錢玉磊 閆晉強 劉文睿 吳智明 謝大森 江彪

摘要：抗氧化（oxidation resistance，OXR）基因是含有TLDc結(jié)構(gòu)域的一類基因，能有效清除活性氧，在抗氧化過程中發(fā)揮著重要作用。基于葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫，從6個葫蘆科作物中共鑒定出37個OXR成員，其中冬瓜、西瓜、甜瓜、葫蘆和黃瓜均有6個成員，南瓜有7個成員。通過系統(tǒng)發(fā)育以及保守結(jié)構(gòu)域分析，將這些OXR成員分為 5個亞族：OXR1、OXR2、OXR3、OXR4和OXR5。OXR基因在染色體上呈不均勻分布，同一亞族OXR成員所編碼的氨基酸數(shù)、分子量、外顯子數(shù)、內(nèi)含子數(shù)以及保守基序的排列模式都極為相似，表明OXR基因具有高度保守性。順式作用元件分析結(jié)果顯示，OXR基因的啟動子區(qū)域含有多種順式作用元件以及MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點?；驈?fù)制分析發(fā)現(xiàn)，葫蘆科OXR2成員通過片段復(fù)制或全基因組復(fù)制發(fā)生了一定擴張，這些復(fù)制基因?qū)艿郊兓x擇。共線性分析結(jié)果顯示，在親緣關(guān)系較近的葫蘆科作物之間，OXR基因所在的共線性區(qū)塊較大。不同組織的表達譜分析結(jié)果顯示，葫蘆科OXR4成員有相似的表達模式，在葉片中表達量均較高；OXR2亞族內(nèi)復(fù)制基因出現(xiàn)了非對稱表達的現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：葫蘆科；OXR基因；保守結(jié)構(gòu)域；順式作用元件；生物信息學(xué)；表達譜；親緣關(guān)系

中圖分類號：S188；S642.01 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）08-0051-10

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31972403、32102406）；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中青年學(xué)科帶頭人項目（編號：R2020PY-JG003）；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀博士項目（編號：R2021YJ-YB2004）。

作者簡介：錢玉磊（1997—），男，河南鄭州人，碩士研究生，研究方向為蔬菜分子生物學(xué)。E-mail：qylei2022@163.com。

通信作者：江 彪，博士，研究員，研究方向為蔬菜遺傳育種與分子生物學(xué)。E-mail：jiangbiao@gdaas.cn。

植物受到脅迫刺激時，細胞內(nèi)的電子傳遞和氧化還原的動態(tài)平衡被破壞，導(dǎo)致細胞內(nèi)的氧由氧化態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)，從而產(chǎn)生過量的活性氧，造成蛋白質(zhì)、膜脂、DNA以及其他細胞組分嚴重損傷［1］。然而，活性氧也有對植物有利的一面，其可作為一種信號分子，協(xié)調(diào)細胞內(nèi)許多重要的信號傳導(dǎo)，如蛋白質(zhì)的修飾、基因表達和激素調(diào)節(jié)、協(xié)調(diào)適應(yīng)或傳遞防御反應(yīng)等［2-4］。植物體內(nèi)具有復(fù)雜的活性氧清除系統(tǒng)，主要包括保護酶系和抗氧化物質(zhì)，使體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與降解處于動態(tài)平衡，不對自身造成損傷［5］。

抗氧化（oxidation resistance，簡稱OXR）基因所編碼的蛋白質(zhì)含有保守結(jié)構(gòu)域TLDc［TBC （Tre2/Bub2/Cdc16），LysM （lysine motif），domain catalytic］，可以影響氧自由基清除基因的表達，從而降低細胞中活性氧水平［6］。近年來，在擬南芥基因組中已鑒定出6個具有TLDc保守結(jié)構(gòu)域的OXR基因家族成員，其中AtOXR2是一種線粒體蛋白，過表達AtOXR2可以提高擬南芥的光合作用效率，增強對氧化脅迫的耐受能力［7］。在蔬菜作物中，張夢云等基于十字花科基因組數(shù)據(jù)庫，對7種十字花科植物基因組中的抗氧化基因進行了鑒定和生物信息學(xué)分析［8］。

葫蘆科是世界上最重要的植物科之一，包含許多常見的蔬菜和瓜果，具有重要的經(jīng)濟價值。隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，黃瓜（Cucumis sativus）［9］、甜瓜（C. melo）［10］、西瓜（Citrullus lanatus）［11］、葫蘆（Lagenaria siceraria）［12］、南瓜（Cucurbita moschata）［13］、冬瓜（Benincasa hispida）［14］等葫蘆科作物先后完成了全基因組測序，為系統(tǒng)研究葫蘆科作物的抗氧化基因家族奠定基礎(chǔ)。本研究通過系統(tǒng)鑒定6個葫蘆科作物抗氧化基因家族，并開展生物信息學(xué)分析和不同組織的表達譜分析，為深入闡明葫蘆科作物OXR家族的基因功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 葫蘆科OXR成員的鑒定

從葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫（http：//cucurbitgenomics.org/）下載黃瓜、甜瓜、西瓜、葫蘆、南瓜和冬瓜的基因組信息文件，Pfam網(wǎng)站（https：//pfam.xfam.org/）下載TLDc保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型（PF07534），使用hmmsearch指令，搜索閾值<0.000 01，在葫蘆科6種作物的蛋白序列文件中進行搜索。以已報道的6個AtOXR基因家族成員的蛋白質(zhì)序列作為查詢序列［7］，與葫蘆科作物的所有蛋白質(zhì)序列進行BLASTP（檢索閾值<0.000 01）。將上述2種方法所鑒定到的候選葫蘆科OXR成員的蛋白序列提交至NCBI、Pfam和SMART數(shù)據(jù)庫，查詢結(jié)構(gòu)域特征，最后下載結(jié)果文件，并人為鑒定TLDc結(jié)構(gòu)域是否存在，最終確定葫蘆科OXR成員。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析、保守結(jié)構(gòu)域分析和物理化學(xué)性質(zhì)分析

利用MEGA11中的ClustalW（默認設(shè)置）比對鑒定出的37個葫蘆科OXR成員和6個AtOXR成員的蛋白質(zhì)序列，構(gòu)建Neighbor-Joining樹，使用 1 000 個重復(fù)進行 bootstrap分析。根據(jù)擬南芥的分類方法將葫蘆科OXR成員分類［7］，利用Evolview v3將分類結(jié)果及每個OXR成員的蛋白序列和TLDc 結(jié)構(gòu)域所在位置可視化［15］，利用在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測OXR成員的分子量（MW）和等電點（PI）。

1.3 葫蘆科OXR成員的染色體定位

根據(jù)相應(yīng)的基因組注釋文件，提取37個OXR成員的基因位置信息，然后使用MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）將其定位到相應(yīng)的染色體上。

1.4 保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

從基因組注釋文件中獲得OXR基因的外顯子和內(nèi)含子位置信息，將葫蘆科OXR成員和擬南芥OXR成員的蛋白質(zhì)序列提交MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/doc/meme.html），最大基序（motif）檢索數(shù)設(shè)置為15，利用CFVisual（https：//github.com/ChenHuilong1223/CFVisual）將結(jié)果可視化。

1.5 啟動子分析

提取每個OXR成員起始密碼子前2 500 bp序列，提交PlantCare網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），獲得順式作用元件信息，然后以 R 4.1.3的tidyverse和ggplot2函數(shù)繪制啟動子熱圖。

1.6 復(fù)制基因分析及選擇壓力分析

使用MCScanX［16］中的detect_collinearity_within_gene_families.pl分析6個葫蘆科物種內(nèi)的OXR復(fù)制基因?qū)σ约胺荗XR復(fù)制基因?qū)Γ缓筇崛∷袕?fù)制基因?qū)υ诨蚪M中的位置信息，并利用Circos軟件［17］將復(fù)制基因?qū)梢暬?/p>

利用Muscle軟件分別比對復(fù)制基因?qū)Φ陌被嵝蛄校缓笥肞araAT［18］將氨基酸序列比對引導(dǎo)對應(yīng)的編碼序列比對，進一步使用KaKs_Kaculator 2.0［19］計算復(fù)制基因?qū)Φ腒a（非同義替換率）/Ks（同義替換率），通過Ka/Ks的值來判斷基因在進化過程中受到的選擇壓力。

1.7 共線性分析

利用葫蘆科作物的基因組文件及基因組注釋文件，使用JCVI［20］進行6個葫蘆科物種間的OXR基因共線性分析。

1.8 葫蘆科OXR成員在不同器官組織的表達譜分析

從葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫下載冬瓜、南瓜（PRJNA385310）、甜瓜（PRJNA383830）、黃瓜（PRJNA80169）和葫蘆（PRJNA387615）的不同組織（根、莖、葉、花）的表達譜數(shù)據(jù)，分別以O(shè)XR1在根中的FPKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）值為基準，計算OXR成員在根、莖、葉、花的相對表達量，使用TBtools中的HeatMap［21］繪制熱圖，將結(jié)果可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 葫蘆科OXR基因家族成員的鑒定

