施 欣，景蓉蓉，王 潔，劉思楠，崔 明*

1南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南通 226001；2南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226001

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，是全球第四大癌癥死亡原因，僅次于肺癌、結(jié)直腸癌和肝癌［1］。盡管近年來(lái)胃癌發(fā)病率有所下降，但由于缺乏有效的早期診斷指標(biāo)，胃癌患者的治療效果不佳，預(yù)后差，死亡率較高［2-3］。目前，手術(shù)治療是胃癌唯一的根治性治療方法，放化療或其他治療方法常作為輔助治療手段與手術(shù)結(jié)合使用［4-5］。因此，對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行更廣泛和深入的研究對(duì)尋找新的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，改善胃癌患者預(yù)后，提高存活率有重要意義。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)且多不具有蛋白編碼能力的RNA［6］。由于具有穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易降解，且表達(dá)具有組織和疾病特異性，CircRNA有望成為新型腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力［7］。為探尋新的胃癌差異circRNA，本文結(jié)合文獻(xiàn)circRNA芯片結(jié)果［8］并經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）初步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001479 可能在胃癌組織中高表達(dá)，因此選擇該分子進(jìn)行更深入的研究。本研究首次驗(yàn)證了hsa_circ_0001479 在胃癌組織中表達(dá)增高并探究了其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響，從而初步闡明其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2017年6月—2020年7月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)的胃癌及配對(duì)遠(yuǎn)端癌旁組織76例（男57例，女19 例），年齡37～82 歲。組織標(biāo)本一經(jīng)取出立即置于-80 ℃冰箱保存。所有標(biāo)本均在放化療前采集，并經(jīng)病理確診。本研究經(jīng)南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。4 株胃癌細(xì)胞株（MGC-803、SGC-7901、MKN-45 和BGC-823）及1 株正常胃黏膜上皮細(xì)胞株（GES-1）均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究細(xì)胞資源庫(kù)。

本研究使用的試劑為TRIzol（Invitrogen公司，美國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo 公司，美國(guó)）；DEPC 水、18s rRNA 引物和ZNF131 引物（上海生工生物工程股份有限公司）；hsa_circ_0001479 引物（廣州銳博生物科技有限公司）；SYBR GreenⅠmix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；核糖核酸酶R（Rnase R）（Epicentre 公司，美國(guó)）；RPMI 1640 培養(yǎng)基和Matrigel 膠（Corning 公司，美國(guó)）；Lonsera 特級(jí)胎牛血清（上海雙洳生物科技有限公司）；siNC、hsa_circ_0001479 siRNA 和GP-transfect-Mate 轉(zhuǎn)染試劑（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；空載體、hsa_circ_0001479 pcDNA（廣州吉賽生物科技有限公司）；CCK-8 試劑盒（Dojindo 公司，日本）；Transwell 小室（BD 公司，美國(guó)）；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR

根據(jù)說(shuō)明書使用TRIzol試劑從胃癌及癌旁組織或細(xì)胞中提取總RNA。用分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)RNA 樣本的濃度。參照說(shuō)明書用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA），反應(yīng)條件為25 ℃5 min，42 ℃1 h，70 ℃5 min，4 ℃保存。在Light Cycler 480 PCR 儀（Roche 公司，美國(guó)）上使用SYBR Green Ⅰmix 通過RT-qPCR 檢測(cè)circRNA 的表達(dá)量，反應(yīng)條件為95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共45 個(gè)循環(huán)。以18s rRNA 作為內(nèi)參，hsa_circ_0001479 的引物序列為F：5′-ATCTTCGAAAACATACAGAGCAGC-3′和R：5′-AACTCCTGAAGGCATTCCATC-3′；18s rRNA的引物序列為F：5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′和R：5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′；ZNF131 的引物為F：5′-ACACGTGTGCAAACTGAACC-3′和R：5′-CCTGGAGCAGATCTGGATGG-3′。用2-ΔΔCt法對(duì)目的分子和內(nèi)參分子進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.2 RT-qPCR方法學(xué)性能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

精密度評(píng)價(jià)：依據(jù)EP15-A2 文件制定的定量檢測(cè)方法精密度性能評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選用6 μg組織RNA和3 μg細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的高低2個(gè)濃度的cDNA作為實(shí)驗(yàn)樣本，每天檢測(cè)1個(gè)批次，2份樣本，每份樣本重復(fù)測(cè)定4次，連續(xù)檢測(cè)5 d。

正確度評(píng)價(jià)：收集目的分子的RT-qPCR 產(chǎn)物50 μL 并送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，得到的測(cè)序結(jié)果與Circbase 數(shù)據(jù)庫(kù)提供的分子序列進(jìn)行比對(duì)，觀察堿基順序是否一致，擴(kuò)增片段中是否包含環(huán)化位點(diǎn)；將目的分子與內(nèi)參分子的RT-qPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察產(chǎn)物片段大小與預(yù)期是否一致。

