吳以龍 謝晶晶 黃麗靜 夏寧寧 江志俊 黃兆許 陳津津

幽門螺桿菌（Hp）是一種微需氧、革蘭陰性菌，Hp感染與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤等上消化道疾病密切相關，并被確定為胃癌的Ⅰ類致癌物[1-2]。選用敏感的抗生素根除Hp是防治相關疾病的有效方法[3]，并且對降低中國Hp感染率具有重要意義[4]。由于抗生素的廣泛使用和Hp根除治療的大量開展，Hp的耐藥率逐漸升高，且存在明顯的地域差異[5]。Hp的關鍵抗菌靶基因發(fā)生突變可能使其逃避抗生素的殺菌作用，23S rRNA 基因V 區(qū)突變使核糖體與克拉霉素的親合力降低，這是導致Hp對克拉霉素耐藥的主要原因，并且23S rRNA 基因的突變位點和突變形式存在地域差異。機體對氟喹諾酮類藥物耐藥主要是由于喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)（QRDR）發(fā)生突變所致[6-8]。本課題組前期研究結果顯示，閩浙邊界地區(qū)為Hp抗菌藥物的高耐藥區(qū)域，總體耐藥率達98.8%[9]。研究顯示，在發(fā)生腸上皮化生的胃黏膜表面，Hp通常無法定殖，通過藍激光成像結合放大內鏡（BLI-ME）觀察時，可見腸上皮化生黏膜上皮表面呈藍色嵴狀結構，即為亮藍嵴。本研究使用BLI-ME 指導靶向活體組織檢查，避開腸化生上皮，提高Hp培養(yǎng)陽性率，再進行藥物敏感度體外實驗，進一步了解Hp感染的單藥、雙重及三重耐藥情況及患者臨床特征，并對分離得到的克拉霉素耐藥菌株的23S rRNA 基因序列和左氧氟沙星耐藥菌株的gyrA基因序列進行檢測和分析，探討其耐藥機制，以期為閩浙邊界地區(qū)Hp的臨床治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2019 年10 月至2020 年1 月閩浙邊界地區(qū)417 例因上消化道癥狀于福建中醫(yī)藥大學附屬福鼎醫(yī)院消化內鏡中心行胃鏡檢查及胃黏膜活體組織檢查者，從其中247 例患者中成功分離得到Hp菌株（即247 株）。247 例患者中男性135 例，女性112 例，年齡20～83 歲，平均年齡為（49.55±11.12）歲。納入標準：（1）有上消化道癥狀者，上消化道癥狀包括上腹痛或燒灼感、餐后上腹飽脹感和早飽感的癥候群，可伴食欲不振、噯氣、惡心或嘔吐等；（2）行胃鏡檢查及胃黏膜活體組織檢查者；（3）簽署知情同意書。排除標準：（1）近4 周內曾使用抗菌藥物、鉍劑、質子泵抑制劑或H2受體阻滯劑者；（2）妊娠期或哺乳期婦女；（3）嚴重系統性疾病患者，如肝病、心肺疾病等；（4）不能正確表達主訴者，如患有精神疾病及不能配合者；（5）非長期居住于福建省寧德市及浙江省溫州市者（居住年限＜5年）。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準[鼎醫(yī)綜（2020）4 號]。

1.2 Hp 培養(yǎng)、鑒定及抗菌藥物敏感度體外實驗

使用BLI-ME 指導靶向活體組織檢查，避開腸化生上皮，分別取胃竇、胃體處的胃黏膜組織，置于裝有0.5 mL 轉運液的無菌EP 管中，用干冰保溫，48 h 內運送至實驗室，用巴氏吸管將胃黏膜組織轉移至研磨器，充分研磨成勻漿后，接種于含5%脫纖維綿羊血的哥倫比亞瓊脂平板上，均勻涂開后，置于37 ℃的三氣培養(yǎng)箱（含5% O2、10% CO2和85% N2）中培養(yǎng)3～7 d，觀察細菌生長情況?？梢删洌ㄍ该骰虬胪该鞯尼樇鈽泳洌┙浲科R檢結果顯示細菌形態(tài)符合Hp特征，且生物化學反應（尿素酶、氧化酶和過氧化氫酶實驗）均呈陽性的菌株，判定為Hp菌株。