根據(jù)TLDc的隱馬爾可夫模型（PF07534），使用hmmsearch指令在葫蘆科6種作物全基因組中共搜索到37個候選OXR成員基因。同時，利用同源BLAST方法鑒定到38個候選OXR成員基因。隨后，將2種方法鑒定到的候選成員的蛋白質(zhì)序列提交數(shù)據(jù)庫進行確認，結(jié)果表明，hmmsearch指令鑒定到的成員都含有TLDc保守結(jié)構(gòu)域，同源BLAST檢測出的38個成員包含hmmsearch指令鑒定到的37個成員，另外1個候選OXR成員不含有TLDc保守結(jié)構(gòu)域，因此將其去除。最終，在葫蘆科6種作物中共鑒定出37個OXR成員，其中冬瓜、黃瓜、西瓜、甜瓜和葫蘆均有6個成員，南瓜有7個成員。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育、保守結(jié)構(gòu)域和物理化學(xué)性質(zhì)分析

以葫蘆科37個OXR成員和擬南芥6個OXR成員的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可將葫蘆科OXR基因家族分為5個OXR亞家族，分別為OXR1亞族、OXR2亞族、OXR3亞族（AtOXR6歸入OXR3亞族）、OXR4亞族、OXR5亞族。葫蘆科6個作物在OXR1亞族、OXR3亞族、OXR4亞族和OXR5亞族均僅有1個成員。在OXR2亞族中，擬南芥僅有1個成員，而冬瓜、黃瓜、西瓜、甜瓜和葫蘆有2個成員，南瓜有3個成員。因此，相較于擬南芥，葫蘆科OXR2成員在進化史中有一定的擴張。

根據(jù)葫蘆科OXR成員所在亞家族，按照“物種拉丁名縮寫+亞家族+小寫字母”的形式命名。同一亞族OXR成員的TLDc結(jié)構(gòu)域的長度和位置相似，不同亞族的OXR成員的TLDc結(jié)構(gòu)域的位置和長度有差別（圖1），如OXR4亞族的TLDc結(jié)構(gòu)域的長度短于其他OXR族，且位于蛋白質(zhì)的中部，并不靠近C端。

理化性質(zhì)分析結(jié)果（表1）表明，葫蘆科作物OXR家族成員的氨基酸數(shù)量在232～1 059之間，等電點在4.65～7.07之間。分子量最小的是LsiOXR4，僅有25.64 ku，其開放閱讀框長度為 699 bp，編碼232個氨基酸；而分子量最大的CmaOXR4，有118.62 ku，其開放閱讀框長度達到 3 180 bp，編碼1 059個氨基酸。通過對比葫蘆科和擬南芥的OXR基因家族成員的氨基酸數(shù)發(fā)現(xiàn)，同一亞家族內(nèi)，除南瓜CmaOXR1和CmaOXR4外，其他葫蘆科OXR成員和擬南芥OXR成員的氨基酸數(shù)量相似。

2.3 染色體定位

將37個葫蘆科OXR基因家族成員定位到相應(yīng)的染色體上，結(jié)果顯示OXR基因在染色體上呈不均勻分布。南瓜OXR基因分布于6條染色體上，葫蘆OXR基因分布于5條染色體上，冬瓜和甜瓜分布于4條染色體上，黃瓜和西瓜OXR基因位于3條染色體上。不同染色體上分布的OXR基因數(shù)量不同，最多有4個（黃瓜3號染色體）（圖2）。

2.4 基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

為了研究葫蘆科作物OXR基因家族成員的進化關(guān)系，對37個葫蘆科OXR成員和6個擬南芥OXR成員的外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量及排列模式進行了分析。結(jié)果表明，位于不同亞家族的所有OXR成員的外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量以及排列模式差異顯著，而同一亞族的葫蘆科OXR成員的內(nèi)含子-外顯子排列模式基本一致（圖3）。

根據(jù)MEME網(wǎng)站分析，在葫蘆科OXR成員和擬南芥OXR成員中共檢測到15個保守基序，每個OXR成員大致含有5～9個不等的保守基序，同一個亞族內(nèi)的OXR成員所含的保守基序的數(shù)量和保守基序的分布模式大致相同，推測同亞族的OXR可能發(fā)揮相似的功能。不同亞族的OXR成員的保守基序的分布模式有所不同，可能是造成其功能差異的主要原因。

