劉思遠，陳 琳，夏安亮，朱明明，孫美玲，孫倍成

南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院肝膽外科，江蘇 南京 210008

近年來，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率和死亡率不斷上升。2020年，全球約有90.57萬例新確診的肝癌，在所有癌種中位列第6，同時約有83.02 萬人死于肝癌，是全球的第3 大腫瘤死因［1］。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在原發(fā)性肝癌中占90%，其發(fā)病原因主要包括乙肝病毒和丙肝病毒感染、酗酒和肥胖。其中，80%的HCC患者與乙肝和丙肝病毒感染相關(guān)，因而HCC可以被看成一種經(jīng)典的由炎癥引起的腫瘤［2］。

1 免疫療法在HCC治療中的興起

目前HCC 主流的治療方案包括肝切除、肝移植、射頻消融、經(jīng)肝動脈化療栓塞和蛋白激酶抑制劑等，手術(shù)治療是HCC 的一線治療措施。遺憾的是，由于缺乏特異性癥狀，大部分HCC 患者確診時已達中晚期，很難接受根治性治療，目前僅10%～25%的早期HCC 患者可以較好地接受外科手段進行干預(yù)［3］。此外，肝切后復(fù)發(fā)率高也是一大問題，接受肝切術(shù)的HCC患者，其5年復(fù)發(fā)率約為70%，5年存活率約在50%［4］。對于中晚期患者，可供選擇且公認有效的療法十分有限，如蛋白激酶抑制劑——索拉非尼，也僅能延長2.8 個月的生存時間［5］。所以，尋找并應(yīng)用新的針對HCC 更有效的治療方法是目前亟需解決的問題。

近年，HCC治療領(lǐng)域最受人注目的前沿進展當屬新型免疫療法，其中以嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）為基礎(chǔ)的細胞免疫治療和免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）的臨床結(jié)果最令人鼓舞。

HCC是一種對免疫療法敏感的腫瘤。當前，免疫檢查點PD-1 抑制劑（納武單抗［6］、派母單抗［7］）被批準用來治療HCC，此外，針對免疫檢查點CTLA-4的抗體和PD-1抑制劑聯(lián)用時，也可達到更好的抗腫瘤效果［8］。ICI 在HCC 治療領(lǐng)域取得廣泛應(yīng)用的同時，與其相關(guān)的不良反應(yīng)也引起了普遍的重視。ICI的免疫毒性較廣，可累及多個系統(tǒng)，易導(dǎo)致遲發(fā)性不良反應(yīng)，會對器官造成永久性的損害［9］。而CAR免疫細胞療法通過改造免疫細胞，提供了較安全的針對特定腫瘤抗原的方案。隨著CAR 免疫細胞療法的發(fā)展與應(yīng)用，近年來其已在多種血液病和實體腫瘤中進行臨床試驗，目前已有多款產(chǎn)品獲批上市，給腫瘤治療帶來了新的選擇［10］。表1 總結(jié)了國內(nèi)外最近正在開展的CAR 免疫細胞療法治療肝細胞癌的臨床試驗。

表1 正在開展的CAR細胞療法治療HCC的臨床試驗Table 1 Recently ongoing clinical trials with chimeric antigen receptor cell therapy in hepatocellular carcinoma

