邢祥祥，伍杰毅，趙魯玉，宋天賜，黃婷婷，岳海濤,2?

(1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017；2.新疆大學(xué) 未來(lái)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017)

0 引言

聚乙烯（Polyethylene, PE）塑料發(fā)明于20世紀(jì)30年代，因其優(yōu)良的材料可塑性，相關(guān)制品已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域.近年來(lái)，廢棄聚乙烯塑料制品造成的白色污染問(wèn)題日益受到關(guān)注，從自然環(huán)境中篩選具有聚乙烯降解能力的微生物資源、挖掘相關(guān)的酶和功能元件是學(xué)術(shù)界和環(huán)保產(chǎn)業(yè)界廣泛重視的研究熱點(diǎn).

已報(bào)道的聚乙烯降解微生物的研究中，降解菌株主要從富集聚乙烯底物環(huán)境（如廢棄塑料樣品、受塑料污染土壤、定向喂食塑料的昆蟲(chóng)腸道等）、聚乙烯結(jié)構(gòu)類(lèi)似物中篩選獲得.如Soleimani等[1]從塑料垃圾填埋場(chǎng)篩選得到17株聚乙烯降解菌，其中1株鏈霉菌60 d降解率達(dá)9.5%.Tribedi等[2]從塑料固體廢棄物篩選出的假單胞菌在45 d內(nèi)聚乙烯降解率達(dá)到5%.Gao等[3]在塑料廢物樣品中發(fā)現(xiàn)了能夠有效定殖和降解聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯和聚乙烯的海洋細(xì)菌群落.Han等[4]從農(nóng)業(yè)土壤中分離出6株聚乙烯降解菌株，90 d的降解率在0.22%～0.49%之間.Nowak等[5]研究發(fā)現(xiàn)聚乙烯在不同土壤中被微生物降解后重量損失在0.03%～0.28%之間.Kavitha等[6]從土壤中篩選出的芽孢桿菌在30 d內(nèi)可使聚乙烯失重6.68%.Hadad等[7]從土壤中分離出1株能夠利用支鏈低密度聚乙烯作為唯一碳源并對(duì)其進(jìn)行降解的嗜熱短桿菌，50 ℃培養(yǎng)30 d可使聚乙烯重量和分子量分別降低11%和30%.Yang等[8]從蠟蛾幼蟲(chóng)腸道中分離篩選出腸桿菌YT1和芽孢桿菌YP1，2株細(xì)菌經(jīng)過(guò)60 d分別能降解約6.1%和10.7%的聚乙烯薄膜.Bombelli等[9]報(bào)道了以蜂蠟為食的蠟螟幼蟲(chóng)對(duì)聚乙烯的生物降解.Yang等[10]探究了黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)對(duì)聚苯乙烯等塑料混合物的生物降解.這些研究豐富了對(duì)微生物降解聚乙烯塑料廢棄物的認(rèn)識(shí)，逐漸探索出微生物治理塑料污染的有效途徑.

處于干旱和半干旱地區(qū)的新疆是中國(guó)重要的植棉區(qū)，自1980年推廣使用聚乙烯地膜以來(lái)，目前農(nóng)田地膜覆蓋比已高達(dá)80%，達(dá)到35萬(wàn)公頃[11]，是中國(guó)使用聚乙烯地膜面積最大的省份[12].用于作物覆蓋的地膜使用后通過(guò)機(jī)械回收，然而由于新疆廣泛使用的彈齒式殘膜回收機(jī)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、回收率低，往往只能回收大片塑料地膜，沒(méi)有回收徹底的地膜碎片堆積在農(nóng)田中不斷富集[13].殘留地膜會(huì)影響土壤中水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸，破壞土壤物理結(jié)構(gòu)[14]，地膜殘留對(duì)作物出苗和根系生長(zhǎng)也會(huì)產(chǎn)生不良影響.一些研究表明，殘留地膜的不斷積累可能會(huì)對(duì)陸地土壤中的昆蟲(chóng)及動(dòng)物產(chǎn)生不利影響，包括彈尾蟲(chóng)[15－16]、蚯蚓[17－19]、線蟲(chóng)[20]和小鼠[21]等.此外，較大的殘膜碎片還會(huì)原位降解為微塑料與納米塑料進(jìn)入農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)，可能會(huì)通過(guò)食物鏈傳遞對(duì)人類(lèi)造成潛在危害[22].