2.5 啟動子分析

提取葫蘆科OXR基因起始密碼子前2 500 bp序列，提交至Plantcare網(wǎng)站，預(yù)測其順式作用元件（圖4）。共發(fā)現(xiàn)49種順式作用元件，主要分為4類：調(diào)控生長發(fā)育、光反應(yīng)、激素響應(yīng)和逆境脅迫相關(guān)。其中調(diào)控生長發(fā)育的元件包括對柵欄葉肉細胞分化、胚乳表達、晝夜節(jié)律、分生組織表達等調(diào)控元件，而在BhiOXR2a和CmeOXR2a中還發(fā)現(xiàn)有參與類黃酮生物合成的MYB結(jié)合位點。光反應(yīng)元件包含24個不同的元件，說明葫蘆科OXR基因家族可能廣泛參與了光調(diào)控途徑。多個葫蘆科OXR基因中有許多與脫落酸、赤霉素、水楊酸和生長素等植物激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。另外，OXR3亞族成員都具有參與脫落酸響應(yīng)的ABRE順式作用元件，數(shù)量1～4個不等，推測葫蘆科OXR3可能參與脫落酸的響應(yīng)。逆境脅迫相關(guān)元件主要包含多種非生物脅迫響應(yīng)元件（干旱、低溫、缺氧和創(chuàng)傷響應(yīng)元件）以及參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點。

2.6 復(fù)制分析及基因選擇壓力分析

6個葫蘆科作物物種內(nèi)的共線性分析發(fā)現(xiàn)，在葫蘆科OXR基因家族中，只有OXR2亞族發(fā)生了復(fù)制（圖5）。其中，南瓜OXR2復(fù)制基因?qū)^多，而冬瓜、黃瓜、甜瓜、西瓜和葫蘆由于近期沒有發(fā)生全基因組復(fù)制事件，其復(fù)制基因?qū)^少。

通過葫蘆科OXR2復(fù)制基因?qū)Φ腒a/Ks分析，發(fā)現(xiàn)Ka/Ks的值均小于1，表明這些復(fù)制基因?qū)κ艿郊兓x擇（表2）。在同義突變率Ks分析中，CmaOXR2b-CmaOXR2c復(fù)制基因?qū)Φ腒s值為0.364 422，南瓜近期發(fā)生特異的全基因組復(fù)制事件（specific whole-genome duplication，sWGD）的Ks值為0.32［13］，二者相差不大。此外，CmaOXR2b-CmaOXR2c共線對所在的共線區(qū)塊所含的基因?qū)?shù)（183對）遠多于CmaOXR2a-CmaOXR2c共線對所在的共線塊所含的基因?qū)?shù)（72對），證實CmaOXR2b-CmaOXR2c是由南瓜的近期發(fā)生sWGD而產(chǎn)生的。

2.7 共線性分析

為研究OXR基因家族在葫蘆科內(nèi)的進化歷史，根據(jù)之前報道的物種分化樹將葫蘆科作物兩兩開展共線性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 親緣關(guān)系越近 OXR所在的共線性區(qū)塊越大，如黃瓜和甜瓜、西瓜和葫蘆。ClaOXR1和ClaOXR3位于西瓜的10號染色體上，LsiOXR1和LsiOXR3位于葫蘆的3號染色體上，都在同一個較大的共線塊（OXR1+OXR3 block）中。此外，葫蘆科不同作物同一亞族成員間存在一定的共線性。不同作物OXR2a之間、不同作物OXR2b之間存在共線性，不同作物OXR2a和OXR2b間不存在共線性，說明在葫蘆科祖先物種中可能發(fā)生了古老的復(fù)制事件，產(chǎn)生了OXR2a和OXR2b（圖6）。

2.8 葫蘆科OXR基因家族的組織表達譜分析

基于葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的表達譜數(shù)據(jù)，分析OXR基因在不同組織中的表達模式。結(jié)果（圖7）顯示，不同亞族基因的表達模式有所差異，如冬瓜BhiOXR3在根、莖、葉、花中表達量無明顯差異，而BhiOXR4在葉片中表達量明顯高于其他組織。此外，不同作物相同亞族基因表達也存在一定的差異，冬瓜、葫蘆、甜瓜、黃瓜OXR4基因在葉片中表達量明顯高于其他組織，而南瓜OXR4基因則無明顯的葉片高豐度表達。值得注意的是，復(fù)制基因?qū)Γ˙hiOXR2a-BhiOXR2b、LsiOXR2a-LsiOXR2b、CsaOXR2a-CsaOXR2b、CmaOXR2b-CmaOXR2c）在不同組織中的表達存在較大差異，出現(xiàn)表達分化現(xiàn)象。

3 討論與結(jié)論

抗氧化（OXR）基因有助于保護真核生物免受活性氧的傷害［22］。目前，OXR基因家族已在擬南芥、小麥、向日葵和某些十字花科植物的基因組中被鑒定出來，并深入研究了部分基因的功能［7-8，23-25］。

