劉穎文?張玉鑫?閆露露?韓春曉?李海波

【摘要】目的 分析1個(gè)指甲-髕骨綜合征（NPS）家系的臨床及遺傳學(xué)特點(diǎn)，為家系的醫(yī)學(xué)遺傳咨詢和再生育指導(dǎo)提供依據(jù)。方法 對(duì)先證者及父母DNA行全外顯子組測(cè)序（WES），并對(duì)家系進(jìn)行Sanger測(cè)序和生物信息學(xué)驗(yàn)證。以“指甲-髕骨綜合征”及“產(chǎn)前診斷”的中英文為檢索詞，對(duì)以下數(shù)據(jù)庫截至2022年12月收錄的論文進(jìn)行檢索：PubMed、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)服務(wù)系統(tǒng)（SinoMed）、CNKI、萬方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫，收集并分析檢索到的NPS患者資料。結(jié)果 先證者外周血及胎兒流產(chǎn)組織均存在LMX1B基因c.736C>T （p.Arg246*） 雜合變異，遺傳自父親。該突變?yōu)橐阎闹虏⌒宰儺?。?jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，246位氨基酸在不同物種間高度保守，p.Arg246*變異改變了蛋白空間結(jié)構(gòu)，影響蛋白功能。檢索文獻(xiàn)后收集到6例產(chǎn)前診斷為NPS的病例，均經(jīng)超聲檢查和（或）分子遺傳學(xué)分析明確診斷。結(jié)論 LMX1B基因的c.736C>T雜合變異為該NPS家系的致病原因。

【關(guān)鍵詞】指甲-髕骨綜合征；LMX1B基因；全外顯子組測(cè)序

Genetic analysis of a pedigree with nail-patella syndrome and literature review Liu Yingwen，Zhang Yuxin，Yan Lulu，Han Chunxiao， Li Haibo. Center for Integrated Prevention and Treatment of Birth Defects， Ningbo Women and Childrens Hospital， Ningbo 315000， China?Corresponding author， Li Haibo， E-mail： lihaibo-775@163.com

【Abstract】Objective To analyze the clinical and molecular genetic features in one pedigree with nail-patella syndrome（NPS）， and provide evidence for genetic counseling and reproductive guidance for this family. Methods Whole-exon sequencing （WES）was performed to detect the gene variant of the proband and the whole family. Candidate variants were verified by Sanger sequencing and bioinformatic analysis. Using the key words of “nail-patella syndrome”and “prenatal diagnosis/antenatal diagnosis” as the searching words in both Chinese and English，relevant literatures were searched from PubMed， SinoMed， CNKI， Wanfang Data and Chongqing VIP databases up to December， 2022. Clinical data of NPS cases were collected and analyzed. Results The proband and aborted fetus carried a heterozygous variant c.736C>T （p.Arg246*） of the LMX1B. The same heterozygous variant was found in father rather than in mother. This variant has been proven to be pathogenic. Bioinformatic analysis predicted that the 246th amino acid was highly conserved among different species and p.Arg246* variant altered the structure and function of LMX1B protein. According to literature review， six cases of NPS confirmed by prenatal diagnosis were searched. All cases were diagnosed by ultrasound and/or molecular genetic analysis. Conclusion The heterozygous variant c.736C>T （p.Arg246*） of LMX1B gene is the pathogenic mutation in this NPS pedigree.

【Key words】Nail-patella syndrome； LMX1B； Whole-exon sequencing

指甲-髕骨綜合征（NPS）又稱為遺傳性骨甲發(fā)育不良，是一種因LMX1B基因突變導(dǎo)致的常染色體顯性遺傳病，以指甲畸形、髕骨缺失或發(fā)育不全、肘部和髂骨背側(cè)發(fā)育不良、腎病和成人青光眼為特征［1］。該病極為罕見，臨床表型變異度大，容易漏診或誤診。本研究對(duì)1個(gè)NPS家系進(jìn)行了基因測(cè)序和遺傳學(xué)分析，以明確其致病原因，并檢索國內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析。

對(duì)象與方法

一、NPS一家系臨床資料的收集

本科于2021年5月17日診治了1個(gè)NPS家系，收集并分析該家系病史、實(shí)驗(yàn)室檢查及治療等資料。本研究獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（EC2010-014）。

