王 瓊 趙 靜 鞏 婷 呂 穎

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈升高趨勢，因患者早期癥狀不典型，常錯過最佳治療期[1]。因此，發(fā)現(xiàn)并篩選胰腺癌早期診斷及預后預測的潛在生物標志物，對于胰腺癌治療方案的確定具有重要意義。長鏈非編碼RNA（lncRNA）和miRNA 是目前被廣泛研究的非編碼RNA，其表達失調與包括腫瘤在內的多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關[2-4]。研究表明，lncRNA UASR1 在結直腸癌組織中表達上調，并作為miR-107 的分子海綿促進結直腸癌細胞增殖[5]；此外，lncRNA UASR1 在口腔鱗狀細胞癌組織中過表達，通過調節(jié)miR-375/酪氨酸蛋白激酶2 （JAK2）信號通路促進腫瘤細胞增殖[6]。研究表明，miR-144通過抑制肝細胞生長因子 （HGF）表達而抑制肝細胞癌（HCC）細胞增殖，并作為抑癌因子延緩HCC 進展[7]。另有研究表明，miR-144-3p 在胰腺癌組織中呈低表達，可以通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路靶向富含脯氨酸的蛋白11（PRR11），誘導胰腺癌細胞周期阻滯和細胞凋亡[8]。目 前 有 關lncRNA UASR1 和miR-144 在 胰 腺 癌 組織中的表達水平及其臨床意義的研究報道較少。本研究通過分析胰腺癌組織中l(wèi)ncRNA UASR1 和miR-144 的表達水平與患者臨床病理特征的關系，探究兩者對胰腺癌的診斷和預后預測的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2018 年3 月至2019 年3 月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四一醫(yī)院收治的胰腺癌患者作為研究組，并將同期在該院治療的胰腺良性病變患者作為對照組。研究組納入標準：（1）所有患者均符合《胰腺癌綜合診治指南（2018 版）》[9]中的診斷標準，并經(jīng)病理組織學確診為胰腺癌；（2）所有患者均為初次治療；（3）病歷資料完整；（4）近6 個月內未服用激素類藥物。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤者；（2）有復發(fā)或遠處轉移者；（3）合并嚴重自身免疫病者；（4）合并嚴重血液傳染病者；（5）有精神類疾病，依從性差或隨訪失訪者；（6）妊娠期或哺乳期婦女。對照組為需行切除手術的胰腺良性囊腫患者。所有入組患者及家屬均簽署知情同意書，且本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

根據(jù)納入和排除標準，研究組共納入了95 例患者，其中男性59 例，女性36例，年齡36～73 歲，平均年齡為（57.39±9.84）歲。對照組共納入了56例患者，其中男性31 例，女性25 例，年齡30～71歲，平均年齡為（56.27±8.45）歲。2 組的年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），具有可比性。

1.2 lncRNA UASR1 和miR-144 的表達水平檢測

研究組的手術方案包括根治性胰十二指腸切除術、根治性胰體尾聯(lián)合脾臟切除術、全胰腺切除術或聯(lián)合動靜脈切除術等，術中獲取胰腺癌組織；對照組行胰腺節(jié)段切除術等，直接切取腫塊組織。所有手術均由同組經(jīng)驗豐富的醫(yī)師完成，獲取組織后置于-80 ℃冰箱中保存。組織在液氮中研磨后，取100 mg 樣品加入1 mL TRIzol 試劑（購自美國Invitrogen 公司），提取總RNA。應用Nanodrop 2000 紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和濃度。取1 μg 總RNA，使用反轉錄試劑盒[miRcute 增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒和lnRcute lncRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司]將其反轉錄為cDNA。

采用實時熒光定量PCR 法檢測lncRNA UASR1和miR-144 的表達水平。按照試劑盒[miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒和lnRcute lncRNA 熒光定量檢測試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司]說明書操作，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，miR-144 以U6 為內參，lncRNA UASR1 以GAPDH 為內參，引物序列見表1。PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min；之后95 ℃變性15 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，共計40 個循環(huán)。采 用2-△△Ct法計算lncRNA UASR1 和miR-144 的相對表達量。

表1 引物序列

1.3 隨訪

采用電話和門診復查的方式對研究組進行隨訪，隨訪起始時間為患者首次治療出院后，每3 個月隨訪1 次，隨訪截至2022 年3 月或患者死亡。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 23.0 和Origin 9.1 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用ROC 曲線評估lncRNA UASR1 和 miR-144 的 表 達 水 平 對 胰 腺 癌的診斷價值。采用Kaplan-Meier 法分析lncRNA UASR1 和miR-144 的表達水平與胰腺癌患者術后生存期的相關性。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究組和對照組患者lncRNA UASR1 和miR-144 表達水平比較

研究組的miR-144 相對表達量為0.68±0.28，顯著低于對照組（1.35±0.36），差異有統(tǒng)計學意義（t＝-7.594，P＜0.001）。研究組的lncRNA UASR1 相對表達量為2.38±0.32，顯著高于對照組（1.21±0.57），差 異 有 統(tǒng) 計 學 意 義（t＝8.326，P＜0.001）。