然而，關(guān)于葫蘆科OXR家族基因的研究還未見報道。本研究基于葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫，從6個葫蘆科作物中共鑒定出37個OXR基因，其中冬瓜、黃瓜、西瓜、甜瓜和葫蘆均有6個OXR基因，而南瓜有7個OXR基因。

根據(jù)氨基酸序列和保守結(jié)構(gòu)域的相似性，葫蘆科OXR基因家族可分為5個亞家族，這一結(jié)果同擬南芥、向日葵和十字花科植物的分類結(jié)果相似［7-8，25］。同一亞家族的擬南芥 OXR基因和葫蘆科OXR基因編碼的氨基酸個數(shù)、開放閱讀框和分子量的大小都相似，其內(nèi)含子-外顯子的數(shù)量及保守基序相似，說明同一亞家族內(nèi)的OXR基因可能具有相似的生物學(xué)功能。

OXR基因的啟動子含有多種順式作用元件，表明OXR基因可能參與多種植物代謝調(diào)控途徑。過表達擬南芥OXR基因，可通過影響水楊酸代謝而清除多余的活性氧，從而能夠提高對氧化脅迫的耐受性［7，24］。葫蘆科OXR基因的啟動子區(qū)域包含調(diào)控生長發(fā)育、光反應(yīng)、激素響應(yīng)和非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)元件，這一結(jié)果與之前報道的十字花科植物OXR基因和小麥OXR基因的順式作用元件［8，23］相似，說明葫蘆科OXR基因可能在抵御生物和非生物脅迫時發(fā)揮重要作用。

基因復(fù)制是植物基因組進化的主要驅(qū)動力，為遺傳革新、表型多樣性以及物種分化提供了大量的原始遺傳物質(zhì)［26-27］。葫蘆科OXR2亞族成員通過片段復(fù)制或全基因組復(fù)制發(fā)生了擴張，并且OXR2復(fù)制基因?qū)Φ腒a/Ks 比值均小于 1。Ka/Ks<1 表示基因受到純化選擇［28］，說明葫蘆科OXR2亞族在進化上相對保守，有助于維持OXR2亞族成員功能的穩(wěn)定性。通過探尋OXR基因家族在葫蘆科內(nèi)的進化歷史，發(fā)現(xiàn) 6個葫蘆科作物的OXR2a和OXR2b相互之間都具有共線性關(guān)系，推測OXR2亞族的成員在這6個葫蘆科作物的祖先物種中通過古老的復(fù)制事件，產(chǎn)生了OXR2a和OXR2b等2個同源基因?qū)Γ殡S著葫蘆科物種的分化，OXR2a和OXR2b也被保留在了6個葫蘆科物種的基因組中。南瓜基因組中有3個OXR2基因，其中CmaOXR2b和CmaOXR2c是同源基因，這一發(fā)現(xiàn)進一步證實南瓜近期發(fā)生了sWGD事件［13］。

為了研究OXR基因的表達特征，本研究從葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫下載冬瓜、南瓜、甜瓜、黃瓜和葫蘆不同組織的表達譜數(shù)據(jù)。表達譜分析發(fā)現(xiàn)不同亞族OXR基因的表達量有差異，表明它們在不同組織器官中的抗氧化作用機制不盡相同。葫蘆科OXR4亞族的基因的表達模式較為相似，暗示OXR4亞族的基因可能具有相似的抗氧化功能。喬鑫通過對梨等141種植物基因組中的不同類型的復(fù)制基因的鑒定和表達分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)制基因廣泛存在非對稱表達現(xiàn)象（2個同源基因拷貝的表達水平己經(jīng)偏離了1 ∶1的對稱性表達模式）［27］，然而葫蘆科OXR2亞族內(nèi)復(fù)制基因存在顯著的表達差異，也出現(xiàn)了非對稱表達的現(xiàn)象。這可能是由于基因復(fù)制發(fā)生后，2個同源基因拷貝在啟動子區(qū)域的分化導(dǎo)致它們之間的表達分化［29］，但其表達產(chǎn)生分化的機制還需進一步解析。

綜上所述，本研究利用多種生物信息學(xué)分析網(wǎng)站和軟件，系統(tǒng)鑒定了6種葫蘆科作物的OXR基因，并綜合分析了葫蘆科OXR基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、物理化學(xué)性質(zhì)、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、順式作用元件、在葫蘆科作物中的進化歷史和在不同組織中表達模式等。鑒定和分析結(jié)果為進一步研究葫蘆科作物OXR基因家族在響應(yīng)非生物脅迫方面的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

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