線性范圍評(píng)價(jià)：將細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA以10 倍倍比稀釋，設(shè)立5～7 個(gè)濃度梯度，通過RTqPCR 檢測(cè)線性范圍，用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行線性回歸分析并作圖。

1.2.3 轉(zhuǎn)染與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力檢測(cè)

轉(zhuǎn)染：將MKN-45、BGC-823和SGC-7901細(xì)胞株分別培養(yǎng)于6 孔板中，分為對(duì)照組和干擾或過表達(dá)組，使用GP-transfect-Mate 轉(zhuǎn)染試劑將siNC 和hsa_circ_0001479 siRNA 轉(zhuǎn)染至MKN-45、BGC-823細(xì)胞株，空載體和hsa_circ_0001479 pcDNA 轉(zhuǎn)染至SGC-7901 細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染48 h 后通過RT-qPCR 測(cè)定轉(zhuǎn)染后表達(dá)。

細(xì)胞增殖能力檢測(cè)：①CCK-8實(shí)驗(yàn)：取轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞接種于96 孔板中，每組設(shè)立4 個(gè)復(fù)孔，按說(shuō)明書操作后，用酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處各孔的吸光度值，連續(xù)檢測(cè)5 d并繪制折線圖；②克隆形成實(shí)驗(yàn)：取轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞以每孔1 000 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)2 周后出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆斑，用甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS 洗滌、晾干后拍照并計(jì)數(shù)。

細(xì)胞周期檢測(cè)：取轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書操作后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)：①細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，在各孔中央用100 μL槍頭十字劃線，用PBS 洗滌后加入培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱，分別在培養(yǎng)的第0 h、12 h及24 h在顯微鏡下拍照。②Transwell 實(shí)驗(yàn)：取轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞，以50 000 個(gè)/室接種于Transwell 小室的上室中（侵襲實(shí)驗(yàn)需預(yù)先鋪一層Matrigel 膠），在下室（24 孔扳）中加入600 μL 含20%胎牛血清的完培，培養(yǎng)48 h 后取出，經(jīng)PBS 洗滌，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌、晾干后在顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Prism 7和SPSS 20.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并繪制統(tǒng)計(jì)圖。采用t檢驗(yàn)分析兩組數(shù)據(jù)的組間差異性；采用卡方檢驗(yàn)分析hsa_circ_0001479 表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系；采用單因素方差分析（one-way ANOVA）分析多組數(shù)據(jù)的組間差異性；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR檢測(cè)hsa_circ_0001479的方法學(xué)性能評(píng)價(jià)

精密度評(píng)價(jià)：連續(xù)5 d通過RT-qPCR檢測(cè)2份不同濃度的cDNA 標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RT-qPCR 檢測(cè)目的分子hsa_circ_0001479和內(nèi)參分子18s rRNA均有良好的批內(nèi)和批間精密度（表1）。

表1 RT-qPCR檢測(cè)hsa_circ_0001479和18s rRNA的精密度評(píng)價(jià)Table 1 Precision evaluation for detection of hsa_circ_0001479 and 18s rRNA via RT-qPCR（%）

正確度評(píng)價(jià)：采用RT-qPCR 檢測(cè)胃癌組織中hsa_circ_0001479的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)目的分子和內(nèi)參分子熔解曲線呈單峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性良好（圖1A）。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的分子和內(nèi)參分子的條帶單一，片段大小與預(yù)期相符（圖1B）。收集擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行桑格測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見圖1C，將其與Circbase數(shù)據(jù)庫(kù)中hsa_circ_0001479的序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果100%一致。

圖1 RT-qPCR檢測(cè)hsa_circ_0001479和18 s rRNA的正確度評(píng)價(jià)Figure 1 Accuracy evaluation for detection of hsa_circ_0001479 and 18 s rRNA via RT-qPCR

線性范圍評(píng)價(jià)：通過RT-qPCR 檢測(cè)5～7個(gè)濃度梯度的樣本中hsa_circ_0001479 和18 s rRNA 的CT值，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，hsa_circ_0001479 線性方程為Y=-2.831X+23.65，r2=0.999 4；18 s rRNA 的線性方程為Y=-2.918X+6.958，r2=0.999 2，該定量檢測(cè)方法線性良好（圖2）。

圖2 RT-qPCR檢測(cè)hsa_circ_0001479（A）和18 s rRNA（B）的線性范圍評(píng)價(jià)Figure 2 Linear range evaluation for detection of hsa_circ_0001479（A）and 18 s rRNA（B）via RT-qPCR