采用瓊脂稀釋法，對陽性菌株進行抗菌藥物耐藥性檢測。在6 種抗菌藥物溶液中分別加入瓊脂并稀釋至相應的臨界點耐藥濃度，傾注平板；用移液器將2 μL 菌懸液滴加至平板上，待其干燥后，置于37 ℃三氣培養(yǎng)箱（濕度＞80%）中，培養(yǎng)3 d 后判讀藥物敏感度體外實驗檢測結果，若接種點有菌生長，則該菌株判讀為耐藥。6 種抗菌藥物耐藥判定標準設定為：克拉霉素1 μg/mL，左氧氟沙星2 μg/mL，甲硝唑8 μg/mL，阿莫西林2 μg/mL，呋 喃 唑 酮2 μg/mL 和 四 環(huán) 素2 μg/mL[10]。 以HpATCC 26695 作為質控菌株。

1.3 基因測序

隨機選取分離出的克拉霉素和左氧氟沙星耐藥菌株各50 株，使用基因組DNA 提取試劑盒（購自美國Invitrogen 公司），按照說明書操作，提取Hp基因組。采用PCR 法擴增克拉霉素耐藥相關基因23S rRNA 和左氧氟沙星耐藥相關基因gyrA[6-8]。針對目的基因設計引物，引物序列見表1。對擴增后的產物測序、比對，確定序列正確無誤。PCR 反應條件：95 ℃預變性3 min；之后95 ℃變性20 s、57 ℃退火20 s、72 ℃延伸90 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。采用瓊脂糖凝膠電泳法鑒定PCR產物并拍照。采用Sanger 法對PCR 產物進行測序，對測序后的峰圖進行拼接，所得序列與Genbank 中HpATCC 26695 的23S rRNA 基因序列和gyrA基因序列進行比對、分析。

表1 耐藥相關基因的引物序列

1.4 統計學方法

應用SPSS 25.0 軟件對數據進行統計學分析。計數資料以例/株（%）表示，獨立樣本率的比較采用卡方檢驗及Fisher 精確檢驗，趨勢檢驗采用卡方線性趨勢檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hp 菌株耐藥情況及其與患者年齡的關系

247 例 患 者 按 年 齡 分 為≤20 歲 組（2 例）、21～40 歲 組（45 例）、41～60 歲 組（163 例）和＞60 歲組（37 例）。247 株Hp菌株的總體耐藥率為98.8%（244 株），其中甲硝唑的耐藥率[96.4%（238株）]最高，其次為左氧氟沙星[45.7%（113 株）]，克拉霉素的耐藥率達40.9%（101 株）。各年齡組中Hp菌株對甲硝唑的耐藥率均高于95.0%（分別為100.0%、97.8%、95.1%和100.0%）。各年齡組均未發(fā)現阿莫西林、呋喃唑酮和四環(huán)素耐藥菌株。隨著年齡增長，Hp菌株對左氧氟沙星的耐藥率呈升高趨勢（各組分別為0、22.0%、45.0%和78.0%；R2=0.990，P＜0.05）；此外，Hp菌株對甲硝唑和左氧氟沙星的雙重耐藥率（各組分別為0、8.9%、22.7%和29.7%；R2=0.986，P＜0.05），以及對甲硝唑、左氧氟沙星和克拉霉素的三重耐藥率（各組分別為0、11.1%、20.2% 和48.6%；R2=0.925，P＜0.05）也均隨年齡增長而升高。各年齡組對克拉霉素的耐藥率分別為100.0%、44.4%、35.6%和56.8%，平均耐藥率為40.9%。見圖1。

