黃東莉 何敏 紀(jì)洪玲 陸林燕 嚴(yán)功力 張穎 張麗華

摘要 為研究猴樟CbP5CR蛋白的序列結(jié)構(gòu)和功能，克隆猴樟CbP5CR基因CDS序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，克隆得到的序列具有一個(gè)810 bp完整的ORF框，編碼269個(gè)氨基酸，與沉水樟中收錄的RWR74447.1基因序列一致性達(dá)98.88%，系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果表明，猴樟CbP5CR蛋白具有較高的保守性；猴樟CbP5CR蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CbP5CR蛋白具有PLN02688家族結(jié)構(gòu)域，CbP5CR蛋白化學(xué)分子式為C1242H2015N345O375S7，相對分子量28.01 kD，理論等電點(diǎn)7.03，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不存在氨基酸無序化區(qū)域，為脂溶性和親水性蛋白，磷酸化氨基酸位點(diǎn)有45個(gè)，亞細(xì)胞定位預(yù)測為細(xì)胞質(zhì)。

關(guān)鍵詞 猴樟；轉(zhuǎn)錄因子；基因克?。簧镄畔W(xué)分析

中圖分類號 S792? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）04-0022-04

猴樟（Cinnamomun bodinieri Levl.）是我國重要的綠化樹種、經(jīng)濟(jì)樹種和林用樹種，主要分布于我國南方地區(qū)。近幾年，猴樟產(chǎn)業(yè)因其生長速度快、抗性強(qiáng)而迅速發(fā)展起來[1]，并逐漸向我國長江以北地區(qū)推廣應(yīng)用，而北方地區(qū)堿性土壤環(huán)境限制了猴樟的生產(chǎn)栽培。植物耐堿性能與其根系適應(yīng)堿脅迫的策略密切相關(guān)，包括膜穩(wěn)定性、抗氧化系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)和離子平衡等方面，脯氨酸的生物合成和積累是植物應(yīng)對逆境脅迫的主要方式，逆境脅迫下可以作為滲透調(diào)節(jié)物防止細(xì)胞脫水，還是生物大分子的保護(hù)劑和羥基清除劑，同時(shí)還可為植物從脅迫條件恢復(fù)而提供氮源、碳源和還原劑，耐堿性強(qiáng)的品種含有更高的脯氨酸含量[2]。以往研究認(rèn)為，在多種脅迫條件下P5CR、P5CS、δ-OAT基因的表達(dá)量增加，而PDH基因的表達(dá)量降低，脯氨酸積累[3]，但植物體內(nèi)脯氨酸的積累與植物的抗逆性之間的關(guān)系在不同植物之間存在差異，其在賦予耐受性方面的實(shí)際作用仍然存在爭議。該研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆出猴樟脯氨酸合成關(guān)系酶基因序列，并分析其特性，以期為猴樟耐堿性機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為耐堿猴樟變種2年生種苗，于2019年2月上旬播種，2021年4月上旬進(jìn)行移栽。于2022年3月10日取猴樟枝條頂部幼嫩芽片液氮速凍后，用RNAperp Pure Plant Kit（天根，北京）試劑盒提取材料的總RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連）方法去除基因組DNA后，用TR Prime Mix（random primer）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得的cDNA產(chǎn)物作為模板。

1.2 基因克隆

根據(jù)猴樟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得在耐堿性猴樟變種葉片中調(diào)控脯氨酸合成的關(guān)鍵酶基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)CDS擴(kuò)增引物［F（5'—3'）：ATGGCAACAGCAGAGACG；R（5'—3'）：CTAGAGAGTGTGCTACTC］，PCR反應(yīng)采用25 μL體系[4]，反應(yīng)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞（TSINGKE，北京），挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定，將PCR陽性菌落培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

