張永健,郭學海*,高秀鳳,王 斌,趙宏陽

(1.開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院 普外科,河北 開灤063103;2.開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院 消化內(nèi)科,河北 開灤063103)

原發(fā)性胃癌是起源于胃黏膜的癌癥,是臨床常見的惡性腫瘤,盡管其發(fā)病率逐漸下降,胃癌仍然是全世界癌癥相關死亡的最常見原因之一[1]。幽門螺桿菌感染是胃癌的主要危險因素,新分子有助于胃癌的診斷和降低死亡率,大多數(shù)被充分研究的分子是由胃上皮表達的組織蛋白生物標記物,與細胞周期調(diào)控和細胞凋亡調(diào)控相關[2-3]。S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase associated protein 2,SKP2)是細胞周期蛋白A-CDK2 S期激酶的基本成分[4],它主要在S期特異性識別磷酸化細胞周期素依賴的蛋白激酶抑制物(Cyclin dependent protein kinase inhibitor,p27kip1)[5],并參與了多種癌癥的發(fā)生發(fā)展和細胞凋亡調(diào)控,是腫瘤治療的新靶點[6-7]。研究表明Skp2和Slug在侵襲性前列腺癌中共表達,并受到去甲?；铚囊种?在前列腺癌細胞的凋亡中發(fā)揮調(diào)控作用[8],Skp2蛋白在宮頸癌組織中的表達率高于癌旁組織,其表達與臨床分期、惡性程度、淋巴結轉移、血管浸潤和間質(zhì)浸潤呈正相關[9],也有研究通過小鼠實驗證實SKP2和p27Kip1可以通過靶向MEK/ERK途徑增強CDK4/6抑制劑的細胞抑制作用[10],但Skp2和p27Kip1在原發(fā)性胃癌中的表達和對胃癌細胞增殖凋亡的作用尚不清晰,因此本研究入組臨床原發(fā)性胃癌患者,分析癌組織和癌旁組織中Skp2和p27Kip1的表達水平,并通過細胞學實驗探究Skp2和p27Kip1對胃癌細胞增殖、存活、早期凋亡和晚期凋亡的作用,為Skp2和p27Kip1在原發(fā)性胃癌中發(fā)揮的作用提供分子機制和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2018年12月至2021年12月開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院資料完整并經(jīng)臨床、病理證實的原發(fā)性胃癌患者63例,獲取患者癌組織和癌旁組織。本實驗中所有患者均簽署知情同意書并通過開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院倫理委員會審核。

人胃癌細胞株SGC-7901購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 主要試劑及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基,胎牛血清FBS和青鏈霉素購于購于美國Gibico公司;T25細胞培養(yǎng)瓶、離心管等實驗耗材購于美國Corning公司;NC質(zhì)粒和si-Skp2質(zhì)粒購于廣州Ribobio公司;Skp2和p27Kip1引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成。lipofectamine3000(貨號: L3000015)購于美國invitrigen 公司,Cell Counting Kit-8(CCK8,貨號Cat.No.:HY-K0301)細胞增殖及毒性檢測試劑盒購于美國MCE公司;細胞凋亡試劑盒7-ADD/Annexin V(貨號:KGA)購于南京凱基生物公司,qPCR儀購于美國ABI公司,FACSVia流式細胞儀購于美國BD公司,PTC-3500全波長酶標儀購于北京普天新橋技術有限,Western blot電泳儀購于美國bio-rad公司。

1.3 方法

1.3.1qPCR檢測胃癌組織和胃癌旁組織中Skp2和p27Kip1mRNA表達

對癌組織和癌旁組織在液氮中進行研磨,采用Trizol、Titan One Tube RT-PCR和SYBR Green PCR Master Mix Kit PCR試劑盒進行總mRNA提取、逆轉錄并進行Skp2和p27Kip1的表達水平的qPCR,所有操作避免RNA酶污染。使用ABI 7500系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR,預變性95 ℃ 10 min,變性95 ℃ 10 s,退火60 ℃25 s,延伸72 ℃ 205 s,38個循環(huán), Skp2、p27Kip1和GAPDH引物序列見表1,使用GAPDH作為內(nèi)參,以2-△△Ct計算Skp2和p27Kip1相對表達量。