2 相關(guān)基礎(chǔ)理論知識

2.1 自然殺傷（natural killer，NK）細胞簡介及其作用機制

NK 細胞是先天免疫系統(tǒng)的重要成員，是一種特殊的細胞毒性淋巴細胞。NK 細胞在肝臟中扮演著重要角色，肝臟中30%～50%的淋巴細胞是NK 細胞，NK 細胞在肝臟中的比例是在脾臟或者外周血中的5倍［11］。據(jù)報道，HCC患者的肝NK細胞數(shù)量顯著增加，占所有肝淋巴細胞的90%。NK細胞表達不同的活化性受體和抑制性受體，通過受體間激活與抑制信號的凈平衡來控制對靶細胞的反應(yīng)或耐受［12］。NK 細胞在清除腫瘤方面至關(guān)重要，可以通過多種方式來清除腫瘤細胞或限制腫瘤細胞的生長、擴散。一方面，NK 細胞可以直接釋放穿孔蛋白、顆粒酶等細胞毒性物質(zhì)或者分泌細胞因子來殺傷腫瘤細胞，如腫瘤壞死因子-α和干擾素（interferon，IFN）-γ。另一方面，NK細胞能夠發(fā)揮抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用（antibody-dependent cellmedicated cytotoxicity，ADCC）［13］。此外，NK 細胞還能通過分泌細胞因子和趨化因子調(diào)節(jié)其他細胞的免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者外周血和肝臟組織中NK 細胞的比例明顯減少，活性降低，同時NK 細胞的浸潤能力和釋放因子的能力顯著減弱，這與HCC 的進展和患者的存活率密切相關(guān)［14］。Zerbini等［15］研究發(fā)現(xiàn)HCC 患者進行射頻消融治療破壞HCC腫瘤組織時，NK細胞的功能可得到顯著增強，具體表現(xiàn)在外周血NK細胞數(shù)量的增加以及釋放更多的細胞因子。

盡管NK細胞能夠識別和殺傷腫瘤細胞，但是，腫瘤細胞也有自己的機制來規(guī)避NK細胞的識別與殺傷。例如，腫瘤細胞可以產(chǎn)生免疫抑制性細胞因子白細胞介素（interleukin，IL）-10 或轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β來抑制NK 細胞發(fā)揮相應(yīng)的功能效應(yīng)［16］。不僅如此，腫瘤細胞還可以通過減少腫瘤相關(guān)抗原的表達和提高主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類（major histocompatibility classⅠ，MHC-Ⅰ）相關(guān)分子的表達來躲避NK 細胞的殺傷，促使NK細胞失活［17］。

2.2 CAR-NK細胞的構(gòu)建及其優(yōu)勢

為了克服這種免疫逃避，研究者們設(shè)計了CAR。CAR 是一種經(jīng)基因工程改造的人工受體，可使免疫細胞特異性地識別腫瘤相關(guān)抗原，從而更精準高效地發(fā)揮抗腫瘤作用。CAR 的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)設(shè)計包含一個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（含共刺激域和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域），一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個胞外結(jié)構(gòu)域，胞外域包括鉸鏈區(qū)和來源于腫瘤特異性抗體的單鏈可變區(qū)片段（single-chain fragment variable，ScFv）。目前，應(yīng)用最普遍的CAR 的導(dǎo)入方式是將CAR 的完整序列克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體質(zhì)粒中，并進一步包裝成病毒，用于感染NK 細胞，以此來構(gòu)建CARNK細胞［18］。CAR-NK細胞可以強化NK細胞的靶向殺傷功能，因為CAR-NK 不僅可以通過CAR介導(dǎo)識別腫瘤細胞發(fā)揮作用，同時還能夠利用自身的受體攻擊腫瘤細胞［19］。

同樣，通過給T 細胞導(dǎo)入CAR 而構(gòu)建的CAR-T細胞也可以強化T 細胞的靶向殺傷功能。目前，CAR-T細胞已被用于治療HCC并取得了進展，顯示出優(yōu)異的抗腫瘤活性［20］?？蛇z憾的是，雖然CAR-T細胞在HCC治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了較好的前景，但由于其固有的缺陷，限制了更廣泛的應(yīng)用。與CAR-T細胞相比，CAR-NK 細胞主要有兩個顯著的優(yōu)勢［21］。首先，CAR-NK 細胞的制備時間更短。由于擔(dān)心引起移植物抗宿主病，CAR-T 細胞主要采用患者自體的T細胞，制備時間可長達數(shù)周。而NK細胞的來源則更廣泛，患者可以選擇異體來源的已制備的“即用型”CAR-NK細胞，周期更短，價格也更低。其次，CAR-NK 細胞的安全性更高。在細胞治療中，CART 細胞釋放的細胞因子（如IL-1、IL-2、IL-6 等）易導(dǎo)致細胞因子釋放綜合征和神經(jīng)毒性等嚴重不良反應(yīng)，如果處理不及時會危及患者生命［22］。而NK 細胞主要釋放IFN-γ和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，因此產(chǎn)生嚴重不良反應(yīng)的風(fēng)險較低［23］。

