付 鑫，吳 茗，3，陳 獻，劉書娜，張 磊，李 榮，徐 娟，陶子琦，王 婷，王 芳*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗學部，2國家醫(yī)學檢驗臨床醫(yī)學研究中心分中心，江蘇 南京 210029；3復旦大學附屬兒科醫(yī)院，國家兒童醫(yī)學中心，上海 201102；4深圳市寶安區(qū)婦幼保健院檢驗科，廣東 深圳 518000

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤，其死亡率居生殖系統(tǒng)惡性腫瘤前列［1］，由于其發(fā)病隱匿，發(fā)展迅速，容易在盆腹腔臟器廣泛轉(zhuǎn)移，多數(shù)卵巢癌患者初診時已為晚期，預后極差。目前卵巢癌的基本治療方案仍是根治性手術(shù)聯(lián)合輔助性化療，但卵巢癌化療易耐藥且易復發(fā)，治療效果不甚理想［2］，迫切需要新的有效治療策略。免疫治療有望成為最有希望的一種新型治療方案，CD4+調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg）介導的腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制是腫瘤免疫治療的關(guān)鍵障礙［3］。研究發(fā)現(xiàn)，T細胞在腫瘤微環(huán)境中被激活后其代謝方式發(fā)生改變，而不同的代謝方式又會影響T細胞的分化和功能發(fā)揮。腫瘤微環(huán)境中的“Warburg 效應”也與抑制性T細胞的產(chǎn)生相關(guān)，從而促進腫瘤免疫逃逸［4］。全面了解Treg的代謝特征以及控制代謝的關(guān)鍵調(diào)控分子對控制或逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境至關(guān)重要。本課題組前期研究表明，在卵巢癌細胞SKOV3的生長環(huán)境中，CD4+T細胞中Foxp3 陽性細胞比例上升，糖代謝水平增強［5-6］，而其中介導糖代謝水平改變的關(guān)鍵調(diào)控分子有待研究。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)細胞生存、代謝和免疫的蛋白激酶［6］，作為細胞內(nèi)非常重要的信號轉(zhuǎn)導通路，其在調(diào)控卵巢癌CD4+Treg糖代謝中的作用尚未有報道。本研究從卵巢癌患者外周血CD4+Treg 中mTOR 信號活化情況入手，探究mTOR信號在調(diào)控CD4+Treg的糖代謝中的作用，為尋找卵巢癌新的免疫治療靶點提供思路。

1 對象和方法

1.1 對象

收集2020年6月—2021年1月就診于南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和南京市婦幼保健院的卵巢癌患者（OC）、卵巢良性腫瘤患者（ovarian benign tumor patients，BOT）和健康志愿者（healthy controls，HC）外周血標本各10 例。病例入組標準：臨床診斷明確、未經(jīng)任何治療的初診患者，無其他重大傳染病史，不伴其他嚴重疾病，并排除糖尿病患者。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（倫審號：2017-SRFA-064）。

健康對照外周血由健康志愿者提供。人卵巢漿液性囊腺癌細胞株SKOV3 來源自中科院上海細胞庫。

淋巴細胞分離液Ficoll（天津灝洋生物制品有限公司）；鼠抗人CD4、鼠抗人CD25、鼠抗人CD127、鼠抗人mTOR 抗體（BD 公司，德國）；CD3/CD28 T 細胞擴增磁珠（Invivogen 公司，美國）；PCR 引物（南京金斯瑞生物科技有限公司）；RNeasy Micro Kit（Qiagen公司，美國）；KRPH緩沖液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；Prime Script RT reagent Kit（TaKa Ra 公司，日本）；糖攝取分析試劑盒（Biovision公司，美國）；兔抗人GAPDH 單克隆抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（大連寶生物工程有限公司）；兔抗人p-mTOR 單克隆抗體、兔抗人p-P70S6K 單克隆抗體、兔抗人p-4E-BP1 單克隆抗體、兔抗人LDH-α單克隆抗體、兔抗人Glut1單克隆抗體、兔抗人PKM2單克隆抗體、兔抗人GPI單克隆抗體、兔抗人HIF-1α單克隆抗體（Cell Signaling 公司，美國）；糖酵解分析試劑盒（Cayman公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 流式檢測外周血中mTOR+CD4+Treg百分比

使用Ficoll 液密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，于流式管中加入一定濃度的抗體如下：鼠抗人CD4、鼠抗人CD25、鼠抗人CD127、鼠抗人mTOR 抗體，經(jīng)孵育、洗滌后使用BD FACS Calibur流式細胞儀檢測。