通過ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）將猴樟CbP5CR基因翻譯成蛋白序列；利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測；利用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）對氨基酸序列的理化性質(zhì)和等電點(diǎn)進(jìn)行分析；采用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行蛋白質(zhì)的親/疏水性預(yù)測；采用PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl）在線軟件進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)分析；利用Fold Index 軟件（https：//fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex）分析氨基酸折疊無序化特性分析；采用SoftBerry ProtComp 9. 0（http：//linux1.softberry.com/）和Cell-PLoc 2.0在線分析軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位；采用Swiss-Model（http：//www.Swissmodel.expasy.org）預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，并利用PyMOL軟件生成三級結(jié)構(gòu)模型；利用MEGA 7.0作出與CbP5CR的CDS序列同源性較近的物種序列進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 猴樟CbP5CR基因的克隆與重組載體構(gòu)建

根據(jù)克隆后的凝膠電泳圖片（圖1），以猴樟的cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到1條約900 bp的條帶，片段大小與預(yù)期一致，通過測序得到長864 bp的CDS序列。PCR產(chǎn)物送公司測序，測序結(jié)果與沉水樟中收錄的RWR74447.1基因進(jìn)行比對，序列一致性高達(dá)98.88%，具備P5CR的功能。將克隆獲得的基因編碼蛋白通過NCBI BLAST Protein與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根據(jù)比對結(jié)果顯示，所克隆得到的序列具有一個(gè)810 bp完整的ORF框，推導(dǎo)編碼269個(gè)氨基酸，將獲得的目的基因命名為CbP5CR。

2.2 猴樟CbP5CR蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 猴樟CbP5CR蛋白的理化性質(zhì)分析。利用Protparam軟件對猴樟CbP5CR蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，猴樟CbP5CR蛋白相對分子量28.01 kDa，理論等電點(diǎn)7.03，表明CbP5CR基因編碼蛋白為中性，化學(xué)分子式為C1242H2015N345O375S7，原子總數(shù)為3 984，不穩(wěn)定指數(shù)值為37.12，不穩(wěn)定系數(shù)大于40時(shí)為不穩(wěn)定蛋白，因而該蛋白質(zhì)穩(wěn)定。脂溶指數(shù)為99.85，CbP5CR基因編碼蛋白為脂溶性蛋白，帶負(fù)電荷的殘基（asp+glu）總數(shù)為26，帶正電荷的殘基（arg+lys）總數(shù)為26。利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果表明（圖2），CbP5CR蛋白具有PLN02688家族結(jié)構(gòu)域，具備脯氨酸合成酶功能。利用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）對猴樟CbP5CR基因編碼蛋白的親水性進(jìn)行分析（圖3），總平均親水性值（GRAVY）為0.184，預(yù)測該蛋白為親水性蛋白。通常認(rèn)為，氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)，分值越高疏水性越強(qiáng)，猴樟CbP5CR基因編碼蛋白各氨基酸序列中第43、44位氨基酸分值最低為-2.878，親水性值最強(qiáng)；第99位氨基酸分值最高，為2.544，疏水性最強(qiáng)，就整體分析而言，蛋白序列中36～49、105～115、139～150、218～233位氨基酸均為連續(xù)排列的親水性氨基酸，推測猴樟CbP5CR基因編碼蛋白為親水性蛋白。

2.2.2 猴樟CbP5CR蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果表明該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)蛋白二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測結(jié)果（圖4），該蛋白組成中135個(gè)氨基酸（50.19%）為α-螺旋、30個(gè)氨基酸（11.15%）為延伸主鏈，104個(gè)氨基酸（38.66%）為隨機(jī)卷曲，因而猴樟CbP5CR主要由α-螺旋和隨機(jī)卷曲組成；利用Fold Index對猴樟CbP5CR蛋白進(jìn)行氨基酸序列折疊無序化分析（圖5），結(jié)果表明，該蛋白不存在氨基酸無序化區(qū)域，折疊無序化指數(shù)為0.299。利用Net Phos 3.1（https：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進(jìn)行蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測（圖6），該多肽鏈0.500以上分值的氨基酸位點(diǎn)為45個(gè)，其中包含32個(gè)絲氨酸（S）、11個(gè)蘇氨酸（T）和2個(gè)酪氨酸（Y）磷酸化位點(diǎn)。根據(jù)蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果和同源建模分析（圖7），CbP5CR編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)與5bse.1.A的氨基酸序列一致性達(dá)68.28%，5bse.1.A序列的編碼蛋白為Pyrroline-5-carboxylate reductase（P5CR）。