2.3 CAR-NK的細胞來源及其優(yōu)缺點

CAR-NK 細胞的來源可分為自體NK 細胞來源和異體NK 細胞來源。實驗表明，由IL-2 刺激的自體NK 細胞雖然治療安全性高，但療效不確切。自體NK 細胞沒有表現(xiàn)出良好的臨床反應(yīng)可能與自體NK細胞的功能障礙有關(guān)，如抑制性殺傷細胞免疫球蛋白樣受體識別MHC-Ⅰ類分子導(dǎo)致NK細胞功能受抑制，IL-2的應(yīng)用使外周血中抑制性的調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量增加等［24］。相較之下，異體NK細胞的應(yīng)用則更為廣泛。異體NK細胞有多種來源，如臍血、外周血、胚胎干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞和NK細胞系（如NK-92）等［25］。近年的研究表明，接受異體NK細胞免疫治療的HCC患者總體生存率得到了明顯提高［26］。

NK-92細胞株具有良好的細胞毒性和擴增動力學(xué)，所以將CAR導(dǎo)入NK-92細胞株獲得的CAR-NK-92 細胞是目前異體NK 細胞回輸治療的主力軍［27］。值得注意的是，由于NK-92 細胞株來源于淋巴瘤細胞，所以其回輸安全性問題無法回避。同時，NK-92 細胞缺乏多種可以促發(fā)細胞毒性的天然受體，導(dǎo)致其在監(jiān)視抗原丟失的腫瘤細胞時，也無法像原代NK 細胞那樣利用自身抗體來發(fā)揮抗腫瘤作用［28］。

Liu等［29］研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血來源的NK細胞比外周血來源的NK細胞更年輕，增殖能力更強，且不良反應(yīng)更少。此外，冷凍的臍帶血不僅容易獲得具有高增殖能力的高功能NK 細胞，而且具有回輸通用性（無需篩選合適的個體供體）。因此，臍帶血被認為是一種具有明顯優(yōu)勢的現(xiàn)成NK細胞來源。

總的來說，NK 細胞的治療反應(yīng)被認為是抑制信號和活化信號綜合的結(jié)果，而不同NK 來源的CAR-NK細胞在增殖能力、細胞毒性等功能和安全性上存在著差異，這意味著今后仍需不斷地篩選并改善NK細胞的功能，以增強CAR-NK的抗癌效果［30］。

3 針對不同靶點的CAR-NK在HCC治療中的應(yīng)用

采用CAR-NK 細胞療法治療HCC 的首要挑戰(zhàn)是確定一個安全且有效的腫瘤相關(guān)抗原。合理選擇具有HCC高特異性的腫瘤相關(guān)抗原，是保障CAR-NK治療效益的關(guān)鍵。近年來，針對不同靶點的CARNK 細胞的臨床前研究都顯示出了良好的抗腫瘤效果［27，31-32］。

3.1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）CAR-NK

GPC3 是一種膜相關(guān)蛋白多糖，據(jù)統(tǒng)計70%以上的HCC 患者腫瘤組織高表達GPC3 蛋白，而正常的肝組織中并不表達該蛋白。GPC3 在HCC 的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，并且GPC3的表達水平與HCC 的不良預(yù)后高度相關(guān)，即使在疾病復(fù)發(fā)后，GPC3在細胞上的表達也會維持［33］。近期，Zhu等［34］證明使用靶向GPC3的抗體來治療HCC是安全有效的。基于以上原因，GPC3 成為了HCC 免疫治療的理想靶點，以GPC3 為靶點的CAR 有望獲得更精準高效的抗癌能力。Shi等［20］進行的一項GPC3 CAR-T細胞治療晚期HCC的Ⅰ期試驗取得了令人鼓舞的結(jié)果，經(jīng)治療后患者的3 年、1年和6個月的總生存率分別為10.5%、45.0%，50.3%，展現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。