2.2 Hsa_circ_0001479成環(huán)性和穩(wěn)定性驗(yàn)證

Hsa_circ_0001479 的分子結(jié)構(gòu)示意圖來(lái)源于CSCD數(shù)據(jù)庫(kù)（圖3A）。其環(huán)化位點(diǎn)的位置見測(cè)序結(jié)果圖上的箭頭標(biāo)示（圖3B）。通過RT-qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RNase R 處理后hsa_circ_0001479 的來(lái)源基因ZNF131 的mRNA 表達(dá)水平顯著下降，而hsa_circ_0001479 的表達(dá)水平僅略有下降（圖3C），說(shuō)明hsa_circ_0001479具有較好的穩(wěn)定性。此外，以cDNA和gDNA 為模板擴(kuò)增hsa_circ_0001479 和ZNF131，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，ZNF131 可以在cDNA 和gDNA 中被擴(kuò)增，而hsa_circ_0001479 只能在cDNA中被擴(kuò)增（圖3D）。以上實(shí)驗(yàn)證明了hsa_circ_0001479為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的閉合環(huán)狀RNA。

圖3 Hsa_circ_0001479的成環(huán)性和穩(wěn)定性驗(yàn)證Figure 3 Ring structure and stability of hsa_circ_0001479

2.3 Hsa_circ_0001479在胃癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

RT-qPCR 結(jié)果顯示，hsa_circ_0001479 在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P＜0.000 1，圖4）。結(jié)合患者的病理資料，分析hsa_circ_0001479表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，χ2檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，hsa_circ_0001479 表達(dá)水平與腫瘤大?。≒=0.039）、浸潤(rùn)深度（P=0.044）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.011）、TNM 分期（P=0.021）和CA19-9（P=0.042）有關(guān)（表2）；以上結(jié)果提示胃癌組織中高表達(dá)hsa_circ_0001479可能參與胃癌的惡性進(jìn)展。

圖4 hsa_circ_0001479在胃癌及癌旁組織的表達(dá)水平Figure 4 Level of hsa_circ_0001479 in 76 GC and paired paracancerous tissues

表2 Hsa_circ_0001479表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2 Relationship between hsa_circ_0001479 expression and clinicopathological factors

2.4 Hsa_circ_0001479 在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)、定位及轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與GES-1 相比，hsa_circ_0001479 在4 株胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)增高，其中，在MKN-45、BGC-823 細(xì)胞株中表達(dá)增高較為顯著（P＜0.05）。選用MKN-45 細(xì)胞株進(jìn)行核漿分離操作，通過RT-qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001479 主要定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖5）。選取表達(dá)較高的MKN-45、BGC-823 進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，表達(dá)較低且細(xì)胞大小適中的SGC-7901進(jìn)行過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

圖5 胃癌細(xì)胞株hsa_circ_0001479表達(dá)水平（A）及核漿分布情況（B）Figure 5 Level of hsa_circ_0001479 in GC cell lines（A）and distribution of hsa_circ_0001479 in GC cells（B）

在轉(zhuǎn)染干擾片段si1 和si2 后檢測(cè)hsa_circ_0001479表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，si2片段干擾效率達(dá)60%以上，而si1片段幾乎無(wú)干擾效果，選si2片段進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖6A，B）。轉(zhuǎn)染pcDNA hsa_circ_0001479后，胃癌細(xì)胞株中hsa_circ_0001479 表達(dá)量顯著增高（圖6C）。

圖6 RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后hsa_circ_0001479的表達(dá)水平Figure 6 Expression of hsa_circ_0001479 in GC cells after transfection

2.5 Hsa_circ_0001479 對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染hsa_circ_0001479 干擾片段的胃癌細(xì)胞增殖能力減弱（圖7A，B），轉(zhuǎn)染hsa_circ_0001479 過表達(dá)載體的胃癌細(xì)胞增殖能力顯著增加（圖7C）；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染hsa_circ_0001479干擾片段的胃癌細(xì)胞克隆斑數(shù)量明顯減少（BGC-823：P=0.017，MKN-45：P=0.027，圖8A），轉(zhuǎn)染hsa_circ_0001479過表達(dá)載體的胃癌細(xì)胞克隆斑數(shù)量明顯增加（P=0.038，圖8B），以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hsa_circ_0001479可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。

圖7 CCK-8法檢測(cè)hsa_circ_0001479對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響Figure 7 Detection of the effect of hsa_circ_0001479 on the proliferation of GC cells via CCK-8 assay

圖8 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hsa_circ_0001479的對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響Figure 8 The evaluation of the function of hsa_circ_0001479 on proliferation of GC cells via colony formation assay

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染hsa_circ_0001479干擾片段的胃癌細(xì)胞S期所占比例下降，細(xì)胞周期阻滯于G1期（圖9A），轉(zhuǎn)染hsa_circ_0001479 過表達(dá)載體的胃癌細(xì)胞S 期所占比例上升（圖9B），說(shuō)明hsa_circ_0001479 具有加速細(xì)胞DNA的復(fù)制，促進(jìn)胃癌細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力的作用。