表1 qPCR檢測中不同基因的引物序列

1.3.2細胞培養(yǎng)及轉染條件

SGC-7901培養(yǎng)條件:RPIM1640培養(yǎng)液(內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素100 μg/ml、鏈霉素100 μg/ml),置CO2培養(yǎng)箱內(nèi),5%CO2,37℃靜置培養(yǎng);細胞轉染:用胰酶消化細胞后重選,嚴格按照轉染試劑盒l(wèi)ipo3000說明將NC和Skp2質(zhì)粒進行轉染,轉染6～8 h后更換成完全培養(yǎng)基重新加入完全培養(yǎng)基,置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng),48 h后用于各組實驗。

1.3.3CCK8法檢測人胃癌細胞SGC-7901細胞活力

以CCK-8測定細胞活力,嚴格按照CCK8試劑盒說明進行操作,將細胞轉染質(zhì)粒后以2×103的密度接種到96孔板中,分別在37℃下培養(yǎng)24 h、48 h和72 h,向每孔加入10 μl CCK-8 溶液(此過程避免孔中生成氣泡以避免影響OD值的讀數(shù)),將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h,用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度。

1.3.4細胞凋亡實驗

將生長對數(shù)期的SGC-7901細胞胰酶消化后收集全部細胞,PBS緩沖液重懸細胞,嚴格按照細胞凋亡7-ADD/annexin V試劑盒進行凋亡實驗,避光孵育20 min,PBS清洗1遍,200 μl PBS重懸細胞,流式細胞儀進行細胞凋亡分析,所有操作均在冰上避光完成,各組實驗重復3次。

1.3.5Western blot 檢測蛋白表達

將各組狀態(tài)良好的SGC-7901細胞1 ml RIPA蛋白裂解液冰上提取細胞總蛋白,使用BCA法測定蛋白濃度。加入5×SDS的蛋白上樣緩沖液煮沸后備用。將樣品分別加入不同的泳道進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,濃縮膠電壓和分離膠電壓分別為80V 10 min,120V 1.5 h,后轉至PVDF膜,用5%BSA封閉。加入特異性一抗Anti-SKP2 antibody(1∶200,ab183039,abcam,英國),Anti-p27 KIP 1 antibody(1∶5 000,ab32034,abcam,英國)和GAPDH(1∶10 000,ab8245,abcam,英國)于4℃冰箱過夜。TBST洗膜3次,每次10 min,加入特異性的羊抗兔二抗(1∶2 000),孵育1 h。TBST洗膜3次,每次10 min,采用ECL化學發(fā)光液曝光顯影,使用Photoshop圖像分析軟件系統(tǒng)進行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較

本研究共入組胃癌患者63例,平均年齡57.45±6.31歲,患者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),臨床一般資料詳見表2。

表2 63例患者一般臨床資料的比較

2.2 Skp2和p27Kip1在癌組織和癌旁組織中mRNA的表達比較

通過qPCR法檢測癌組織和癌旁組織Skp2和p27Kip1mRNA表達水平,結果如圖1所示,與癌旁組織相比,癌組織中Skp2mRNA表達水平顯著升高,p27Kip1mRNA表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 Skp2和p27Kip1在胃癌組織和癌旁組織中mRNA的表達比較

2.3 si-Skp2對人胃癌細胞SGC-7901細胞活力的影響

通過CCK8實驗分析si-Skp2對人胃癌細胞SGC-7901活力的影響,結果表明與對照組相比,si-Skp2組胃癌細胞SGC-7901細胞活力出現(xiàn)顯著下降,具體表現(xiàn)為24 h、48 h、72 h的吸光度分別顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表3。

表3 Skp2和p27Kip1對人胃癌細胞SGC-7901細胞活力的影響

2.4 si-Skp2對人胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響

通過流式細胞實驗分析si-Skp2對胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響,如圖2,結果表明與對照組相比,si-Skp2組細胞存活顯著降低、細胞晚期凋亡顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而細胞早期凋亡沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 Skp2和p27Kip1對人胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響