近期，Yu等［27］通過慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)開發(fā)出了具有GPC3 特異性的GPC3 CAR-NK 細胞株（NK-92/9.28.z）。研究發(fā)現(xiàn)，不管在體內(nèi)還是體外，NK-92/9.28.z 細胞都能夠顯著提升NK 細胞對HCC 的細胞毒性，同時不會增加對非腫瘤細胞的毒性。并且，NK-92/9.28.z 細胞的抗腫瘤活性不會受到肝癌患者血清中的可溶性GPC3、TGF-β和低氧環(huán)境的影響。此外，NK-92/9.28.z 細胞還具有持續(xù)增殖的能力，更具臨床成本效益。

3.2 CD147 CAR-NK

CD147是一種屬于免疫球蛋白家族的跨膜糖蛋白，參與了多種生理和病理過程，如營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運、細胞的遷移、精子的形成、單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達、淋巴細胞的活化和冠狀病毒的感染等［35-36］。盡管CD147作用廣泛，但其在腫瘤免疫中所發(fā)揮的作用才是近十年研究的重點方向。近些年的一系列研究表明，CD147在免疫細胞的激活和增殖，腫瘤細胞的遷移、黏附和侵襲中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［37］。

CD147 在HCC 中高度表達，且高表達的CD147與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)［38］。近期，CD147 被提議作為HCC 新的預(yù)后標志物和治療靶點［39-40］。Chen 等［41］開展的臨床實驗結(jié)果表明，美妥珠單抗（抗CD147）在抑制HCC 生長和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮出了良好的效果。

Tseng 等［31］的一項關(guān)于CD147 CAR 修飾的NK細胞治療HCC 的研究驗證了CD147 靶點在特異性殺傷方面的臨床應(yīng)用潛力。其設(shè)計了一種針對HCC 的抗原，通過逆轉(zhuǎn)錄載體，將識別表面標志物CD147 的CAR 轉(zhuǎn)導(dǎo)入NK 細胞，隨之進行了體內(nèi)和體外實驗。CD147 CAR 可以選擇性地殺傷雙抗原陽性（CD147+GPC3+），而不是單抗原陽性（CD147+GPC3-）的HCC細胞。并且，在人CD147轉(zhuǎn)基因小鼠中沒有觀測到嚴重的脫靶毒性。CD147 CAR-NK細胞在體外可以有效且特異地殺傷各種惡性HCC 細胞系，在體內(nèi)可以較好地抑制HCC 細胞的生長，同時在HCC 患者腫瘤組織來源的異種移植小鼠PDX模型中展示了良好的腫瘤清除效果。

與其他針對HCC 的CAR 相比，CD147-CAR 具有兩個明顯的優(yōu)點。首先，作為CAR介導(dǎo)的新型有效靶點，其在體外和體內(nèi)均具有高特異性和可耐受的毒性。其次，CD147 CAR-NK 細胞還具有用于治療各種CD147上調(diào)腫瘤的潛力。

3.3 自然殺傷細胞2族成員D（natural killer group 2 member D，NKG2D）CAR-NK

NK細胞對腫瘤細胞的識別主要依賴于表面的活化性受體和抑制性受體的相互調(diào)控，NKG2D是一個關(guān)鍵的活化性受體，在所有NK 細胞中表達。在早期NK 細胞前體階段已經(jīng)觀察到NKG2D 的表達，同時該受體的濃度隨著NK細胞的成熟而增加［42］。