圖9 流式細(xì)胞儀檢測(cè)hsa_circ_0001479對(duì)胃癌細(xì)胞周期分布的影響Figure 9 The dection of the function of hsa_circ_0001479 on cell cycle distribution via flow cytometry analysis

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染hsa_circ_0001479 干擾片段的胃癌細(xì)胞橫向遷移距離減少（圖10A），轉(zhuǎn)染hsa_circ_0001479過表達(dá)載體的胃癌細(xì)胞橫向遷移距離增加（圖10B），Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染hsa_circ_0001479干擾片段的胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力下降（圖11A、12A），轉(zhuǎn)染hsa_circ_0001479 過表達(dá)載體的胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)（圖11B、圖12B），以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hsa_circ_0001479 可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

圖10 劃痕法檢測(cè)hsa_circ_0001479對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響（×100）Figure 10 The evalution of the function of hsa_circ_0001479 on migration ability of GC cells via wound healing assay（×100）

圖11 Transwell法檢測(cè)hsa_circ_0001479對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響（×100）Figure 11 The evalution of the function of hsa_circ_0001479 on migration ability of GC cells via Transwell assay（×100）

圖12 Transwell法檢測(cè)hsa_circ_0001479對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響（×100）Figure 12 The evalution of the function of hsa_circ_0001479 on invasion ability of GC cells via Transwell assay（×100）

綜上，hsa_circ_0001479 具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的功能。

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是死亡率較高的癌癥之一［1］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的改變通過細(xì)胞周期、DNA 修復(fù)、細(xì)胞與基質(zhì)、凋亡、免疫等多個(gè)途徑促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展［9］。CircRNA是一種特殊的非編碼RNA，由mRNA前體反向剪接而成，曾被認(rèn)為是由錯(cuò)誤剪接形成的副產(chǎn)物，而近年的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)它們?cè)诩膊〉牟±磉^程起到了非常重要的作用［10，11］。在胃癌中，一些表達(dá)異常的circRNA 已被證明對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、周期及凋亡等生物學(xué)行為具有一定影響。例如，在最新的一項(xiàng)研究中，circVAPA在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，在胃癌細(xì)胞株中敲減circVAPA 使細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力減弱并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［12］。在另一項(xiàng)研究中，hsa_circ_0009172 在胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)hsa_circ_0009172可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程［13］。

雖然目前研究者們對(duì)circRNA的研究已取得了一定進(jìn)展，但對(duì)于circRNA 在胃癌中的研究仍處于初步階段，大量表達(dá)異常和功能未知的胃癌相關(guān)circRNA有待發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)合文獻(xiàn)芯片結(jié)果選定了hsa_circ_0001479 作為目的分子，對(duì)RT-qPCR 檢測(cè)hsa_circ_0001479 進(jìn)行了精密度、正確度以及線性范圍評(píng)價(jià)，并通過Rnase R 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其成環(huán)性和穩(wěn)定性后，通過RT-qPCR檢測(cè)了76對(duì)胃癌及癌旁組織中hsa_circ_0001479 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，hsa_circ_0001479 在胃癌組織中顯著高表達(dá)且表達(dá)水平與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及CA19-9 水平有關(guān)。為了進(jìn)一步探究hsa_circ_0001479 對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，通過RT-qPCR 測(cè)定了hsa_circ_0001479 在胃癌細(xì)胞株MKN-45、BGC-823、SGC-7901、MGC-803和胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在4株胃癌細(xì)胞株中表達(dá)量均高于GES-1，并選擇表達(dá)豐度較高M(jìn)KN-45、BGC-823進(jìn)行干擾試驗(yàn)，豐度較低的SGC-7901進(jìn)行過表達(dá)試驗(yàn)。通過一系列細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲減hsa_circ_0001479 后，細(xì)胞增殖能力降低、細(xì)胞周期阻滯于G1 期，細(xì)胞遷移和侵襲能力降低。過表達(dá)hsa_circ_0001479 則呈現(xiàn)出相反的結(jié)果，提示hsa_circ_0001479 可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，本研究還通過RT-qPCR分別檢測(cè)了細(xì)胞核和細(xì)胞漿中hsa_circ_0001479 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該分子主要分布于胞漿中。總結(jié)以往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，circRNA 的作用機(jī)制和其細(xì)胞亞定位有一定關(guān)系，如定位于胞質(zhì)的circRNA 多含有miRNA 反應(yīng)元件（MRE），可能通過與mRNA 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，抑制miRNA 表達(dá)從而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能［14］。因此，在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步研究hsa_circ_0001479 促進(jìn)胃癌惡性進(jìn)展的分子機(jī)制。

綜上所述，胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)的hsa_circ_0001479 具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的功能。