鄒佩良 鄒嘉茹 蔡家麗 何啟雄 周建甫 向松濤

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是全球常見惡性腫瘤之一,在男性中的發(fā)病率僅次于肺癌[1]。多數(shù)晚期PCa患者經(jīng)雄激素剝奪治療(androgen deprivation therapy, ADT)1～2年后便會(huì)產(chǎn)生耐受并逐漸演變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔?castration-resistant prostate cancer, CRPC)[2]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)多種中藥單體具有良好的抗腫瘤作用,其中,重樓皂苷Ⅰ(polyphyllin Ⅰ, PPⅠ)為重樓中最主要的活性成分,可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡和自噬以及抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、提高化療敏感性和調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境等途徑發(fā)揮其抗腫瘤作用[3-4],但其對CRPC的作用及機(jī)制研究尚少。因此,本文在已有研究的基礎(chǔ)上[5],繼續(xù)探討PPⅠ對CRPC DU145細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制。

材料與方法

一、試劑來源及細(xì)胞培養(yǎng)

PPⅠ購自成都曼徹斯特公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、胰酶和磷酸鹽緩沖液均購自美國Gibco公司;MTT粉和DMSO均購自廣州威佳科技有限公司;細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和蛋白上樣緩沖液均購自碧云天生物公司;一抗p-ERK1/2、ERK1/2、特異性蛋白1(specificity protein 1, SP1)、Zeste基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)及羊抗兔二抗均購自CST公司;SP1、EZH2過表達(dá)質(zhì)粒(pcMV6-SP1、pcMV6-EZH2)和EZH2啟動(dòng)子質(zhì)粒(p-EZX-PG04-EZH2)均由廣東省中醫(yī)院韓守威教授團(tuán)隊(duì)提供。人CRPC DU145細(xì)胞株由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供。將細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱。

二、MTT檢測細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期細(xì)胞,以3×103/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的PPⅠ(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μmol·L-1)溶液100 μl,分別培養(yǎng)24、48、72 h后,每孔加入濃度0.5 g·L-1的MTT溶液110 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,每孔加入DMSO 150 μl,在570 nm波長處測定每孔吸光值(A值),設(shè)空白組細(xì)胞存活率為100%,細(xì)胞存活率(%)=(加藥組A值/空白組A值)×100%。

三、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

取對數(shù)生長期細(xì)胞,以3×105/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的PPⅠ(0、0.4、0.8、1.2 μmol·L-1)溶液2 ml,培養(yǎng)24 h后使用胰酶(不含EDTA)收集細(xì)胞,將5×Binding Buffer使用去離子水稀釋成1×Binding Buffer后重懸細(xì)胞,每管加入Annexin V-FITC 5 μl和PI 10 μl,避光孵育5 min,采用流式細(xì)胞儀檢測樣品凋亡情況,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

四、Western blot檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期細(xì)胞,以3×105/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后裂解并刮下細(xì)胞,離心后去掉其他細(xì)胞成分,使用微量核酸蛋白定量儀測定各蛋白樣品的濃度及純度;加入蛋白上樣緩沖液后振蕩離心,取蛋白樣品于10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離之后再進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉,在4 ℃條件下與一抗孵育過夜;二抗室溫孵育1 h,采用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá),并進(jìn)行灰度值分析。

五、轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒檢測蛋白間關(guān)系

取2個(gè)4 ml EP 管,1管加入Opti-MEM 125 μl、Lipofectamine 3000 5 μl,另外1管加入Opti-MEM 125 μl、P 3000 5 μl,SP1和EZH2過表達(dá)質(zhì)粒2 μg,然后將兩管液體輕輕混勻后于室溫靜置5 min,加入轉(zhuǎn)染孔中對DU145細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24 h,再使用PPⅠ作用于DU145細(xì)胞24 h后,提取蛋白行Western blot檢測。

六、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測EZH2啟動(dòng)子活性

取對數(shù)生長期細(xì)胞,以5×104/孔細(xì)胞密度及500 μl培養(yǎng)液/孔體積接種于24孔板,待細(xì)胞貼壁后,每孔配制化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑Opti-MEM 50 μl、Lipofectamine 3000 1 μl 、 P 3000 1 μl和EZH2啟動(dòng)子質(zhì)粒(p-EZX-PG04-EZH2)0.5 μg的混合液,靜置5 min后加入孔中,轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行分組處理,每孔吸出100 μl上清到對應(yīng)離心管(每個(gè)樣品備2個(gè)),取其中1份含上清離心管置于65 ℃水浴鍋中15 min,另外1份含上清離心管則置于室溫;將未水浴和水浴后的上清樣品各取出10 μl移入底部不透光的96 孔板中,按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書配制試劑并對應(yīng)加入樣品后振板5 s,使用熒光酶標(biāo)儀檢測、收集數(shù)據(jù)并計(jì)算未水浴樣品與水浴樣品的熒光強(qiáng)度值。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、PPⅠ對DU145細(xì)胞存活率的影響