NKG2D 有多種NKG2D 配體（ligand of NKG2D，NKG2DL），包括MHC-Ⅰ類相關(guān)基因A（MHC-Ⅰchain-related protein A，MICA）和MHC-Ⅰ類相關(guān)基因B（MHC -Ⅰchain -related protein B，MICB）。NKG2D通過與其配體結(jié)合，激活NK細胞產(chǎn)生IFN-γ等細胞因子，發(fā)揮免疫監(jiān)視和抗腫瘤功能［43］。但在晚期腫瘤中，NKG2D/NKG2DL 的表達卻明顯下降，這可能與腫瘤細胞分泌TGF-β和血清中的可溶性MICA/B 的水平升高有關(guān)［44］。作為一種免疫抑制因子，TGF-β可以促進MICA 的脫落和抑制NKG2D 的表達。此外，Kohga 等［45］發(fā)現(xiàn)HCC 患者血清中的可溶性MICA/B 的水平遠遠高于健康人。高水平的可溶性MICA/B 可以通過金屬基質(zhì)蛋白酶從細胞表面脫落，從而下調(diào)NKG2D 的表達［46］。同時，研究發(fā)現(xiàn)高級別的HCC 低表達各類NKG2DL，通過阻礙NKG2D/NKG2DL信號通路來實現(xiàn)免疫逃逸［47］。

NKG2D 的強激活效力以及NKG2DL 在惡性腫瘤細胞上的選擇性表達使其成為免疫領(lǐng)域關(guān)注的新型重要靶點［48］。有多種方式可以通過NKG2D 靶向腫瘤，包括向腫瘤募集NKG2D+細胞、增強NK 細胞上NKG2D 和/或腫瘤上NKG2DL 的表達、用表達NKG2D CAR 的NK 細胞，治療或直接靶向表達NKG2DL 的腫瘤細胞。與針對腫瘤特異性抗原的CAR 相比，NKG2D CAR 有兩個特點：首先，從構(gòu)成上，NKG2D受體胞外域并不屬于ScFv，基于NKG2D的CAR 并不僅僅是特異性識別NKG2DL 的改造TCR，而是將特異性結(jié)合NKG2DL的NKG2D受體的胞外域同轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR 胞內(nèi)激活信號的CD3ζ的信號域相融合［49］，使其通過NKG2D 精準識別NKG2DL+腫瘤細胞，獨立于TCR，直接向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活信號，產(chǎn)生更多的炎性細胞因子和表達出更強的細胞毒性［50］；其次，在作用上，NKG2D CAR 利用了腫瘤細胞相對特異的表達NKG2DL 的特征，且NKG2D CAR 不僅識別腫瘤細胞，也會識別在免疫抑制細胞上表達的NKG2DL，如骨髓來源的抑制細胞、調(diào)節(jié)性T 細胞、腫瘤微環(huán)境中的內(nèi)皮細胞等，更具有普適性。

Chang 等［32］發(fā)現(xiàn)NKG2D CAR 的表達可以明顯提高NK 細胞對腫瘤的細胞毒性潛力，激活NK 細胞，增強對腫瘤的殺傷。Chang 等設(shè)計了一種被稱為NKG2D-DAP10-CD3ζ的受體，它由NK 細胞激活分子NKG2D及兩個關(guān)鍵信號分子DAP10和CD3ζ組成，并評估了其在體外和小鼠模型中殺傷癌細胞的能力。研究表明，NKG2D CAR 顯著提高了NK細胞表面NKG2D的表達，這些細胞對腫瘤細胞的毒性較對照組更高。在小鼠腫瘤模型中，表達NKG2DDAP10-CD3ζ的NK 細胞具有更高的抗腫瘤活性，CAR的表達明顯提升了其細胞因子的釋放，降低了腫瘤負荷。此外，Chang 等還運用一種新型的電轉(zhuǎn)方法，可以在NK 細胞中快速、大量地表達該受體，以期解決因腫瘤患者血NK 細胞數(shù)目減少，擴增困難，而難以高效率地批量制備CAR 的問題，助推NKG2DCAR-NK的應(yīng)用。