1.2.2 流式分選和擴增CD4+Treg細胞

抽取健康志愿者外周血50 mL，F(xiàn)icoll 液分離外周血單個核細胞，無菌條件下加入以下抗體：鼠抗人CD4、鼠抗人CD25、鼠抗人CD127，室溫孵育20 min，全程注意避光操作，最后用PBS 清洗2 次，并進行流式分選（BD FACS AriaⅡ），收集分選的細胞鋪入圓底96孔板中，并加入Treg細胞擴增磁珠進行細胞培養(yǎng)。

1.2.3 SKOV3細胞與CD4+Tregs共培養(yǎng)體系的建立

體系最終體積1.5 mL/孔，在Transwell板的下室加入2×105個SKOV3細胞，在上室加入8×105個CD4+Tregs，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，收集共培養(yǎng)前、后各組的CD4+Treg細胞，用于后續(xù)實驗。

1.2.4 熒光定量PCR

各處理組CD4+Treg細胞分別收集，使用RNeasy Micro Kit 試劑盒按說明書步驟提取總RNA，并調(diào)整RNA 濃度為500 ng/mL，采用Prime Script RT reagent Kit 試劑盒，37 ℃15 min，85 ℃5 s 條件下進行RNA逆轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR 用于檢測mTOR 信號通路相關(guān)AKT、Rheb、mTOR、HIF-1α、4E-BP1、TSC2、P70S6K 基因、糖代謝相關(guān)TPI、PKM2、Glut3、ENO1、Glut1、LDH-α、GPI 基因的mRNA 表達水平，擴增程序：按SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒推薦程序。引物序列見表1。

表1 引物序列一覽表Table 1 PCR primer sequences

1.2.5 細胞總蛋白提取和Western blot

收集各組CD4+Tregs，蛋白裂解液用于提取細胞總蛋白，測定濃度后加入5×蛋白上樣緩沖液進行稀釋，金屬浴加熱煮沸，-20 ℃保存。隨后使用10%分離膠進行Western blot 電泳，濃縮膠用80 V 電泳，至蛋白壓縮至分離膠且marker 分散后將電壓調(diào)整為100 V。待電泳結(jié)束，以100 mA 轉(zhuǎn)膜1 h 50 min，載有蛋白的PVDF膜在5%脫脂奶粉溶液、室溫搖晃下封閉3 h 后，放入一抗中4 ℃孵育過夜，次日1×TBST 洗膜3 次后，加入HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗室溫孵育2 h，1×TBST 再次洗膜3 次，PVDF 膜表面均勻加入發(fā)光試劑后曝光成像。

1.2.6 糖攝取實驗

收集各組CD4+Tregs 細胞，PBS 清洗計數(shù)，加入3×105個/孔細胞于平底96 孔板中，每孔用無血清培養(yǎng)基補足體積至100 μL，饑餓細胞過夜，第2 天用PBS 洗滌細胞后，加入2%BSA 的KRPH 緩沖液100 μL/孔，預孵育40 min后，加入10 mmol/L 2-脫氧葡萄糖（2-DG）10 μL/孔，孵育20 min，按說明書充分反應后檢測412 nm波長的吸光度值，每10 min檢測1 次，糖攝取水平為吸光度值根據(jù)標準曲線將細胞攝取葡萄糖類似物2-DG的含量換算得到。

1.2.7 糖酵解水平測定

收集各組CD4+Treg 細胞，PBS 洗滌后，于96 孔板中加入細胞3×105個/孔，加入RPMI 1640培養(yǎng)基補足體積為200 μL/孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后離心收集上清液，比色法檢測上清液中L-乳酸的含量，再根據(jù)標準曲線轉(zhuǎn)化為糖酵解水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，同時使用Image Lab 軟件提取Western blot 圖像的數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)均以均值±標準差（）表示，兩組間的對比在正態(tài)性檢驗之后用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌患者外周血中mTOR+的CD4+Treg 百分比升高

OC、BOT和HC組外周血，分離得到外周血單個核細胞后，應用流式細胞術(shù)檢測其mTOR+CD4+Treg的百分比（圖1），結(jié)果顯示OC 外周血中mTOR+CD4+Treg 比例顯著高于HC［（77.4 ± 8.12）%vs.（64.19±9.7）%，P＜0.01］，OC組與BOT組相比差異無統(tǒng)計學意義［（77.4 ± 8.12）%vs.（74.6 ± 9.25）%，P＞0.05］，表明OC 患者外周血中mTOR+的CD4+Treg比例升高。

