馬仲偉，謝潔榮，呂長(zhǎng)武

(新疆大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017)

0 引言

多孔硅（Porous Silicon, PSi）是一種納米多孔硅材料，因其具有較大的比表面積、易于生物分子修飾、折射率可調(diào)控等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于制作各類(lèi)生物傳感器[1].PSi根據(jù)平均孔徑尺寸分為微孔（＜2 nm）、介孔（2～50 nm）和大孔（＞50 nm）多孔硅.PSi的平均孔徑主要取決于硅襯底的摻雜和制備參數(shù).孔徑尺寸直接影響生物分子的滲透，可以通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)碾娏髅芏群碗娊赓|(zhì)組成對(duì)孔徑尺寸從幾納米到幾微米之間進(jìn)行調(diào)節(jié)[2].

多孔硅膜（Porous Silicon Membranes, PSiMs）是通過(guò)單晶硅基底分離多孔層制成的具有高滲透性的自支撐多孔硅薄膜[3].根據(jù)多孔化制備工藝策略可以制備出具有獨(dú)立式[4]、橫向[5]、微型[6]等多種結(jié)構(gòu)特征的PSiMs.它的孔隙率和厚度在單個(gè)層內(nèi)可以調(diào)控，厚度可以是從納米到毫米量級(jí).近年來(lái)，因PSiMs具有獨(dú)特的光電學(xué)、化學(xué)、熱學(xué)等性能，研究者對(duì)其研究興趣不斷增長(zhǎng).PSiMs的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展，主要包括微流體、醫(yī)療應(yīng)用、傳感、能量轉(zhuǎn)換和電子器件等方面.

目前，已有多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型的PSi光學(xué)生物傳感器被報(bào)道，如PSM[7]、布拉格反射鏡（Distributed Bragg Reflector, DBR）[8－9]、表面光柵[10]等結(jié)構(gòu).在這諸多結(jié)構(gòu)的生物傳感器中，PSM生物傳感器由于其強(qiáng)大的場(chǎng)抗干擾能力和反射光譜存在半寬高較窄的高透射共振峰，使其具有較高的檢測(cè)靈敏度[11].因此，基于PSM的生物傳感器被廣泛應(yīng)用于DNA、抗原、酶、蛋白質(zhì)、細(xì)菌等生物分子的檢測(cè)[12－16].Li等[17]在P型硅片上制備了PSM生物傳感器，并通過(guò)反射角度譜檢測(cè)方法對(duì)8個(gè)堿基DNA生物分子的結(jié)合進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)限為87 nmol/L.該團(tuán)隊(duì)為了避免多孔硅對(duì)可見(jiàn)激光的強(qiáng)吸收，在檢測(cè)過(guò)程中用紅外激光作為檢測(cè)光源，提高了對(duì)DNA生物分子的檢測(cè)靈敏度.另外，Neeraj等[18]通過(guò)制備獨(dú)立式PSM生物傳感器檢測(cè)牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）.這種生物傳感器的識(shí)別元素是在氧化后的PSi上通過(guò)3-氨基丙基三乙氧基硅烷（(3-Aminopropyl)triethoxysilane,APTES）功能化來(lái)提供胺基，然后加入戊二醛偶聯(lián)劑.當(dāng)BSA被戊二醛捕獲到多孔基質(zhì)內(nèi)時(shí)，獨(dú)立式PSM生物傳感器的折射率增加，共振波長(zhǎng)紅移實(shí)現(xiàn)高靈敏度BSA檢測(cè).Zhao等[19]制備的獨(dú)立式PSM生物傳感器在APTES和生物素修飾后，鏈霉蛋白吸附使微腔共振波長(zhǎng)發(fā)生紅移.總的檢測(cè)時(shí)間為20分鐘，比基于PSi層的生物傳感器快6倍.PSi層與PSiMs的生物傳感特性多次對(duì)比研究表明[20]：PSi的滲透性弱，生物分子進(jìn)入多孔硅層的深度有限，濃度在垂直于表面方向呈現(xiàn)梯度遞減的趨勢(shì)，對(duì)生物分子的捕獲量往往受到限制.而PSiMs較大的開(kāi)放性表面增強(qiáng)了生物分子的滲透性，從而提高了對(duì)生物分子的捕獲能力，可在生物傳感方面產(chǎn)生較高的檢測(cè)靈敏度和快速的響應(yīng)時(shí)間.這就使得PSiMs在生物傳感方面的應(yīng)用更具有吸引力[21－22].