與空白組相比,隨著給藥濃度和時(shí)間的延長,DU145細(xì)胞存活率逐漸下降,并呈劑量和時(shí)間依賴性,表明PPⅠ能抑制DU145細(xì)胞的增殖(圖1)。

圖1 不同濃度PPⅠ對DU145細(xì)胞存活率的影響

二、PPⅠ對DU145細(xì)胞凋亡的影響

與空白組相比,隨著給藥濃度的增加,DU145細(xì)胞的早期凋亡率逐漸增加,表明PPⅠ以劑量依賴性誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡(圖2)。

A:4組細(xì)胞的早期凋亡散點(diǎn)圖(各組右下象限所示為早期凋亡細(xì)胞);B:4組細(xì)胞的早期凋亡率(與空白組相比,*P<0.05,**P<0.01)圖2 流式細(xì)胞儀檢測不同濃度PPⅠ對DU145細(xì)胞早期凋亡的影響

三、PPⅠ對p-ERK1/2與ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

使用0.8 μmol·L-1PPⅠ作用于DU145細(xì)胞,采用Western blot檢測第0、0.5、2、4、8、24 h時(shí)p-ERK1/2與ERK1/2蛋白的表達(dá)。隨著時(shí)間的推移,PPⅠ逐漸增加p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的表達(dá),與0 h時(shí)相比,p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的表達(dá)在2 h開始有明顯差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

圖3 DU145細(xì)胞p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)電泳圖

四、PPⅠ對SP1、EZH2蛋白表達(dá)的影響

使用不同濃度的PPⅠ(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μmol·L-1)作用于DU145細(xì)胞24 h后,隨著給藥濃度的增加,SP1與EZH2蛋白的表達(dá)逐漸降低,與空白組比較,SP1與EZH2蛋白的表達(dá)均從1.2 μmol·L-1開始明顯降低(P<0.05),見圖4。

圖4 DU145細(xì)胞SP1、EZH2蛋白表達(dá)電泳圖

五、抑制ERK1/2后PPⅠ對SP1表達(dá)的影響

使用ERK1/2抑制劑(PD98059)作用于DU145細(xì)胞2 h,再加入0.8 μmol·L-1PPⅠ處理24 h后檢測SP1的表達(dá)。與空白組相比,PPⅠ組SP1表達(dá)降低(P<0.05);與PPⅠ組相比,ERK1/2抑制劑+PP Ⅰ組SP1表達(dá)增加(P<0.05),見圖5。

六、SP1過表達(dá)對EZH2蛋白表達(dá)的影響

PPⅠ(0.8 μmol·L-1)組及PPⅠ+空白質(zhì)粒組EZH2蛋白的表達(dá)較空白組及空白質(zhì)粒組偏少,而PPⅠ+SP1過表達(dá)質(zhì)粒組 EZH2蛋白的表達(dá)較PPⅠ組及PPⅠ+空白質(zhì)粒組相比偏高(P<0.05),見圖6。

A:予ERK1/2抑制劑后SP1表達(dá)電泳圖;B:抑制ERK1/2后PPⅠ對SP1表達(dá)的影響與空白組比較,*P<0.05;與PPⅠ組比較,**P<0.05)圖5 Western blot檢測抑制ERK1/2后PPⅠ對SP1表達(dá)的影響

A:予SP1過表達(dá)質(zhì)粒后EZH2蛋白表達(dá)電泳圖;B:SP1過表達(dá)對EZH2蛋白表達(dá)的影響與空白組比較,*P<0.05;與PPⅠ組比較,**P<0.05)圖6 Western blot檢測SP1過表達(dá)對EZH2蛋白表達(dá)的影響

七、EZH2過表達(dá)對SP1表達(dá)的影響

與SP1過表達(dá)檢測EZH2蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反,EZH2過表達(dá)不能逆轉(zhuǎn)PPⅠ對SP1表達(dá)的下調(diào)作用,PPⅠ+EZH2過表達(dá)質(zhì)粒組與PPⅠ組相比,SP1的表達(dá)無明顯差異(P>0.05),見圖7。

A:予EZH2過表達(dá)質(zhì)粒后SP1表達(dá)電泳圖;B: EZH2過表達(dá)對SP1表達(dá)的影響與空白組比較,*P<0.05)圖7 Western blot檢測EZH2過表達(dá)后對SP1表達(dá)的影響

八、予PPⅠ及SP1過表達(dá)檢測EZH2啟動(dòng)子活性

PPⅠ組(0.8 μmol·L-1)EZH2啟動(dòng)子活性與空白組及空白質(zhì)粒組相比偏低,PPⅠ+SP1過表達(dá)質(zhì)粒組的EZH2啟動(dòng)子活性與PPⅠ組及PPⅠ+空白質(zhì)粒組相比偏高(P<0.05),見圖8。