4 CAR-NK聯(lián)合免疫檢查點抑制劑

總體來看，盡管有很多CAR-NK 的基礎(chǔ)研究和臨床試驗正在積極推進，然而當前CAR-NK 對HCC的治療效果并不如血液病那樣可觀，研究認為這可能與實體瘤中免疫抑制的腫瘤微環(huán)境有關(guān)［51］。免疫反應(yīng)是由刺激性和抑制性的免疫檢查點分子控制的。一般而言免疫檢查點的表達可以維持自我耐受，避免產(chǎn)生針對正常細胞的免疫反應(yīng)，然而腫瘤細胞卻可以通過刺激免疫檢查點來實現(xiàn)免疫逃逸。

近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)基于NK 細胞的檢查點數(shù)量一直在增加。除了經(jīng)典的NK細胞表面受體，如自然殺傷細胞2 族成員A（natural killer group 2 member A，NKG2A）、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體和白細胞免疫球蛋白樣受體外，另外的一些檢查點也被證實會導(dǎo)致腫瘤中的NK 細胞功能障礙，這些檢查點包括已在臨床取得較大進展的PD-1、CTLA-4 和新近發(fā)現(xiàn)的B7H3、LAG-3、TIGIT、TIM-3、Siglec-7/9、CD200R 和CD47 等［52］。而隨著ICI 的發(fā)展與應(yīng)用，ICI 已被批準用來治療HCC，顯示出了較好的療效和長期的臨床改善。作為新的治療工具，ICI已在HCC 中展現(xiàn)出令人欣喜的抗腫瘤活性和可控的耐受性。近期一些臨床試驗在陸續(xù)進行，以確定ICI 在實體腫瘤患者中的安全性和有效性［53-54］。

不僅如此，由于實體腫瘤的異質(zhì)性及免疫微環(huán)境的復(fù)雜性，CAR 和ICI 的聯(lián)合應(yīng)用正逐漸取代單藥治療，成為目前探索的熱點。聯(lián)合用藥的最大優(yōu)勢在于二者在治療中可以產(chǎn)生協(xié)同作用［55-56］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制性免疫檢查點會在腫瘤患者NK 細胞中上調(diào)并導(dǎo)致NK 細胞功能的衰竭，如PD-1/PD-L1 免疫抑制性途徑的存在大大削弱了NK細胞的治療效果。而通過ICI 進行抗體封閉可增強CAR-NK 細胞的殺傷活性，有效逆轉(zhuǎn)NK 細胞耗竭和恢復(fù)抗腫瘤免疫［57］。

CAR和ICI的聯(lián)用可以分為兩類。一類是直接聯(lián)用已有的獲批藥物，優(yōu)點是藥物的可靠性和有效性都有著較高保障，如PD-1/PD-L1類。目前這一類的臨床試驗正在如火如荼地開展，比如CAR聯(lián)合帕博利珠單抗的Ⅰ期和Ⅱ期臨床研究（NCT04995003、NCT04847466），聯(lián)合納武單抗的Ⅰb 期臨床研究（NCT05352828），聯(lián)合卡瑞利珠單抗的Ⅱ期臨床研究（NCT05320081），聯(lián)合替雷利珠單抗的Ⅱ期臨床研究（NCT04539444）均在進行之中。另一類是聯(lián)用針對NK 細胞特異的ICI，如NKG2A 抑制劑，這一類屬于在理論上更為貼近的聯(lián)用，目前相關(guān)臨床前研究也取得了進展［58-59］，但具體效果仍需進一步臨床試驗來檢驗。

4.1 聯(lián)合PD1/PDL1抑制劑

研究表明，NK 細胞表面的抑制性檢查點PD-1深刻影響著NK 細胞的活化和效應(yīng)功能［60］。雖然PD-1免疫檢查點最初是在T淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)的，但現(xiàn)已證明NK細胞同樣表達PD-1受體［61］。除了T細胞相關(guān)通路外，PD-1檢查點抑制劑還可能通過激活NK 細胞來增強先天免疫系統(tǒng)。近期一項Ⅱ期臨床試驗意在通過檢測NK細胞的耗竭/增殖來評估PD-1抑制劑對腫瘤患者NK細胞功能的影響。PD-1與瘤內(nèi)NK 細胞功能的紊亂密切相關(guān)，PD-1+NK 細胞較PD-1-NK 細胞釋放IFN-γ的能力更弱，同時CD107a的表達量更低［62-63］。另外，在腫瘤微環(huán)境的影響下，HCC 患者腫瘤細胞表面高表達PD-1 的配體PD-L1［64］，從而抑制表達PD-1 的CAR-NK 細胞的功能。