基于PSi的生物傳感器主要依靠結(jié)構(gòu)光學(xué)特征的變化作為檢測(cè)手段，例如反射、透射光譜的移動(dòng)和熒光強(qiáng)度的變化等[23－25].其它檢測(cè)方法還包括阻抗和安培傳感[26]，這些檢測(cè)手段需要昂貴的檢測(cè)儀器.本研究為了提高DNA分子的檢測(cè)靈敏度、降低檢測(cè)成本，用電化學(xué)蝕刻在單晶硅表面制備多孔硅微腔后，用大電流脈沖分離制備自支撐多孔硅微腔.并采用一種免光譜儀的透射角度譜法對(duì)8個(gè)堿基序列DNA進(jìn)行了檢測(cè)，獲得了高靈敏度的檢測(cè)結(jié)果.

1 理論分析與實(shí)驗(yàn)

1.1 理論分析

基于PSM的生物傳感器在生物檢測(cè)過(guò)程中目標(biāo)生物分子進(jìn)入孔洞與孔壁偶聯(lián)的數(shù)目越多則器件折射率變化越大，其檢測(cè)生物分子的靈敏度就越高.但在單晶表面制備的PSM生物傳感器在檢測(cè)生物分子時(shí)，由于生物分子的大小和多孔層孔徑尺寸之比太小，易影響生物分子進(jìn)入多孔層的深度，阻礙生物分子的檢測(cè)靈敏度的提高.為了克服這一困難，從單晶硅基底分離多孔硅微腔吸附在石英玻璃表面制備自支撐的多孔硅微腔，多孔硅微腔和石英玻璃之間形成一個(gè)微米級(jí)的空氣層，空氣層為生物分子提供了新的通道，繼而有更多的生物分子進(jìn)入使PSM的折射率增加，從而提高生物分子的檢測(cè)靈敏度.圖1是生物分子進(jìn)入自支撐多孔硅微腔多孔層的示意圖.

圖1 生物分子進(jìn)入自支撐多孔硅微腔多孔層示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)

制備多孔硅的方法是單晶硅在含有氫氟酸（HF）的電解液中進(jìn)行電化學(xué)蝕刻.多孔硅的孔隙率和厚度取決于基底的特性以及制備參數(shù)（如蝕刻電流密度和時(shí)間、電解質(zhì)中HF濃度和環(huán)境溫度），但主要受蝕刻電流密度和HF濃度的制約.本實(shí)驗(yàn)用電化學(xué)蝕刻法制備自支撐多孔硅微腔的過(guò)程分兩步進(jìn)行.

1.2.1 電化學(xué)蝕刻制備多孔硅微腔

實(shí)驗(yàn)用P型單晶硅（電阻率為0.01～0.06 Ω·cm，晶向?yàn)椋?00＞，厚度為(450±10)μm），將硅片切成1.2 cm×1.2 cm的矩形小片.蝕刻前將切好的硅片分別在丙酮、乙醇、去離子水中各超聲清洗1分鐘以除去表面油污，吹干后置于用聚四氟氯乙烯材料制備的單腐蝕槽中，取5～10 mL由無(wú)水乙醇和40%的氫氟酸溶液按體積比（V無(wú)水乙醇∶V氫氟酸=1∶1）混合而成的電解液倒入腐蝕槽中.用CS系列電化學(xué)工作站的工作電極（Working Electrodes, WE）連接硅片、對(duì)電極（Counter Electrode, CE）連接銅絲，設(shè)置制備一維光子晶體的高、低蝕刻電流密度分別為110 mA/cm2和60 mA/cm2，蝕刻時(shí)間分別為2 s和2.4 s，缺陷層蝕刻電流密度為110 mA/cm2，蝕刻時(shí)間為4 s.蝕刻的多孔硅面積約為0.502 4 cm2.蝕刻結(jié)束后分別用去離子水和無(wú)水乙醇反復(fù)沖洗，然后用吹風(fēng)機(jī)吹干.

1.2.2 分離制備自支撐多孔硅微腔

在特定的HF濃度和蝕刻條件下多孔層將會(huì)從硅基底分離.為了分離多孔硅微腔，需將干燥后的多孔硅樣品再次置于腐蝕槽中，加入無(wú)水乙醇和40%的氫氟酸溶液按體積比（V無(wú)水乙醇∶V氫氟酸=3∶1）混合的電解液.設(shè)置蝕刻電流密度為160 mA/cm2，蝕刻時(shí)間為1.2 s.蝕刻后的PSM底部產(chǎn)生一層大孔隙率的犧牲層，犧牲層在微小外力作用下斷裂，多孔硅微腔與基底分離，并轉(zhuǎn)移到石英玻璃片上.圖2是成功分離的自支撐多孔硅微腔樣品.