為解決碎片化殘膜污染問(wèn)題，受前人研究啟發(fā)，我們從新疆荒漠、鹽湖、高原、農(nóng)田等生態(tài)環(huán)境中采集了富集聚乙烯廢棄物底物樣品、無(wú)（寡）聚乙烯底物樣品、自然界存在的聚乙烯結(jié)構(gòu)類(lèi)似物共3類(lèi)環(huán)境樣品，采用通用細(xì)菌分離方法從上述樣品中獲得純培養(yǎng)菌株，通過(guò)單一碳源培養(yǎng)基連續(xù)限制性篩選，以期獲得聚乙烯降解菌株.此外，根據(jù)新疆日照時(shí)數(shù)長(zhǎng)、紫外線強(qiáng)烈、年日照時(shí)長(zhǎng)達(dá)2 500～3 500 h的現(xiàn)實(shí)情況[23].綜合考慮紫外線照射可以改變聚乙烯的結(jié)晶度，在聚合物表面形成羧基、羰基和羥基等氧化基團(tuán)，可能會(huì)促進(jìn)微生物對(duì)聚乙烯的降解[24－26].為模擬田間及野外環(huán)境下菌株對(duì)聚乙烯地膜的生物降解效果，采用紫外線照射對(duì)聚乙烯地膜進(jìn)行前處理，再接種聚乙烯降解菌株，評(píng)估紫外線照射對(duì)菌株的生物降解是否有促進(jìn)作用.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

正十六烷購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，聚乙烯地膜購(gòu)于中化塑料有限公司.富集聚乙烯底物樣品包括從戈壁荒漠采集的廢棄塑料瓶（含部分聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯材質(zhì)樣品）、塑料片.無(wú)（寡）聚乙烯底物樣品包括從阿爾金山無(wú)人區(qū)采集的土壤樣品、動(dòng)物糞便；荒漠蜣螂、擬步甲和伊犁黑蜂等昆蟲(chóng)；胡楊韌皮部組織；淤泥、湖水等.自然界中動(dòng)植物產(chǎn)生的聚乙烯結(jié)構(gòu)類(lèi)似物樣品包括蜂巢、松脂等.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

（1）Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min，固體LB培養(yǎng)基在以上基礎(chǔ)上再加入2%（W/V）瓊脂.

（2）以正十六烷為唯一碳源選擇性培養(yǎng)基：KNO31 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，瓊脂20 g/L，正十六烷0.77 g/L，pH 7.2，正十六烷直接加入培養(yǎng)基中121 ℃滅菌20 min.

（3）以聚乙烯地膜為唯一碳源選擇性培養(yǎng)基：KH2PO40.7 g/L，K2HPO40.7 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，NH4NO31.0 g/L，NaCl 0.005 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002 g/L，ZnSO4·7H2O 0.002 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，聚乙烯地膜0.1 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min，聚乙烯地膜裁剪成3 cm×3 cm正方形薄片紫外滅菌1 h后加入滅菌后的培養(yǎng)基中.

1.2.2 樣品中可培細(xì)菌分離

取1 g樣品（塑料片取0.05 g）置于100 mL錐形瓶中，加入20 mL無(wú)菌水150 r/min、37 ℃條件下?lián)u培30 min.吸取100 μL梯度稀釋后的樣本溶液涂布于LB培養(yǎng)基上.菌株培養(yǎng)24 h，同時(shí)挑取單菌落分區(qū)劃線純化培養(yǎng).純化培養(yǎng)后的菌株置于液體LB搖瓶中150 r/min、37 ℃培養(yǎng)24 h.

1.2.3 以正十六烷為唯一碳源選擇性篩選菌株

篩選出的可培細(xì)菌經(jīng)LB液體培養(yǎng)基搖培至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種100 μL涂布于以正十六烷為唯一碳源的平板上，放置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)7 d，每隔24 h記錄菌株生長(zhǎng)狀況，菌株在平板表面形成明顯菌落、生長(zhǎng)致密認(rèn)定為可以降解正十六烷.