圖1 卵巢癌患者、卵巢良性腫瘤患者和健康對照者外周血中mTOR+CD4+Treg 比例Figure 1 The percentages of mTOR+CD4+Treg in peripheral blood of OC，BOT and HC

2.2 卵巢癌細胞的生長促進人外周血CD4+Treg中mTOR的表達

為了進一步研究mTOR 信號通路在CD4+Treg中的作用，建立CD4+Treg與SKOV3 共培養(yǎng)體系，將分選擴增后的CD4+Treg與卵巢癌細胞SKOV3共培養(yǎng)3 d，流式分選檢測mTOR+的CD4+Treg百分比，結(jié)果顯示CD4+Treg 與SKOV3共培養(yǎng)后mTOR+細胞百分比明顯升高（P＜0.05，圖2A、B）；RT-PCR 檢測其mTOR 信號通路相關(guān)基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)除TSC2 外，SKOV3 共培養(yǎng)組CD4+Treg 的mTOR 信號相關(guān)基因的表達水平均高于CD4+Treg單獨培養(yǎng)組（圖3C）；Western blot 檢測其mTOR 通路相關(guān)蛋白表達水平，SKOV3 共培養(yǎng)組CD4+Treg 的mTOR 信號通路相關(guān)蛋白（p-mTOR，p-P70S6K、p-4EBP1）的表達水平高于CD4+Treg 單獨培養(yǎng)組（圖2D）。以上結(jié)果提示卵巢癌細胞的生長會促進人外周血CD4+Treg 中mTOR 的表達和下游信號通路的活化。

圖2 卵巢癌細胞的生長促進人外周血CD4+Treg中mTOR的表達Figure 2 The growth of ovarian cancer cells promotes the expression of mTOR in CD4+Treg in human peripheral blood

2.3 阻斷SKOV3生長環(huán)境中CD4+Treg的mTOR信號后其糖攝取和糖酵解水平下降

使用mTOR分子抑制劑雷帕霉素阻斷與SKOV3共培養(yǎng)后CD4+Treg的mTOR信號后，其糖代謝特征變化情況如圖3所示。與對照組相比，雷帕霉素處理組CD4+Treg 的葡萄糖攝取（OD 值：3.31±0.19vs.3.04±0.21，P＜0.01；2-脫氧葡萄糖換算值：193.49±13.28vs.174.05±14.58，P＜0.01）和糖酵解（OD 值：1.82±0.07vs.0.39±0.13，P＜0.001；L-乳酸相對值：21.97±0.87vs.4.85±1.54，P＜0.001）水平降低，差異有統(tǒng)計學意義，提示mTOR 信號與卵巢癌患者CD4+Treg的糖代謝過程密切相關(guān)。

圖3 SKOV3 生長環(huán)境中阻斷mTOR 信號前后CD4+Treg的糖攝?。ˋ）和糖酵解（B）水平Figure 3 The glucose uptake（A）and glycolysis（B）levels of CD4+ Treg before and after blocking mTOR signals in SKOV3 growth environment

2.4 阻斷SKOV3生長環(huán)境中CD4+Treg的mTOR信號后其糖代謝相關(guān)基因和蛋白水平下調(diào)

接下來，使用雷帕霉素處理與SKOV3共培養(yǎng)后的CD4+Treg，RT-PCR 和Western blot 檢測其糖代謝相關(guān)基因和蛋白的表達水平，雷帕霉素處理組CD4+Treg 糖代謝相關(guān)基因Glut1、Glut3、HIF-1α、TPI、LDH-α、PKM2、ENO1、GPI表達水平均下降（圖4A），雷帕霉素處理組的糖代謝相關(guān)蛋白Glut1、PKM2、LDH-α、HIF-1α表達水平也下降（圖4B～F），差異有統(tǒng)計學意義。提示在SKOV3生長環(huán)境中，mTOR 信號在調(diào)控CD4+Treg的糖代謝過程中發(fā)揮重要作用。

圖4 阻斷CD4+Treg的mTOR信號后其糖代謝相關(guān)基因和蛋白表達水平Figure 4 The expression levels of glucose metabolism-related genes and proteins of CD4+Treg cells after blocking the mTOR signal of CD4+Treg