2.2.3 猴樟CbP5CR蛋白序列同源比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對猴樟CbP5CR蛋白序列進(jìn)行blastp比對，根據(jù)結(jié)果下載比對得分較高的氨基酸序列，再通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建CbP5CR蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖8）。結(jié)果表明，猴樟CbP5CR蛋白在進(jìn)化上與同為樟科樟屬的沉水樟聚為一類，說明其親緣關(guān)系最近，樟科樟屬植物中該類蛋白具有較高的保守性。猴樟CbP5CR蛋白進(jìn)化樹中大概分3類，其中猴樟與沉水樟歸為一類，其次是絨毛狀煙草、煙草、番茄、蒂羅花、黃連、博羅回和罌粟歸為一類，與猴樟親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的石刁柏、黃石斛、深圳擬蓮、薯蕷、小果野芭蕉、油棕和姜?dú)w為一類。

3 結(jié)論與討論

脯氨酸是植物體內(nèi)水合能力最強(qiáng)的氨基酸，具有分子量小、對細(xì)胞無毒副作用等特征，外源施用脯氨酸能夠促進(jìn)植物光合能力和水分利用能力[5]，還能通過誘導(dǎo)植物抗氧化酶活性提高抗鹽堿脅迫能力。在高等植物體內(nèi)，脯氨酸通過谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體中合成，在線粒體內(nèi)進(jìn)行降解，吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）、鳥氨酸-δ-氨基轉(zhuǎn)移酶（δ-OAT）和脯氨酸脫氫酶（ProDH）基因被認(rèn)為是關(guān)鍵基因[2]。該研究結(jié)果表明，克隆得到的序列具有一個(gè)810 bp完整的ORF框，編碼269個(gè)氨基酸，與沉水樟中收錄的RWR74447.1基因序列一致性達(dá)98.88%，系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果表明，猴樟CbP5CR蛋白具有較高的保守性；猴樟CbP5CR蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CbP5CR蛋白具有PLN02688家族結(jié)構(gòu)域，CbP5CR蛋白化學(xué)分子式為C1242H2015N345O375S7，相對分子量28.01 kDa，理論等電點(diǎn)7.03，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不存在氨基酸無序化區(qū)域，為脂溶性和親水性蛋白，磷酸化氨基酸位點(diǎn)有45個(gè)，亞細(xì)胞定位預(yù)測為細(xì)胞質(zhì)，研究結(jié)果為進(jìn)一步研究猴樟脯氨酸代謝調(diào)控耐堿性機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 韓浩章，張麗華，王曉立，等.猴樟與香樟幼苗的耐鹽堿性比較［J］.西部林業(yè)科學(xué)，2019，48（5）：7-14.

[2] 邢曉琳.外源脯氨酸和水楊酸對鹽堿脅迫下紫花苜蓿生理特性及抗氧化酶基因表達(dá)的影響[D].沈陽：遼寧大學(xué)，2020.

[3] KIARASH J G，AMIN B，MALIHE A，et al.Effects of salinity stress on proline content and expression of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthase and vacuolar-type H+ subunit E genes in wheat[J].Plant Genetic Resources，2020，18（5）：334-342.

[4] 韓浩章，張麗華，李素華，等.猴樟CbP5CS1基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建[J/OL].分子植物育種：1-9.http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210720.1751.012.html.

[5] NOREEN S， AKHTERM S， YAAMIN T， et al. The ameliorative effects of exogenously applied proline on physiological and biochemical parameters of wheat （Triticum aestivum L.） crop under copper stress condition[J]. J. Plant Interact，2018，13：221-230.

（責(zé)編：王慧晴）