宋伶俐,李密陽(yáng),馬琳琳*

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科,吉林 吉林132011;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科,吉林 長(zhǎng)春133033)

近年來(lái),隨著激素、廣譜抗生素、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用,真菌引起的血流感染日漸增多。念珠菌是真菌血流感染最常見(jiàn)的病原菌,并且真菌感染比細(xì)菌感染死亡率更高,治療效果也相對(duì)更差[1]。為了降低血流感染的發(fā)病率和死亡率,早期有針對(duì)性的抗菌藥物治療是關(guān)鍵,故臨床對(duì)真菌的快速準(zhǔn)確鑒定成為目前迫切解決的問(wèn)題。最近幾年病毒感染繼發(fā)肺部感染入住重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)的患者,進(jìn)而繼發(fā)性合并真菌性敗血癥也有所增加,這種繼發(fā)感染導(dǎo)致了預(yù)后不良和病死率的增加。另有研究顯示,致病真菌的種類也有所增加,故臨床對(duì)真菌引起的血流感染的快速診斷至關(guān)重要[2]。

臨床實(shí)驗(yàn)室的微生物鑒定依賴于傳統(tǒng)生化反應(yīng)和基因測(cè)序技術(shù)等,特點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)或成本高?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF MS)的發(fā)展,引入了一種快速簡(jiǎn)單高效成本低的方法,改變了微生物的常規(guī)鑒定方法[3]。質(zhì)譜法(VITEK MS)是基于MALDI-TOF技術(shù),用于臨床分離的細(xì)菌、酵母樣真菌、絲狀真菌等的快速鑒定。本研究將血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后采用培養(yǎng)后質(zhì)譜法、分離膠處理后質(zhì)譜法,培養(yǎng)后顯色法和直接顯色法,4種方法進(jìn)行鑒定并進(jìn)行對(duì)比研究,評(píng)價(jià)了這些方法在臨床應(yīng)用中的價(jià)值,為臨床真菌鑒定選取合適方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2022年1月至2022年6月北華大學(xué)附屬醫(yī)院無(wú)菌部位培養(yǎng)的念珠菌共150株。包括白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、葡萄牙念珠菌、新生隱球菌。菌株為ITS測(cè)序確認(rèn)菌株。真菌血流感染采用建模方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑和儀器

全自動(dòng)血培養(yǎng)儀(美國(guó)BD公司);含樹(shù)脂需氧血培養(yǎng)瓶(美國(guó)BD公司);甲酸、乙腈(法國(guó)梅里埃);血瓊脂平板和沙保弱瓊脂平板(鄭州安圖);Vitek MS質(zhì)譜儀(法國(guó)梅里埃);分離膠促凝管(INSEPACK)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

白色念珠菌ATCC14053,近平滑念珠菌ATCC22019。

1.4 真菌建模方法

將白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等配制成0.5 麥?zhǔn)蠞舛鹊木?取菌液1 ml注入到需氧培養(yǎng)瓶中,取8 ml羊血注入瓶中,放入血培養(yǎng)儀中進(jìn)行增菌培養(yǎng),儀器報(bào)陽(yáng)后用相應(yīng)方法進(jìn)行鑒定。

1.5 血培養(yǎng)常規(guī)鑒定

血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)后采用分離膠處理方法進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,記錄結(jié)果;轉(zhuǎn)種沙氏培養(yǎng)基培養(yǎng)孵育18～24 h后質(zhì)譜鑒定,記錄結(jié)果;轉(zhuǎn)種顯色培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)孵育18～24 h后,記錄顯色培養(yǎng)基的結(jié)果;轉(zhuǎn)種沙氏培養(yǎng)基養(yǎng)孵育18～24 h,培養(yǎng)后菌落再進(jìn)行顯色培養(yǎng)18～24 h后,記錄顯色結(jié)果。

1.6 分離膠促凝管預(yù)處理血培養(yǎng)瓶直接質(zhì)譜鑒定[4]

1.6.1血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)容物,抽取5 ml至普通分離膠促凝管,900 r/min水平室溫離心10 min,棄去上清,見(jiàn)分離膠表層灰白色菌體富集物。

1.6.2500 μl無(wú)菌注射用水,加入1.5 ml離心管中備用,挑取上述灰白色菌體富集物,加入500 μl無(wú)菌水中,12 000 r/min,離心2 min,用無(wú)菌槍頭吸取上清棄去,加入500 μl無(wú)菌水懸浮并充分振蕩混勻,12 000 r/min,離心2 min,留沉淀重復(fù)洗滌步驟1次。