圖1 不同年齡患者Hp 菌株耐藥率變化趨勢

2.2 克拉霉素耐藥菌株的23S rRNA 基因突變情況

50 株克拉霉素耐藥菌株經PCR 后均擴增出23S rRNA 基因的目的片段，長度為2 975 bp。擴增樣本測序結果顯示，50 株耐藥菌株均發(fā)生23S rRNA 基 因V 區(qū)（2055～2899） 突 變， 共 發(fā) 現4種突變類型，其中A2143G 的突變率為100%，T2182C 的突變率為60%，A2302G 的突變率為24%，G2864A 的突變率為98%。見圖2、圖3。

圖2 DNA Marker 的電泳條帶 A DNA Marker D2000 PCR 電泳條帶 B DNA Marker D15000 PCR 電泳條帶

圖3 部分克拉霉素耐藥菌株23S rRNA 基因PCR 擴增產物電泳圖譜及耐藥位點測序峰圖 A 克拉霉素耐藥菌株23S rRNA 基因 B 未發(fā)生突變的23S rRNA 基因 C 發(fā)生A2143G 突變的23S rRNA 基因

2.3 左氧氟沙星耐藥菌株的gyrA 基因突變情況

50 株左氧氟沙星耐藥菌株經PCR 后均擴增出gyrA基因的目的片段，長度為2 484 bp。擴增標本測序結果顯示，50 株耐藥菌株均發(fā)生gyrA基因QRDR 突變，突變位置是第87 位和第91 位氨基酸。32 株為第87 位氨基酸純合突變（N87K/Y/I），15 株為第91 位氨基酸純合突變（D91N/Y），1 株為第87 位氨基酸雜合突變（N87Y、N87I），1 株為第91 位氨基酸雜合突變（D91Y、D91N），1 株為第87 位氨基酸和第91 位氨基酸雜合突變（N87Y、D91Y）。見圖4。

圖4 部分左氧氟沙星耐藥菌株gyrA 基因PCR 擴增產物電泳圖譜及耐藥位點測序峰圖 A 左氧氟沙星耐藥菌株gyrA 基因 B 未發(fā)生突變的gyrA 基因 C 發(fā)生Asn87Lys 純合突變的gyrA 基因 D 發(fā)生Asp91Asn 純合突變的gyrA 基因

3 討論

研究表明，部分地域的Hp根除率＜80%[11]；在Hp高耐藥地域，經驗性用藥對Hp的根除率約為70%[12]。導致Hp根除失敗的原因包括對抗菌藥物耐藥、患者依從性差、環(huán)境因素、質子泵抑制劑的快速代謝等[4,11]，對抗菌藥物耐藥是其中最重要的原因。由于不同國家、不同地區(qū)的Hp耐藥性不同，根除方案的制定需因地制宜。近年來在中國，Hp對左氧氟沙星、克拉霉素和甲硝唑的耐藥率呈逐年升高趨勢[5]，并且不斷出現多重耐藥現象[13]。研究顯示，中國東南沿海地區(qū)Hp對甲硝唑、克拉霉素及左氧氟沙星的耐藥率分別為95.4%、21.5%和20.6%[14]。本研究結果顯示，隨著年齡增長，左氧氟沙星的耐藥率逐漸升高，特別是＞60 歲患者的耐藥率高達78%，這可能與老年患者因呼吸道感染、泌尿系統感染而常使用喹諾酮類藥物有關；克拉霉素在各年齡段的耐藥率均＞20.0%，平均耐藥率達40.9%，建議使用前先進行藥物敏感度試驗。本研究中各年齡段均出現雙重耐藥，除了≤20歲組，其他各年齡段均出現三重耐藥，甲硝唑和左氧氟沙星的雙重耐藥率，以及甲硝唑、左氧氟沙星和克拉霉素的三重耐藥率均隨著年齡增長而升高。