圖2 自支撐的納米多孔硅微腔

1.3 樣品的功能化

1.3.1 氧化

新制備的PSM樣品在空氣環(huán)境中不穩(wěn)定，其表面的Si-H鍵容易在空氣中被氧化，為了讓其表面化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，將樣品置于40%濃度的H2O2溶液中，并在60 ℃的恒溫干燥箱中存放30分鐘進(jìn)行氧化.取出后用去離子水浸泡10分鐘，并在空氣環(huán)境中緩慢干燥.

1.3.2 硅烷化

將氧化后的樣品置于濃度為5%的APTES溶液中浸泡30分鐘，該溶液由APTES、甲醇和去離子水按體積比（VAPTES∶V甲醇∶V去離子水=1∶10∶10）混合組成.硅烷化結(jié)束后取出樣品用去離子水浸泡10分鐘，去除多余量的APTES和甲醇溶劑，并在空氣環(huán)境中緩慢干燥.

1.3.3 戊二醛

為了在樣品表面固定探針DNA生物分子，硅烷化修飾后將其浸泡在濃度為2.5%的戊二醛溶液中30分鐘，該溶液由戊二醛和去離子水按體積比（V戊二醛∶V去離子水=1∶19）混合組成.取出樣品后用pH=7.4的磷酸緩沖液（Phosphate Buffer, PB）和去離子水各浸泡10分鐘，去除剩余的戊二醛，并在空氣環(huán)境中緩慢干燥.

1.4 材料儀器與檢測(cè)

1.4.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

檢測(cè)8個(gè)堿基對(duì)的探針、目標(biāo)、非目標(biāo)DNA序列分別是5’-TGCAACGT-3’-NH2、5’-ACGTTGCA-3’-NH2、5’-TAGCCGAT-3’-NH2，APTES、戊二醛（Glutaraldehyde, GA）、甲醇和PB.用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM）拍攝樣品的表面形貌和截面（ZEISS SUPRA 55VP，德國(guó)）.用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日立/U-4100，日本）采集樣品的反射光譜.

1.4.2 樣品檢測(cè)

用透射角度譜法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，為了減少樣品對(duì)光的吸收，選擇功率為1 mW、波長(zhǎng)為1 550 nm的半導(dǎo)體激光器作為入射光源.把樣品固定在分光計(jì)的載物臺(tái)上，光束經(jīng)過(guò)TE偏振器后到達(dá)自支撐多孔硅微腔表面，用觸摸屏手持光功率計(jì)接收微腔的透射光.檢測(cè)的光路示意圖如圖3所示，轉(zhuǎn)動(dòng)分光計(jì)可獲得不同入射角時(shí)透射光的強(qiáng)度.

圖3 光路示意圖

2 結(jié)果與討論

在單晶硅表面成功制備PSM后用大電流脈沖分離制成自支撐PSM樣品，分離后樣品的機(jī)械性能差，容易破碎.為了便于實(shí)驗(yàn)研究，將其轉(zhuǎn)移到石英玻璃片上.圖4是用掃描電鏡拍攝的PSM的表面和截面，圖4(a)為樣品的表面形貌圖，圖中黑色區(qū)域是孔洞，灰色區(qū)域是剩余的硅，孔徑的尺寸和分布是隨機(jī)性的，孔徑尺寸一般在20～30 nm之間，足以讓檢測(cè)的DNA分子進(jìn)入.圖4(b)為樣品的截面圖，可以明顯觀察到高、低折射率層周期性分布的一維光子晶體結(jié)構(gòu).淺灰色層是高折射率（nH）多孔層，層厚度約為196.0 nm，而深灰色層是低折射率（nL）多孔層，層厚度約為178.0 nm.整個(gè)樣品的總體厚度約為9.21 μm.另外，圖4(c)紅色虛線是通過(guò)理論仿真得到的反射光譜，黑色實(shí)線是實(shí)驗(yàn)樣品的反射光譜，可以觀察到理論與實(shí)驗(yàn)的缺陷峰波長(zhǎng)位置在λ=1 020 nm處.由于散射、吸收和表面波動(dòng)的影響，實(shí)驗(yàn)樣品相比理論仿真的反射率低，半寬高增加[27].