1.6.3取1份菌體富集物,棄去上清,加入500 μl 75%乙醇(依菌量定)懸浮并振蕩混勻,12 000 r/min,離心2 min。

1.6.4用移液器將上清(乙醇)吸取并棄去,12 000 r/min,離心2 min。

1.6.5室溫開(kāi)蓋放置數(shù)分鐘晾干去除乙醇(殘留乙醇會(huì)影響質(zhì)譜峰,盡量完全干燥),向晾干的離心管中加入20 μl 30%甲酸(依菌量而定)振蕩混勻,再加入等量乙腈,12 000 r/min,離心2 min。

1.6.6取離心后的上清液1 μl點(diǎn)至靶板并室溫晾干,待樣本干燥后加入1 μl基質(zhì)液,進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn),以P<0.05有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯色培養(yǎng)鑒定結(jié)果

血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)后,直接用顯色培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種培養(yǎng)和用沙氏培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種后再顯色鑒定,得出的結(jié)果是一致的。顯色培養(yǎng)基僅能鑒定4種常見(jiàn)念珠菌,故實(shí)驗(yàn)中選用的20株不常見(jiàn)真菌無(wú)法給出鑒定結(jié)果,顯色鑒定與基因測(cè)序結(jié)果一致的共有101株,鑒定準(zhǔn)確率為77.69%(101/130)。顯色結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果不一致發(fā)生率最高的是熱帶念珠菌,有12株與基因測(cè)序不同,達(dá)48%(12/25),其次依次是克柔念珠菌30%(3/10)、白色念珠菌15.56%(7/45)、光滑念珠菌14%(7/50)。

近平滑念珠菌在顯色培養(yǎng)中有7例顯色為紫色,誤認(rèn)為是光滑念珠菌,3株無(wú)色無(wú)法鑒定;葡萄牙念珠菌有4株顯紫色,誤認(rèn)為是光滑念珠菌,2株無(wú)色無(wú)法鑒定;白色念珠菌與熱帶念珠菌也可顯紫色,共14株誤認(rèn)為光滑念珠菌。新生隱球菌顯白色無(wú)法鑒定。見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)后顯色和直接顯色結(jié)果(株)

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)后,轉(zhuǎn)種沙氏培養(yǎng)基培養(yǎng)后質(zhì)譜,與基因測(cè)序的一致率是96.6%(145/150),有5株質(zhì)譜沒(méi)有給出鑒定結(jié)果。采用分離膠直接質(zhì)譜僅鑒定出7株真菌,與基因測(cè)序的一致率為4.67%(7/150)。1株光滑念珠菌錯(cuò)誤的鑒定為挪威畢赤酵母菌、1株克柔念珠菌無(wú)法鑒定;2株葡萄牙念珠菌有1株鑒定為釀酒酵母菌、1株無(wú)法鑒定;1株新生隱球菌無(wú)法鑒定。分離膠直接質(zhì)譜鑒定有143株無(wú)法鑒定無(wú)結(jié)果,原因主要為所得質(zhì)譜譜峰不夠。見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)后質(zhì)譜和分離膠后質(zhì)譜結(jié)果(株)

2.3 顯色鑒定與質(zhì)譜鑒定比較

分離膠直接質(zhì)譜其鑒定效率最高,出結(jié)果用時(shí)最短,但準(zhǔn)確率最低。培養(yǎng)后質(zhì)譜鑒定用時(shí)和直接顯色鑒定用時(shí)相同,但準(zhǔn)確率存在差異,并且P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)后顯色鑒定與直接顯色培養(yǎng)鑒定一致,準(zhǔn)確率無(wú)差異,但用時(shí)直接顯色鑒定要提前24 h。另外顯色鑒定無(wú)法給出少見(jiàn)菌和不典型顯色的菌株的鑒定結(jié)果。故4種方法比較,兼顧時(shí)間和準(zhǔn)確率最優(yōu)的方法為培養(yǎng)后質(zhì)譜鑒定。見(jiàn)表3。

