況,說明電針治療可以改善菌群結(jié)構(gòu)。

在綱(class)水平上,擬桿菌綱、梭菌綱、芽孢桿菌綱、δ-變形桿菌綱四種菌綱豐度相對(duì)較高。與空白組相比,模型組擬桿菌綱、梭菌綱、δ-變形桿菌綱等均有升高,芽孢桿菌綱則明顯降低。而電針組的菌群結(jié)構(gòu)則在模型組的基礎(chǔ)上有所變化。如圖3A所示。

注:K:空白組;M:模型組;D:電針組。

在屬(genus)水平上,三組中排在前六位的菌屬主要有乳桿菌屬、lachnospiraceae_nk4a136_group(毛螺菌屬)、普雷沃氏菌 Ga6A1屬、Eubacterium_coprostanoligenes_group(真桿菌屬)、Ruminiclostridium_9、Ruminococcaceae_UCG.014等。與空白組相比,模型組乳桿菌屬、真桿菌屬明顯降低,毛螺菌屬、普雷沃氏菌 Ga6A1屬、Ruminiclostridium_9、Ruminococcaceae_UCG.014(瘤胃菌屬)等明顯升高。經(jīng)過電針治療后,可看出以上菌屬豐度均有一定的改善。如圖3B所示。

在種(species)水平上,模型組的菌種結(jié)構(gòu)分布與空白組存在明顯差異,其中約氏乳桿菌的占比明顯減少,而隸屬于灰色部分的其他菌種的占比明顯增加,經(jīng)過電針治療后有所改善。如圖3C所示。

2.5大鼠糞便菌群多樣性比較

Beta多樣性分析用來比較不同樣本在物種多樣性方面的相似程度。采用bray curtis的算法計(jì)算樣本間的距離,得到主坐標(biāo)(PCoA)分析的結(jié)果,從圖4可看出模型組與空白組明顯被區(qū)分開(P<0.05),電針組則在兩組之間;且模型組、空白組的組內(nèi)集群效果好,電針組較差。說明了電針組樣本在向空白組靠近,電針可以改善IBS-D大鼠模型的Beta多樣性。

圖4 基于bray curites距離的PCoA分析

3 討論

依照自然屬性分類,人體常見的幾大細(xì)菌門主要為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門等,大多數(shù)人腸道菌群中百分之九十九由這四種菌門組成,它們的豐度和構(gòu)成比例對(duì)人們的健康影響極大[10]。有研究表明IBS-D患者腸道菌群結(jié)構(gòu)與健康人相比存在失調(diào)情況[11-12],其腸道微生物在糞菌移植治療后,會(huì)出現(xiàn)菌群豐度增加、結(jié)構(gòu)改變的情況[13]。近幾年,很多學(xué)者將腸道菌群作為治療IBS-D的靶點(diǎn),得到了較好的效果。IBS-D患者的腸道微生物失調(diào)總結(jié)起來就是有害菌增加、有益菌減少[14],那么了解哪些有害菌增加,以及又有哪些有益菌減少是非常有必要的。目前,大多研究都認(rèn)為,厚壁菌綱、擬桿菌門等豐度增加,乳桿菌屬、雙歧桿菌等豐度降低會(huì)引起IBS-D[15-17]。眾所周知,IBS-D患者的典型癥狀主要是腹痛、腹瀉、腹脹等,這與內(nèi)臟高敏感性相關(guān)[18],曾有學(xué)者提出其腹痛癥狀與腸道菌群結(jié)構(gòu)關(guān)系密切,在于腸道菌群會(huì)產(chǎn)生能加重腹痛癥狀的乙酸鹽[19];同時(shí),也有人指出腹瀉癥狀與某些菌群密切相關(guān), 可能是因?yàn)橐恍┠c道菌群能夠產(chǎn)生影響腸道滲透性的脂多糖[20]。因此,通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂的情況,可以緩解IBS-D的癥狀。

本實(shí)驗(yàn)通過慢性束縛應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉灌服法構(gòu)建IBS-D大鼠模型,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明電針足三里可以通過改善大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)達(dá)到治療大鼠的目的。通過分析各組大鼠糞便菌群在不同水平上的物種組成的結(jié)果發(fā)現(xiàn),IBS-D大鼠糞便菌群的物種構(gòu)成與空白組大鼠存在明顯差異,這與其他人的研究結(jié)果一致[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn),乳桿菌屬明顯降低,且其中約氏乳桿菌種下降非常明顯,乳桿菌屬做為有益菌,可以對(duì)抗機(jī)體致病微生物,改善腸道屏障功能,預(yù)防和治療腹瀉。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)模型組的普雷沃氏菌 Ga6A1屬豐度明顯高于其他兩組,Prevotellaceae_Ga6A1_group隸屬于普氏菌屬,普雷沃氏菌可以加快碳水化合物發(fā)酵,誘發(fā)內(nèi)臟超敏反應(yīng),甚至可能通過增加腸道通透性的方式加劇腹痛腹瀉的癥狀。基于此,普雷沃氏菌的增加與內(nèi)臟高敏感性呈正相關(guān)。因此,乳桿菌屬的降低、普雷沃氏菌的增加都可能是IBS-D的起病原因。

本實(shí)驗(yàn)通過電針足三里穴發(fā)現(xiàn),IBS-D大鼠具有內(nèi)臟高敏的反應(yīng),且證實(shí)了其具體的內(nèi)在機(jī)制可能與腸道菌群結(jié)構(gòu)有關(guān);明顯可以看出模型組相較空白組而言有降低或增加的腸道微生物,在電針組中或多或少得到了改善。本研究證明了高通量測(cè)序技術(shù)可以滿足大鼠腸道菌群的檢測(cè)需求,為深入研究電針足三里穴治療IBS-D提供了參考思路,但由于受客觀條件的影響,并未對(duì)實(shí)驗(yàn)中改變明顯的菌群進(jìn)行功能預(yù)測(cè),未來可進(jìn)一步研究菌群的功能基因在代謝途徑和蛋白功能上的差異和變化。