二、該家系的分子遺傳學(xué)分析

抽取先證者及父母外周血行家系及胎兒流產(chǎn)組織全外顯子測(cè)序和Sanger測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)變異結(jié)果行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與蛋白結(jié)構(gòu)分析。

1. DNA提取

采集家系成員外周血及胎兒流產(chǎn)組織，采用QLAGEN QIAamp DNA Mini Kit試劑盒（QIAGEN，德國），提取基因組DNA。將所提取的DNA應(yīng)用微量紫外分光光度計(jì)Nano Drop2000 （Thermo Fisher Scientific，美國）測(cè)定濃度，合格后凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.全外顯子組捕獲測(cè)序檢測(cè)

以受檢者的基因組DNA為檢測(cè)材料，利用Roche KAPA HyperExome人全外顯子組芯片捕獲試劑盒（Roche，瑞士）構(gòu)建文庫，使用MGISEQ-2000（華大基因公司，中國）測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行變異檢測(cè)。人類基因組參考序列版本選擇UCSC hg19人類參考基因組。根據(jù)2015年頒布的美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南，評(píng)判變異的致病性［2］。

3.變異位點(diǎn)的Sanger測(cè)序驗(yàn)證

使用Premier 5.0軟件針對(duì)LMX1B基因（NM_

002316.3）c.736C>T位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物， 上游引物序列為CCTTCATCACAGGCCGGGTTGT， 下游引物序列為ACGGGGAGATGGTGGGTTTAGG， 對(duì)家系基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為370 bp。PCR產(chǎn)物通過ABI3500DX genetic Analyzer（Thermo Fisher Scientific，美國）進(jìn)行測(cè)序［3-7］。

4.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與蛋白結(jié)構(gòu)分析

在UCSC網(wǎng)站（http：//www.genomaize.org/）上查詢LMX1B蛋白在不同物種間的保守性。在alphafold網(wǎng)站（https：//alphafold.ebi.ac.uk/）下載合適的人類蛋白結(jié)構(gòu)模型［O60663 （LMX1B_HUMAN）］，采用PyMOL2.5軟件預(yù)測(cè)變異對(duì)蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響。

三、文獻(xiàn)檢索

以“指甲-髕骨綜合征”“產(chǎn)前診斷”“nail-patella syndrome”“prenatal diagnosis/antenatal diagnosis”為檢索詞，對(duì)以下數(shù)據(jù)庫截至2022年12月收錄的論文進(jìn)行檢索：PubMed、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)服務(wù)系統(tǒng)（SinoMed）、CNKI、萬方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫，收集并分析檢索到的NPS患者資料。

結(jié)果

一、NPS一家系的病歷資料

1.入院主訴及檢查

孕婦，39歲，孕3產(chǎn)1，孕23+2周時(shí)因“外院產(chǎn)前超聲檢查提示胎兒雙足內(nèi)翻”于2021年5月12日到本院產(chǎn)前診斷門診就診，復(fù)查產(chǎn)科超聲提示胎兒雙足內(nèi)翻，見圖1A。臨床醫(yī)師推薦患者于2021年5月17日到本科就診。孕婦曾生育1女，現(xiàn)7歲，體格檢查發(fā)現(xiàn)其行走姿勢(shì)呈“外八字”，雙手指甲發(fā)育不良，發(fā)育不良程度由拇指至小指依次減輕，大拇指指甲缺失，雙足指甲發(fā)育尚可，見圖1B，該患兒在宮內(nèi)超聲檢查時(shí)即已發(fā)現(xiàn)“雙足內(nèi)翻”，當(dāng)時(shí)向臨床醫(yī)師咨詢后，孕婦及家屬?zèng)Q定繼續(xù)妊娠?；純河?018年3月16日足月順產(chǎn)娩出，出生時(shí)其雙足內(nèi)翻，余未見明顯異常。基于當(dāng)時(shí)基因測(cè)序技術(shù)普及率不高，故未行基因檢測(cè)。患兒出生1個(gè)月曾于外院行雙足內(nèi)翻矯正手術(shù)，效果尚可，但行走姿勢(shì)仍呈“外八字”。詳詢家系成員情況，患兒父親存在與女兒相似的雙手指甲異常表現(xiàn)，且雙手手指存在因近端關(guān)節(jié)過度拉伸和遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)過度屈曲而形成的“天鵝頸樣”畸形，左手無名指、右手食指中指及無名指末節(jié)指間關(guān)節(jié)指紋消失，見圖1C。家系成員發(fā)病情況見圖1D。由于年限、家庭經(jīng)濟(jì)等多方面原因，該家系的部分相關(guān)資料丟失，信息不全。