表3 鑒定結(jié)果所用時(shí)間、準(zhǔn)確率比較

3 討論

全球流行的深部真菌感染,尤其是血流感染,以念珠菌為主,病死率非常高,ICU住院患者,病死率可高達(dá)40%[5]。新生隱球菌也是血流感染可見(jiàn)病原體之一[6]。病毒感染、激素、免疫抑制劑的使用也增加了ICU病人的感染風(fēng)險(xiǎn)。近期報(bào)道的阿薩西毛孢子菌引起的血流感染病死率可高達(dá)86%,其他真菌從45%～90%不等,病毒感染的病人,自身微生態(tài)失調(diào),增加了微生物易位的風(fēng)險(xiǎn),可能為病原體的主要來(lái)源[7]。真菌感染的高死亡率決定著其早期診斷的重要性,真菌血流感染診斷的現(xiàn)狀遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足臨床對(duì)于血流感染早期診斷的需求。而快速準(zhǔn)確的識(shí)別病原菌并且正確初始的抗生素治療,對(duì)于膿毒血癥尤為重要,早期適當(dāng)?shù)慕邮芸股刂委煹幕颊呖梢越档退劳雎什⒏纳婆R床預(yù)后。目前臨床上血培養(yǎng)仍然是診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)[8]。臨床微生物實(shí)驗(yàn)室真菌鑒定方式主要有顯色鑒定、手工鑒定、質(zhì)譜鑒定、儀器鑒定、分子生物學(xué)鑒定等方式,其中全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)和顯色鑒定為主要方法,有報(bào)道比較了質(zhì)譜和全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)真菌鑒定的一致性達(dá)80%[9],比較了手工鑒定和顯色鑒定的準(zhǔn)確率[10]。本研究比較了質(zhì)譜技術(shù)和顯色鑒定的一致性和準(zhǔn)確率,對(duì)真菌血流感染報(bào)陽(yáng)后直接顯色鑒定和分離膠處理后質(zhì)譜鑒定進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,質(zhì)譜鑒定優(yōu)于顯色鑒定,血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后經(jīng)分離膠處理直接質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確率還有待提高。

從本研究的結(jié)果可以看出,如果是無(wú)菌部位的真菌感染,尤其是血流感染,建議準(zhǔn)確鑒定到種,不建議采用顯色方法,因顯色方法的準(zhǔn)確率僅為77.69%,顯色中的錯(cuò)誤發(fā)生率最高的是熱帶念珠菌。其次依次是克柔念珠菌、白色念珠菌、光滑念珠菌,有很多其他念珠菌容易被錯(cuò)誤鑒定為光滑念珠菌。但值得注意的是顯色培養(yǎng)后的菌落并不影響質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確性[11]。采用培養(yǎng)后質(zhì)譜鑒定,對(duì)于酵母樣真菌的準(zhǔn)確率達(dá)96.6%,相比全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng),質(zhì)譜更加快速準(zhǔn)確,可提前24 h,對(duì)于罕見(jiàn)菌和少見(jiàn)真菌的鑒定準(zhǔn)確率也更高[12]。

本研究對(duì)血流感染報(bào)陽(yáng)后分離膠處理后直接鑒定對(duì)真菌鑒定提供了新思路,此方法1 h就可以鑒定出結(jié)果,但是準(zhǔn)確率太低,多數(shù)都無(wú)法鑒定出結(jié)果,原因?yàn)闊o(wú)法獲得譜峰,這可能由于真菌報(bào)陽(yáng)后不能達(dá)到質(zhì)譜所需菌量或者由于富集方法無(wú)法大量集菌,也可能由于真菌細(xì)胞壁較厚,破壁技術(shù)不夠完善,后續(xù)方法有待改進(jìn),可嘗試短時(shí)固相/液相培養(yǎng)方法進(jìn)行改進(jìn)[13],值得后續(xù)繼續(xù)研究。另外,血流感染后直接顯色鑒定培養(yǎng)與培養(yǎng)后顯色鑒定,其結(jié)果是一致的,對(duì)于沒(méi)有質(zhì)譜技術(shù)的醫(yī)院,為縮短鑒定時(shí)間不失為一種新思路,但由于顯色鑒定的準(zhǔn)確率不高,所以后續(xù)仍需用可靠方法鑒定到種,但可以為臨床提供初步診斷的證據(jù),作為一種基礎(chǔ)初步替代方法在縮短鑒定時(shí)間上也行之有效。

綜上所述,培養(yǎng)后質(zhì)譜鑒定法在時(shí)間和準(zhǔn)確性上為較優(yōu)方法,對(duì)于血流感染以及深部感染的真菌,可采用此方法,可為臨床的早期診斷提供依據(jù)。血流感染報(bào)陽(yáng)性后經(jīng)分離膠處理后利用質(zhì)譜技術(shù)直接進(jìn)行鑒定,此方法還有待進(jìn)一步研究,以便能夠?yàn)榕R床提供更加快速的可靠的鑒定方法。