3 討論

近年來，卵巢癌的免疫療法發(fā)展迅速，而卵巢癌免疫抑制微環(huán)境是腫瘤免疫逃逸和免疫治療障礙的主要因素，Treg 細胞作為導致免疫抑制微環(huán)境形成的重要組成部分［7］，了解與其增殖分化和抑制能力相關(guān)的重要調(diào)控分子有助于尋找腫瘤的關(guān)鍵治療靶點。細胞代謝是癌細胞和免疫細胞維持其活力和功能的關(guān)鍵因素，在代謝限制的腫瘤微環(huán)境中，Treg細胞表現(xiàn)出更高的糖攝取和糖酵解能力，并依賴于有氧糖酵解維持其抑制功能［8］。全面了解Treg 細胞的代謝特征以及控制代謝的關(guān)鍵調(diào)控分子，進而可通過調(diào)控Treg 細胞的代謝，使其免疫抑制功能減弱，降低其對效應性T細胞功能的抑制，從而控制或逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)，有望為卵巢癌免疫治療策略提示新思路［9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者外周血中CD4+Treg 糖代謝相關(guān)因子表達增高，糖代謝功能活躍［5，10］，而其中調(diào)控糖代謝的關(guān)鍵分子尚未闡明。

mTOR 屬于磷酸肌醇3-激酶（PI3K）相關(guān)激酶家族成員，是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［11］。mTOR信號通路在促進細胞生長、導致凋亡、加速血管生成、介導自噬等過程中發(fā)揮著極其重要的生物學功能［12］，其在腫瘤中通常被激活，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［13］。越來越多的證據(jù)表明mTOR 信號傳導參與了多種免疫細胞的功能調(diào)節(jié)，也是決定T 細胞命運的主要參與者［14］，且mTOR 信號在每個T 細胞亞群中都有著不同的作用，mTORC1 激活促進Th1、Th2、Th17 和效應性CD8+T細胞以及記憶性CD8+T細胞的生成，并在Treg細胞的穩(wěn)定和激活中發(fā)揮重要作用［15-16］。為滿足與T細胞激活相關(guān)的能量需求，T 細胞受體和共刺激信號以及細胞因子通過上游PI3K/AKT 信號網(wǎng)絡調(diào)整mTOR 通路，mTOR 促進T 細胞代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HIF-1α，SREBP 等表達，進而驅(qū)動包括與糖酵解、磷酸戊糖途徑、脂質(zhì)或固醇合成等過程的代謝基因的表達來調(diào)節(jié)T 細胞代謝［17］。然而，mTOR信號通路是否在調(diào)控卵巢癌生長環(huán)境中CD4+Treg的糖代謝中發(fā)揮重要作用仍待研究。

本研究從卵巢癌患者外周血中mTOR+的CD4+Treg的百分比變化情況入手，結(jié)果表明，卵巢癌患者外周血中mTOR+的CD4+Treg比例升高，為進一步探究其作用，構(gòu)建了SKOV3 與CD4+Treg 的共培養(yǎng)體系，結(jié)果與臨床樣本結(jié)果相符合，與SKOV3 共培養(yǎng)組mTOR+的CD4+Treg比例也升高，且上調(diào)的mTOR信號通路相關(guān)基因和蛋白的結(jié)果說明在卵巢癌生長環(huán)境中，CD4+Treg的mTOR信號通路發(fā)生明顯活化。為了進一步探究mTOR 信號通路是否在CD4+Treg 糖代謝中發(fā)揮作用，本研究使用雷帕霉素抑制細胞的mTOR 信號激活。結(jié)果表明，雷帕霉素處理過的CD4+Treg的糖攝取和糖酵解水平顯著下降，糖代謝相關(guān)基因和蛋白表達明顯下調(diào)。

免疫代謝已經(jīng)成為腫瘤免疫治療研究的一個重要領(lǐng)域，本研究證實，mTOR信號通路可調(diào)控與卵巢癌細胞共培養(yǎng)的CD4+Treg糖代謝，在促進免疫抑制微環(huán)境從而導致卵巢癌免疫逃逸的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此，在腫瘤微環(huán)境中，針對這一通路進行Treg 細胞能量代謝的再編程可能是一種新的腫瘤治療策略，有望為卵巢癌的免疫治療提供新的靶點。有研究認為，mTOR 的活性被認為是維持其抑制能力的必要條件［18］，目前的研究暫不足以說明mTOR 信號通路是否與卵巢癌微環(huán)境中CD4+Treg的抑制功能有關(guān)，而mTOR信號通路是否通過調(diào)控CD4+Treg 糖代謝進而影響其免疫抑制功能將是我們未來研究的重點。