通過封閉PD-1/PD-L1 信號通路來逆轉(zhuǎn)T 細胞的功能，開啟了免疫治療的新紀元［65］。之前認為阻斷PD-1/PD-L1 通路的作用多數(shù)體現(xiàn)在恢復(fù)T 細胞的功能上，但由于許多腫瘤丟失了人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）且不表達新抗原，導(dǎo)致CD8+T細胞并不能識別腫瘤細胞，從而難以得益于PD-1/PD-L1通路的阻斷作用。而NK細胞雖不表達腫瘤特異性的識別受體，但可以識別HLA丟失的腫瘤細胞（HLA低表達的腫瘤往往表達高水平的PDL1），從而受益于PD-1/PD-L1通路的阻斷作用［66］。

利用PD-1 阻斷劑恢復(fù)NK 在HCC 腫瘤微環(huán)境中的作用，極有可能是未來極具前景的免疫療法。Hsu等［55］通過小鼠腫瘤模型發(fā)現(xiàn)，活化的NK細胞表達PD-1，并且PD-L1+腫瘤細胞與PD-1 結(jié)合會抑制NK 細胞介導(dǎo)的對腫瘤的免疫反應(yīng)，通過阻斷PD-1/PD-L1就能夠有效激活NK細胞的反應(yīng)性。NK細胞得益于PD-1/PD-L1 的阻斷作用主要表現(xiàn)在細胞因子如IFN-γ的釋放增多，同時表達更多的活化指標CD107a［55］。日前Lin等［56］開展的一項臨床試驗也證明了帕博利珠單抗（PD-1單抗）聯(lián)合NK細胞在晚期腫瘤患者中的安全性和有效性。Lin 等將患者隨機分配到A 組（帕博利珠單抗聯(lián)合NK 細胞治療）和B組（僅給予帕博利珠單抗治療）。結(jié)果表明A組患者的中位生存期（15.5個月）優(yōu)于B組（13.3個月）。此外，A 組中接受多療程NK 細胞輸注的中位生存期（18.5 個月）優(yōu)于接受NK 細胞單療程輸注的患者（13.5個月）。

總之，腫瘤微環(huán)境中PD-1/PD-L1信號通路會抑制NK 細胞發(fā)揮功能效應(yīng)，如細胞毒性和細胞因子的分泌功能等［57］。因此，和PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合的CAR-NK 在保持原有的對HCC 的特異靶向性的同時，很有可能得益于PD-1/PD-L1 的阻斷，逆轉(zhuǎn)HCC 腫瘤微環(huán)境對CAR-NK 的負調(diào)節(jié)作用，從而恢復(fù)NK細胞的功能。

4.2 聯(lián)合NKG2A/HLA-E抑制劑

NK 細胞通過表達一系列的免疫受體來識別腫瘤細胞，從而維持NK細胞的活化和耐受，NKG2A是NK 細胞表面重要的抑制性受體［51］。在腫瘤微環(huán)境的影響下，HCC 患者腫瘤細胞表面高表達NKG2A的配體HLA-E［67］。HLA-E 是一種非經(jīng)典MHC Ⅰ類蛋白，NKG2A通過結(jié)合HLA-E，向NK細胞傳遞負調(diào)控信號，抑制NK 細胞的因子分泌和細胞毒性［68-69］。Sun 等［67］研究發(fā)現(xiàn)HCC 患者外周血中和瘤內(nèi)的NK細胞表面的NKG2A 表達升高會引起NK 細胞的耗竭，表現(xiàn)為細胞因子分泌的減少和殺傷能力的減弱，進而影響HCC 患者的總生存期。另外，免疫微環(huán)境中的巨噬細胞和樹突狀細胞會釋放大量的IL-12，IL-12 的釋放導(dǎo)致HCC 患者的NKG2A 表達明顯增高，進而誘導(dǎo)NK細胞功能的耗竭［58］。