本地區(qū)對克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥率較高，對其耐藥機制的探討意義重大。Hp抗菌藥物的耐藥機制復雜，主要與抗菌作用關鍵靶點相關基因的突變有關?？死顾貙儆诖蟓h(huán)內酯類抗生素，其通過與Hp核糖體緊密結合后作用于細菌23S rRNA 基因V 區(qū)的多肽轉移酶環(huán)，抑制細菌蛋白質的合成而發(fā)揮抑菌作用，23S rRNA 基因V 區(qū)突變使核糖體與克拉霉素的親合力降低，導致Hp對克拉霉素耐藥。23S rRNA 基因的突變位點和突變形式具有地域差異，突變位點包括A2142C、A2142G、A2143G、A2146C、A2147G、A2223G 和T2182C 等[15]。本研究結果顯示，本地區(qū)克拉霉素耐藥菌株均發(fā)生A2143G 突變，這與浙江地區(qū)的研究結果相符[16]；本地區(qū)克拉霉素耐藥菌株有60%發(fā)生T2182C 突變，但T2182C 突變是否與耐藥相關，仍存在爭議；此外，本研究發(fā)現克拉霉素耐藥菌株A2302G 突變率為24%，G2864A 突變率為98%，以往少見有相關報道，這可能與本地區(qū)克拉霉素高耐藥有關，仍待進一步驗證。

左氧氟沙星屬于氟喹諾酮類藥物，其對Hp的抗菌機制是通過抑制細菌DNA 旋轉酶，從而干擾細菌DNA 復制；氟喹諾酮類藥物的耐藥主要是由其DNA 旋轉酶上的gyrA基因QRDR 發(fā)生突變所致，gyrA基因耐藥突變區(qū)域主要集中在第67～106位氨基酸[7]，該區(qū)域的突變在氟喹諾酮類藥物耐藥方面具有十分重要的作用。研究表明，第87 位、第91 位氨基酸突變是導致Hp產生耐藥的主要原因[17]。本研究結果顯示，50 株左氧氟沙星耐藥菌株均發(fā)生gyrA基因QRDR 突變，突變位置是第87位和第91 位氨基酸，其中32 株是第87 位氨基酸突變，15 株是第91 位氨基酸突變，這與浙江地區(qū)的研究結果相符[16]。

由于本地區(qū)Hp耐藥率較高，根據耐藥情況指導臨床用藥可提高Hp根除率，從而減少醫(yī)療資源的浪費。細菌培養(yǎng)和藥物敏感度試驗是判斷Hp耐藥性的金標準，但該方法操作較復雜、耗時較長，培養(yǎng)條件較高，常規(guī)實驗室無法開展，且敏感度偏低。通過檢測耐藥突變基因而判斷耐藥性屬于分子生物學方法，其具有快速、簡便、敏感度高等優(yōu)勢，是未來的發(fā)展方向[18-19]。本研究結果顯示，本地區(qū)克拉霉素耐藥菌株100%發(fā)生A2143G 突變，可通過檢測A2143G 突變情況判斷Hp對克拉霉素的耐藥性；本地區(qū)左氧氟沙星耐藥菌株100%發(fā)生gyrA基因QRDR 突變，突變位置是第87 位和第91位氨基酸，因此可通過檢測QRDR 的第87 位、第91 位氨基酸突變情況，判斷Hp對左氧氟沙星的耐藥性。

對于閩浙邊界地區(qū)的Hp患者，應首選基于藥物敏感度試驗結果的個體化Hp根除方案。因分子生物學方法仍處于研究階段，能否應用于臨床尚需進一步驗證，因此本地區(qū)目前仍推薦采用細菌分離、培養(yǎng)和藥物敏感度體外實驗等方法，并可通過BLI-ME 靶向活體組織檢查以提高Hp培養(yǎng)陽性率。今后本課題組將擴大研究規(guī)模、擴大樣本量，以期客觀全面地了解閩浙邊界地區(qū)Hp菌株耐藥相關基因的突變情況，為未來通過分子生物學方法檢測耐藥突變基因而指導臨床用藥提供理論依據。