圖4 自支撐多孔硅微腔表面SEM形貌(a)、截面(b)和反射光譜(c)

本文對(duì)自支撐PSM樣品進(jìn)行氧化、硅烷化和戊二醛三個(gè)過(guò)程的功能化修飾，目的是使樣品的孔隙表面含有大量的醛基以穩(wěn)定鏈接探針DNA生物分子.為了確保每一步功能化修飾的成功，必須在每一步功能化結(jié)束后對(duì)樣品進(jìn)行透射角度譜測(cè)量.圖5(a)是樣品在氧化、硅烷化、戊二醛功能化后測(cè)量的透射角度譜，可以看出每一步功能化后透射角度譜發(fā)生明顯的移動(dòng)，說(shuō)明樣品功能化成功.隨后用微量移液管取70 μL濃度為10 μmol/L的探針DNA滴在樣品上，在37 ℃環(huán)境下存放2 h.為了防止非特異性吸附，用PB浸泡去除多余的探針DNA，并在空氣中緩慢干燥.由于探針DNA用氨基修飾后與樣品表面的醛基連接，因此被固定在樣品孔隙中.為了封閉多余的醛基，取70 μL濃度為3 mol/L的乙醇胺緩沖液滴在樣品上并存放在37 ℃環(huán)境中1 h，然后用PB浸泡除去多余的乙醇胺，取出樣品置于空氣環(huán)境中緩慢干燥.為確保探針DNA的固定，對(duì)樣品進(jìn)行透射角度譜的測(cè)量.測(cè)量后在樣品上滴加70 μL濃度為1 μmol/L的目標(biāo)DNA，在37 ℃環(huán)境下存放2 h后用PB浸泡并干燥，然后對(duì)樣品進(jìn)行透射角度譜的測(cè)量，結(jié)果如圖5(b)所示.由于目標(biāo)DNA與樣品中固定的探針DNA發(fā)生偶聯(lián)，改變了PSM多孔層折射率，導(dǎo)致透射角度譜紅移了約6°.圖6(a)和圖6(b)分別是加入70 μL濃度為1 μmol/L的非目標(biāo)DNA和濃度為3 mol/L PB后測(cè)量的透射角度譜.可以觀察到，透射角度譜的紅移可以忽略不計(jì)，這是由于探針DNA與非目標(biāo)DNA和PB不發(fā)生偶聯(lián).因此，樣品的折射率不發(fā)生改變.

圖5 氧化、硅烷化、戊二醛功能化后透射角度譜的變化(a)和加入1 μmol/L濃度的目標(biāo)DNA后透射角度譜的變化(b)

圖6 加入非目標(biāo)DNA(a)和PB(b)后透射角度譜的變化

分別取0.1、0.2、0.5、0.75、1.0 μmol/L濃度的目標(biāo)DNA，測(cè)量其透射角度譜的紅移發(fā)現(xiàn)，在0.1～1.0 μmol/L的范圍內(nèi)，樣品的透射角度譜紅移隨著目標(biāo)DNA濃度的增加而增加.從圖7中的線性擬合曲線可以觀察到，在0.1～1.0 μmol/L范圍內(nèi)，樣品的透射角度譜移動(dòng)量與目標(biāo)DNA的濃度呈良好的線性關(guān)系.擬合系數(shù)為0.975，線性方程為Y =5.462X+0.814.其中：Y 為加入不同濃度的目標(biāo)DNA分子后樣品的透射角度譜移動(dòng)量，X為目標(biāo)DNA的濃度.通過(guò)計(jì)算得到該生物傳感器的靈敏度5.5(°)/(μmol·L－1).本實(shí)驗(yàn)中采用的設(shè)備的分辨率大約為0.2°[14].因此，自支撐多孔硅微腔對(duì)8個(gè)堿基對(duì)DNA序列的檢測(cè)限為0.037 μmol/L.自支撐多孔硅微腔對(duì)生物分子的通透性增加，增強(qiáng)了生物分子的捕獲能力，進(jìn)而提高了對(duì)生物分子的檢測(cè)靈敏度.

圖7 透射角度譜的移動(dòng)量隨著目標(biāo)DNA濃度的變化

3 結(jié)論

用電化學(xué)工作站在單晶硅上制備PSM結(jié)構(gòu)，然后用大電流脈沖分離了多孔硅微腔，并轉(zhuǎn)移到石英玻璃片上.用掃描電子顯微鏡拍攝了多孔硅微腔樣品的表面和截面形貌.功能化后將樣品與探針DNA偶聯(lián).使用免光譜儀器的透射角度譜檢測(cè)了8個(gè)堿基對(duì)不同濃度的目標(biāo)DNA，檢測(cè)限達(dá)0.037 μmol/L.相比Li等[17]在單晶硅上制備的未分離的PSM生物傳感的檢測(cè)靈敏度提高了2.4倍.自支撐多孔硅微腔檢測(cè)生物分子具有靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)快速、無(wú)標(biāo)記的生物檢測(cè).