2.診斷及確診過程

結(jié)合家系患者現(xiàn)有表型，并查閱骨骼異常文獻(xiàn)資料，疑診胎兒患NPS，經(jīng)咨詢后，孕婦及家屬?zèng)Q定終止妊娠，流產(chǎn)胎兒外觀顯示雙足姿勢(shì)異常。繼續(xù)采集家系成員外周血及胎兒流產(chǎn)組織行全外顯子測(cè)序及Sanger測(cè)序驗(yàn)證，以明確遺傳學(xué)病因。所有受檢者對(duì)上述檢測(cè)知情并簽署知情同意書。

3.全外顯子測(cè)序及Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

家系全外顯子測(cè)序及Sanger驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)先證者與流產(chǎn)胎兒組織均存在LMX1B基因第4號(hào)外顯子的c.736C>T （p.Ar g246*） 雜合突變，遺傳自表型異常的父親，見圖1E。依據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南，該突變?yōu)橹虏⊥蛔儯ˋCMG： PVS1+PM2+PP4）。經(jīng)檢索Human Gene Mutation Database數(shù)據(jù)庫，確定為已報(bào)道的致病突變。

4.生物學(xué)信息預(yù)測(cè)

在UCSC網(wǎng)站（http：//www.genomaize.org/）上查詢LMX1B蛋白第246位氨基酸位點(diǎn)在人類、鼠、狗、雞、斑馬魚等物種間的蛋白保守性，結(jié)果提示LMX1B蛋白第246位氨基酸位點(diǎn)在不同物種間高度保守，見圖1F。c.736C>T （p.Arg246*）突變導(dǎo)致LMX1B蛋白翻譯提前終止，生成截短的LMX1B蛋白，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)提示，p.Arg246*突變改變了蛋白空間結(jié)構(gòu)，影響蛋白功能，見圖1G～H。

二、文獻(xiàn)檢索結(jié)果

收集到產(chǎn)前診斷為NPS的病例共6例，均經(jīng)超聲檢查和（或）分子遺傳學(xué)分析明確診斷，6例的臨床資料見表1。

討論

NPS的典型臨床表現(xiàn)為涉及指甲、骨盆、膝關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)的四聯(lián)畸形，除此之外，還存在眼部和腎臟受累的表現(xiàn)［1］。指甲缺失/發(fā)育不良是NPS最恒定的特征，幾乎所有的患者均存在指甲受累的情況。骨骼異常主要包括骨關(guān)節(jié)的發(fā)育不良及脫位、足部?jī)?nèi)/外翻畸形。其中，手指關(guān)節(jié)可因近端關(guān)節(jié)過度拉伸和遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)過度屈曲而形成“天鵝頸樣”畸形；髂骨后部形成的三角形骨隆起物稱為“髂骨角”，被認(rèn)為是NPS的特征性病變。眼部異常較為少見，表現(xiàn)為青光眼、視網(wǎng)膜色素異常等。腎臟病變是NPS最嚴(yán)重的表現(xiàn)，可從輕微血尿、蛋白尿發(fā)展到腎衰竭。由于NPS臨床表現(xiàn)變異度大，癥狀在同一家庭成員之間也可能不盡相同，因此臨床醫(yī)師需告知患者各類疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的可能性，完善相關(guān)檢查，并定期檢測(cè)。

1998年，Vollrath等［3］通過測(cè)序技術(shù)確定了LMX1B基因功能缺損為NPS的致病原因。LMX1B位于9q34，包含8個(gè)外顯子，編碼LIM同源結(jié)構(gòu)域蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子，是一種由379個(gè)氨基酸組成的高度保守蛋白質(zhì)，對(duì)維持背側(cè)肢體、腎小球基底膜、眼睛前段和神經(jīng)元的發(fā)育起重要作用［4］。該蛋白質(zhì)主要包括2個(gè)結(jié)合DNA的LIM結(jié)構(gòu)域（LIM-A、LIM-B）及一個(gè)結(jié)合蛋白的同源結(jié)構(gòu)域。目前已經(jīng)報(bào)道了180多種（https： //www.hgmd.cf.ac.uk/ac/search.php）LMX1B致病突變，80%的突變位于LIM域，20%位于同源域，主要包括單核苷酸變異和基因缺失/插入。盡管NPS的腎外癥狀沒有明顯的基因型-表型關(guān)聯(lián)，但據(jù)報(bào)道，與攜帶LIM域突變的患者相比，具有同源域內(nèi)LMX1B突變的患者出現(xiàn)蛋白尿的頻率明顯增高［5］。