正因如此，NKG2A/HLA-E 也作為腫瘤微環(huán)境中的新檢查點而備受關(guān)注。近期，Kamiya等［58］設(shè)計了一種缺乏NKG2A 的高功能NK 細胞，以此來繞過HLA-E 的負調(diào)控。這種使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體制備的NKG2AnullNK細胞消除了NKG2A的表達，載體來自于和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留域相連的NKG2A 抗體的ScFv段。實驗表明，NKG2AnullNK 細胞對表達HLA-E 的腫瘤細胞具有明顯更高的細胞毒性。NKG2A 的下調(diào)解除了HLA-E 的負調(diào)控，使得NK 細胞分泌細胞因子增多。同時，NKG2A 的下調(diào)也會增加ADCC活性，并抑制IL-12 對NKG2A 的上調(diào)。在隨后的免疫缺陷小鼠模型中，相較于NKG2A+NK 細胞，NKG2AnullNK細胞更為有效地降低了腫瘤負荷并顯著提升了小鼠的存活率。

在另一項相關(guān)研究中，Andre 等［59］揭示了聯(lián)合NKG2A單抗的聯(lián)合療法具有強大的抗癌潛力，阻斷NKG2A 可增強體內(nèi)NK 細胞的免疫活性，從而提高抗腫瘤反應(yīng)。研究者們開發(fā)出一種人源化的抗NKG2A 抗體（莫那利珠單抗）來進行實驗。在動物實驗中，研究者們按治療方式將小鼠分為單獨用藥組、聯(lián)合用藥組和對照組。結(jié)果相較于對照組，單獨用藥組的小鼠存活率為40%，而聯(lián)合用藥的存活率高達75%。在Ⅱ期臨床試驗中，研究者們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合莫那利珠單抗的聯(lián)合療法能夠獲得31%的客觀緩解率，使50%患者的病情得到穩(wěn)定控制，更有1例患者的病灶完全消失，顯示出了較高的緩解率和持久的反應(yīng)性，且未見嚴重不良反應(yīng)。

綜上，將抗NKG2A 的免疫檢查點抑制劑和CAR-NK 細胞聯(lián)合治療HCC，既可以精準、快速、高效地靶向腫瘤，又可以克服HLA-E 介導(dǎo)的腫瘤對NK細胞的抵抗，提高CAR-NK的功能。目前這一思路正得到越來越多的關(guān)注，作為第一代抗癌免疫療法的補充，有望在將來HCC的基礎(chǔ)研究和臨床治療中展現(xiàn)進一步效果。

5 小結(jié)與展望

CAR-NK細胞療法憑借其出色的安全性和確切的療效成為了肝癌免疫治療領(lǐng)域的一顆新星，近年來針對不同靶點的CAR-NK細胞的臨床前研究都顯示出了良好的抗腫瘤效果，與ICI 的聯(lián)合應(yīng)用也體現(xiàn)出了強大的抗癌活性。但無法回避的是，若想實現(xiàn)肝癌的可靠治愈，CAR-NK 還需克服諸多挑戰(zhàn)。未來CAR-NK 需要持續(xù)優(yōu)化CAR的設(shè)計，以期獲得更好的特異性、更強的細胞毒性和更高的安全性。此外，如何逆轉(zhuǎn)不斷變化的腫瘤微環(huán)境對NK 細胞的抑制，恢復(fù)NK細胞的功能以增強CAR-NK的抗癌效果更是任重而道遠的課題。欣喜的是，目前有很多CAR-NK 的基礎(chǔ)研究和臨床試驗正在積極推進，而隨著這些難題被不斷突破，相信將來CAR-NK 會在肝癌的免疫治療中獲得更廣闊的應(yīng)用前景。