2.5 si-Skp2對p27Kip1蛋白表達的影響

如圖3通過Western blot 檢測各組細胞Skp2和p27Kip1蛋白變化,結果表明與對照組相比,si-Skp2組Skp2蛋白表達水平顯著降低,p27Kip1蛋白表達水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖3 si-Skp2對p27Kip1蛋白表達的影響

3 討論

原發(fā)性胃癌一般起源于胃黏膜細胞,由于飲食結構的改變、工作壓力增大以及幽門螺桿菌的感染等原因,胃癌呈現(xiàn)年輕化傾向[11]。胃癌可發(fā)生于胃的任何部位,其中半數(shù)以上發(fā)生于胃竇部,胃大彎、胃小彎及前后壁均可受累。絕大多數(shù)胃癌屬于腺癌,早期無明顯癥狀,最主要的癥狀即為腹痛,其預后不良并伴有轉移,是導致癌癥死亡的主要原因[12]。不同患者的腫瘤特征不同,不同的患者存在不同的腫瘤微環(huán)境[13]。有研究證實原發(fā)性胃癌中伴隨著多種基因的調(diào)控,通過對臨床全基因組RNA-seq數(shù)據(jù)分析證實原發(fā)性胃癌患者腫瘤內(nèi)具有異質(zhì)性,多種細胞周期調(diào)控和細胞凋亡調(diào)控基因如Skp2、ERBB2、CLDN11和CDK12發(fā)揮重要作用[14]。有研究根據(jù)Kaplan-Meier生存分析和Cox比例風險回歸分析證實胃癌患者中細胞的增殖、細胞周期G1/S轉換與患者的不良預后相關[15]。Skp2是一種能與S期激酶cyclinA-CDKI相互作用的蛋白,Skp2的表達水平在G0/G1 期降低,在S期表達增加[16]。Skp2的表達受轉錄及轉錄后水平雙重調(diào)節(jié),與在不同類型的細胞中起主導作用的調(diào)節(jié)機制不同,Skp2能特異性識別磷酸化底物并介導其泛素化降解,調(diào)節(jié)p27Kip1等細胞周期調(diào)控因子[17]。本研究通過qPCR證實在不同病理分期、不同轉移程度、不同年齡的患者中,均出現(xiàn)了顯著的Skp2 高表達,而p27Kip1顯著低表達的現(xiàn)象,這提示出Skp2 和 p27Kip1在胃癌進展中可能發(fā)揮重要作用,并且在不同類型的胃癌患者中具有普遍性,有望成為的胃癌早期診斷分子標志物。

細胞增殖和細胞凋亡是生命的基本現(xiàn)象,可以維持體內(nèi)細胞數(shù)量動態(tài)平衡。在胚胎的發(fā)育、機體衰老和病變的細胞中發(fā)揮調(diào)控作用,保證了機體的健康。細胞增殖和細胞凋亡受多種基因調(diào)控[18-19],細胞的異常增殖和凋亡失控會引發(fā)癌癥等疾病,研究表明Skp2在許多人類癌癥中也過度表達,Skp2可以靶向磷酸化p27進行蛋白酶體降解,對多種細胞生長、凋亡發(fā)揮直接調(diào)控作用,因此Skp2被認為是癌基因和重要的藥物靶點[20]。本研究通過細胞學實驗證實敲除Skp2后,胃癌細胞的增殖能力顯著降低,細胞存活顯著降低,細胞晚期凋亡比例顯著增加,Western blot 結果證實敲除Skp2后,胃癌細胞的P27Kip表達顯著上升,由此可見skp2可通過p21Kip1對胃癌細胞的增殖和凋亡發(fā)揮調(diào)控作用。

綜上,本研究證實在原發(fā)性胃癌患者中Skp2高表達、p21Kip1低表達,有望作為早期診斷的生物標志物,并且Skp2可以通過p27Kip1抑制人胃癌細胞活性,降低細胞的增殖能力,誘導胃癌細胞晚期凋亡。本研究可以進一步擴大臨床樣本量,通過ROC曲線等分析,Skp2和p27Kip1可以作為早期診斷或者預測胃癌患者的生物學標志物,為臨床診斷和治療提供新思路。