本研究通過全外顯子測(cè)序及Sanger測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)先證者、先證者父親和流產(chǎn)胎兒均攜帶相同的LMX1B基因c.736C>T（p.Arg246*）雜合突變，為已知的致病突變，且先證者的臨床表型也與NPS的典型表型一致。有研究者曾報(bào)道過1例存在c.736C>T新發(fā)雜合突變的患者，其具有典型的NPS臨床表型：指甲發(fā)育不良，肘部僵硬、伸展受限，髕骨及髂骨畸形，眼部及腎臟未見異常［6］。c.736C>T位于LMX1B基因同源結(jié)構(gòu)域，氨基酸保守性分析顯示246位氨基酸在不同物種中高度保守（http：//www.genomaize.org/）。該突變使246位的精氨酸變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致截短蛋白形成，影響LMX1B蛋白功能，從而引起NPS的相關(guān)癥狀。Sasidharan等［7］在1個(gè)7日齡的NPS男性患兒中發(fā)現(xiàn)LMX1B的4號(hào)外顯子c.691C>T， （p. Arg231Ter） 無義突變，該突變也位于LMX1B基因同源結(jié)構(gòu)域，這也再次說明了LMX1B基因同源結(jié)構(gòu)域?qū)S持其蛋白功能的重要性。

既往報(bào)道的NPS病例大多數(shù)于出生后才被診斷，產(chǎn)前診斷為NPS的僅6例［6，8-12］。其中5例產(chǎn)前超聲檢查均提示足內(nèi)翻/肢體運(yùn)動(dòng)受限/長(zhǎng)骨畸形等骨骼異常，并且均有家族史，1例因產(chǎn)前絨毛基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LMX1B的c.750+1G>A突變，故直接于孕15周引產(chǎn)。Drut等［13］發(fā)現(xiàn)了1例18周自然流產(chǎn)胎兒的腎臟出現(xiàn)病理變化，腎小球超微結(jié)構(gòu)檢查顯示其腎小球和系膜毛細(xì)血管壁增厚，基底膜不規(guī)則增厚，由此他們提出通過宮內(nèi)腎活組織檢查輔助產(chǎn)前診斷NPS。但鑒于實(shí)施胎兒宮內(nèi)腎穿刺存在高風(fēng)險(xiǎn)，因此宮內(nèi)腎活組織檢查未被用于診斷NPS。Feingold等［8］曾提出可在孕36周時(shí)通過超聲檢查顯示髂骨角來診斷胎兒NPS。上述分析顯示，NPS患者孕中期超聲檢查顯示足內(nèi)翻/肢體運(yùn)動(dòng)受限/長(zhǎng)骨畸形等骨骼異常概率較高，因此產(chǎn)前超聲檢查顯示骨骼異常合并家族指甲及骨骼異常疾病史時(shí)，臨床醫(yī)師需提高警惕，及時(shí)進(jìn)行產(chǎn)前診斷以明確是否為NPS。目前NPS的診斷方法為依據(jù)患者表型聯(lián)合基因檢測(cè)，推薦全外顯子測(cè)序檢測(cè)方法。如果基因測(cè)序不能診斷，但臨床懷疑NPS并觀察到顯性遺傳模式，則可以考慮是否存在因LMX1B基因倒置而干擾LMX1B基因功能的可能性［14］。在治療方面，NPS暫無有效的治療方法，只能對(duì)癥支持治療，骨骼問題可選擇物理治療或者手術(shù)，腎臟異?？墒褂肁CEI控制血壓和減緩蛋白尿的進(jìn)展，并應(yīng)進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)。

本研究通過全外顯子測(cè)序和Sanger測(cè)序技術(shù)明確了LMX1B基因c.736C>T（p.Arg246*）雜合突變?yōu)樵摷蚁档闹虏≡颍S富了中國人群LMX1B基因突變所致的NPS突變譜和表型譜，為家系的遺傳咨詢和再生育指導(dǎo)提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2022-08-23）

（本文編輯：洪悅民）