A:予SP1過表達(dá)質(zhì)粒后SP1表達(dá)電泳圖;B:PPⅠ和SP1過表達(dá)對EZH2啟動(dòng)子活性的影響與空白組比較,*P<0.05;與PPⅠ組比較,**P<0.05)圖8 Western blot檢測PPⅠ和SP1過表達(dá)對EZH2啟動(dòng)子活性的影響

討 論

PPⅠ已被證實(shí)具有良好的抗腫瘤活性,可通過多種抗癌機(jī)制對多種腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抑制作用[6-8]。對于形成機(jī)制復(fù)雜且預(yù)后較差的CRPC,PPⅠ或許能成為治療CRPC或逆轉(zhuǎn)CPRC細(xì)胞從激素依賴到非依賴的新型靶向藥物。

本研究以人CRPC DU145細(xì)胞為研究對象,發(fā)現(xiàn)PPⅠ以劑量及時(shí)間依賴性方式抑制DU145細(xì)胞生長,以劑量依賴性方式誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡。與空白組相比,DU145細(xì)胞的存活率和早期凋亡率從PPⅠ濃度0.4 μmol·L-1開始時(shí)已產(chǎn)生明顯差異,當(dāng)PPⅠ濃度增至0.8 μmol·L-1時(shí),DU145細(xì)胞存活率顯著降低,早期凋亡率顯著增加,表明少量PPⅠ即可對DU145細(xì)胞產(chǎn)生高效抑制作用。多項(xiàng)研究也表明PPⅠ能以低劑量誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡,并可抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和逆轉(zhuǎn)耐藥等[9-13]。因此,我們推測PPⅠ也能夠通過相關(guān)凋亡通路誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡,抑制癌細(xì)胞的增殖,發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。

ERK1/2是MAPK信號通路的重要一員,參與細(xì)胞分裂、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移、自噬及免疫等方面的調(diào)控,ERK1/2相關(guān)通路激活后可明顯抑制包括PCa在內(nèi)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,是治療腫瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)[14-15]。本研究結(jié)果顯示,隨著PPⅠ給藥濃度增加,細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2與ERK1/2的表達(dá)逐漸上調(diào),提示PPⅠ可通過調(diào)節(jié)ERK1/2通路來誘導(dǎo)DU145細(xì)胞調(diào)亡。

SP1是一種特異性DNA結(jié)合蛋白,廣泛存在于細(xì)胞核內(nèi),可通過多個(gè)信號通路包括ERK1/2通路來調(diào)控血管生成、細(xì)胞周期、癌和抑癌基因等因子的轉(zhuǎn)錄及表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移,并抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[16-17];而EZH2是一種重要的甲基轉(zhuǎn)移酶,其作為核心催化亞基與其他成員形成PRC2,并通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥及抑制凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)EZH2在PCa細(xì)胞中過表達(dá)或產(chǎn)生突變,這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后密切相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示,細(xì)胞內(nèi)SP1與EZH2蛋白的表達(dá)隨PPⅠ給藥濃度的增加而逐漸降低,提示PPⅠ可調(diào)控SP1和EZH2的表達(dá),在此基礎(chǔ)上,我們猜測ERK1/2可能是SP1與EZH2的上游調(diào)控蛋白。

本研究加入ERK1/2抑制劑(PD98059)后,發(fā)現(xiàn)其逆轉(zhuǎn)了PPⅠ對SP1表達(dá)的下調(diào)作用,證明了ERK1/2可調(diào)控SP1的表達(dá);同時(shí), SP1過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)PPⅠ對EZH2表達(dá)的下調(diào)、逆轉(zhuǎn)PPⅠ對EZH2啟動(dòng)子活性的抑制作用,而EZH2過表達(dá)未能逆轉(zhuǎn)PPⅠ對SP1表達(dá)的下調(diào),提示了SP1是EZH2的上游調(diào)控因子和上游促腫瘤細(xì)胞生長因子,而EZH2則是SP1的下游因子,與已有研究相符[19-21]。

綜上所述,PPⅠ誘導(dǎo)CRPC DU145細(xì)胞早期調(diào)亡和抑制其增殖的機(jī)制可能是通過調(diào)控ERK1/2、SP1與EZH2信號通路實(shí)現(xiàn)的。但細(xì)胞內(nèi)蛋白多樣且作用復(fù)雜,各類腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展及代謝都存在差異,PPⅠ是否真正通過對上述蛋白的調(diào)控機(jī)制來誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡仍未能明確。后續(xù)研究仍需深入探究PPⅠ、ERK1/2、SP1、EZH2與真核細(xì)胞內(nèi)的各種凋亡因子之間的相關(guān)性,以明確PPⅠ是否可通過調(diào)控ERK1/2、SP1與EZH2信號通路來誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡。同時(shí),本研究僅在細(xì)胞水平進(jìn)行探索,下一步仍需進(jìn)行裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PPⅠ的抗癌活性與濃度普適性,從而為開發(fā)和利用PPⅠ治療PCa提供理論依據(jù)。