2.2 lncRNA UASR1 和miR-144 的表達水平對胰腺癌的診斷價值分析

ROC 曲線分析結果顯示，miR-144 表達水平診斷胰腺癌的曲線下面積（AUC）為0.850（95%CI：0.789～0.910），敏感度為63.9%，特異度為91.1%；lncRNA UASR1表達水平診斷胰腺癌的AUC為0.831（95%CI：0.766～0.896），敏感度為70.1%，特異度為94.6%；2 項聯(lián)合檢測診斷胰腺癌的AUC 為0.945（95%CI：0.913～0.977），敏感度為83.5%，特異度為92.9%。見圖1。

圖1 lncRNA UASR1 和miR-144 的表達水平診斷胰腺癌的ROC曲線

2.3 lncRNA UASR1 和miR-144 的表達水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關系

以lncRNA UASR1 相對表達量的中位數(shù)將患者分為lncRNA UASR1 高表達組（≥2.06，49 例）和lncRNA UASR1 低表達組（＜2.06，46例）；以miR-144 相對表達量的中位數(shù)將患者分為miR-144 高表達組（≥0.68，42 例）和 miR-144 低表達組（＜0.68，53 例）。結 果 顯 示，lncRNA UASR1 的 表 達 水 平與淋巴結轉移、血管侵犯、TNM 分期均有關（P均＜0.05），miR-144 的表達水平與腫瘤直徑、淋巴結轉移、血管侵犯、分化程度、TNM 分期均有關（P均＜0.05）。見表2。

表2 lncRNA UASR1 和miR-144 的表達水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關系/例（%）

2.4 lncRNA UASR1 和miR-144 的表達水平與胰腺癌患者術后生存期的關系

隨訪結果顯示，lncRNA UASR1 低表達組的平均生存期為（19.69±1.20）個月，顯著長于lncRNA UASR1 高表達組[（14.78±0.75）個月]，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝12.887，P＜0.001）；miR-144 高表達組的平均生存期為（18.65±1.10）個月，顯著長于miR-144 低表達組[（15.94±0.78）個月]，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝8.003，P＝0.005）。見圖2。

圖2 lncRNA UASR1 和miR-144 的表達水平與胰腺癌患者生存情況的關系 A miR-144 B lncRNA UASR1

3 討論

胰腺癌早期癥狀不典型，起病隱匿且發(fā)展迅速，導致患者確診時疾病多已進展至晚期，預后較差，患者的中位生存時間為3～5 個月[10-11]。非編碼RNA 參與腫瘤生長和免疫監(jiān)視逃逸相關基因的表達調控，但其在胰腺癌發(fā)生和進展中的潛在機制仍未完全明確。

miRNA 通過與目的基因mRNA 的3'UTR 結合，導致mRNA 降解或翻譯抑制，從轉錄和轉錄后水平影響目的基因的表達。lncRNA 可作為miRNA 的分子海綿，共同調控細胞增殖、炎性因子分泌、細胞凋亡、細胞遷移等細胞生物學行為，進而影響腫瘤進展[12-16]。lncRNA 和miRNA 對胰腺癌的診斷和預后預測的價值及其作用機制是目前的研究熱點，不同的lncRNA 和miRNA 作為抑癌基因或促癌基因影響胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，lncRNA DANCR 在胰腺癌組織和細胞中表達上調，miR-33b 表達下調，且DANCR 可以與miR-33b 靶向結合，調控MMP16 的表達，形成lncRNA-miRNA-mRNA功能網(wǎng)絡，為胰腺癌提供新的潛在治療靶點[17]。

研究表明，結直腸癌組織中l(wèi)ncRNA UASR1表達上調，其可通過調節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路促進結直腸癌細胞增殖[18]；Cao 等[19]研 究 發(fā) 現(xiàn)，lncRNA UASR1 可 通 過 調 控蛋白激酶B（Akt）/mTOR 信號通路促進乳腺癌細胞的增殖和遷移。本研究結果顯示，胰腺癌組織中l(wèi)ncRNA UASR1 表達上調，其對胰腺癌的診斷具有一定價值；lncRNA UASR1 的表達水平與患者淋巴結轉移、血管侵犯及TNM 分期有關，且lncRNA UASR1 高表達患者的預后較差。研究表明，miRNA 可以通過沉默促癌基因或通過靶向腫瘤蛋白而作為腫瘤抑制劑[20]。Manasa 等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-144 在口腔癌細胞系中表達下調，且共表達miR-144/451a 后顯著降低了細胞的遷移、侵襲能力。王開瓊等[22]的研究表明，miR-144 在胰腺癌SW1990 細胞中表達下調，而上調miR-144 表達可有效抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究結果顯示，胰腺癌組織中miR-144 表達下調，且miR-144 的表達水平診斷胰腺癌的AUC 為0.850，其與lncRNA UASR1 聯(lián)合檢測診斷胰腺癌的AUC為0.945，這提示聯(lián)合檢測對胰腺癌的診斷效能較高。此外，本研究結果顯示miR-144 的表達水平與患者淋巴結轉移、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、血管侵犯及TNM 分期有關，且miR-144 可以作為胰腺癌預后預測的有效指標。

綜上所述，胰腺癌組織中l(wèi)ncRNA UASR1 表達上調，miR-144 表達下調，兩者對胰腺癌的診斷和預后預測具有一定的價值。今后本課題組將檢測胰腺癌患者血清lncRNA UASR1 和miR-144 的表達水平，判斷兩者是否可以作為胰腺癌早期診斷的血清標志物，并進一步探究兩者在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展中的分子機制。