1.2.4 以聚乙烯地膜為唯一碳源選擇性篩選菌株

可降解正十六烷的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中搖培至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照5%（V/V）的接種量接種至以聚乙烯地膜為唯一碳源的培養(yǎng)基中，對(duì)照組不接種菌株，每組設(shè)置3個(gè)平行.培養(yǎng)30 d后取出聚乙烯地膜，放入超聲波清洗儀后加入十二烷基硫酸鈉（SDS）清洗1 h，用無(wú)菌水沖洗干凈，自然干燥8 h后，用十萬(wàn)分之一分析天平（SECURA225D-1CN，賽多利斯，德國(guó)）測(cè)定其失重率.

1.2.5 不同類(lèi)型樣品微生物群落組成分析

使用E.Z.N.A.?DNA試劑盒（Omega Biotek，Norcross Ga，美國(guó)）從樣品中提取微生物總DNA，使用紫外分光光度計(jì)（UV2310Ⅱ，Tianmei，中國(guó)）檢測(cè)DNA的濃度和純度，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序.

1.2.6 聚乙烯降解菌株系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用移液槍吸取l mL菌液加入1.5 mL離心管中，8 000 r/min離心1 min，棄上清，收集菌體.然后使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302，Tiangen，中國(guó)）提取菌液總DNA進(jìn)行16S rDNA的PCR 擴(kuò)增，16S rDNA通用上、下游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′.使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成測(cè)序.

1.2.7 聚乙烯降解菌形態(tài)學(xué)觀察

將聚乙烯降解菌劃線接種于LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～2 d，觀察菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)并記錄菌落形狀、顏色、大小.革蘭氏染色.吸取1 mL菌液12 000 r/min、4 ℃離心10 min后收集沉淀，磷酸緩沖液洗滌菌體，樣品自然干燥后使用1%的鋨酸進(jìn)行固定，噴金處理后使用掃描電子顯微鏡（SU8000，日立，日本）觀察菌體顯微結(jié)構(gòu).

1.2.8 以聚乙烯為唯一碳源聚乙烯降解菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將聚乙烯降解菌株按5%（V/V）接種量接種到以聚乙烯地膜為唯一碳源的培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)，取第1 d、第3 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d、第35 d培養(yǎng)液于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值，繪制生長(zhǎng)曲線.

1.3 降解菌株對(duì)聚乙烯地膜降解效果的測(cè)定

使用聚乙烯降解菌株對(duì)經(jīng)紫外線照射后的聚乙烯地膜進(jìn)行降解.培養(yǎng)30 d后，將聚乙烯地膜取出按照1.2.4節(jié)的方式清洗后，切割成2 mm×2 mm的小片粘在導(dǎo)電碳膜雙面膠上，使用離子濺射儀對(duì)樣品表面進(jìn)行固定噴金，掃描電鏡觀察聚乙烯地膜表面形態(tài).

使用去離子水清洗聚乙烯地膜，自然干燥8 h，利用傅里葉紅外光譜儀（VERTEX 70，Bruker，德國(guó)）測(cè)定聚乙烯地膜的表面化學(xué)官能團(tuán)變化以表征其破壞結(jié)果，掃描范圍為700～4 000 cm－1，分辨率為4.0 cm－1，掃描次數(shù)為100次.

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用TBtools（v1.045）繪制熱圖.不同樣品的微生物16S rDNA多樣性分析結(jié)果選用相似水平為97%的OTU，使用ggplot2（v2.2.0）制作群落柱形圖.菌株的16S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 7.0軟件基于鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).使用Origin 8.0繪制生長(zhǎng)曲線.

2 結(jié)果和分析

2.1 聚乙烯降解菌株的篩選結(jié)果

經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩，從3種不同類(lèi)型樣品中共計(jì)篩選出399株菌株，其中可降解正十六烷的菌株87株（22%），87株降解正十六烷的菌株最終篩選出8株（9%）聚乙烯降解菌，見(jiàn)表1.從塑料片、昆蟲(chóng)、土壤、蜂巢、松脂這些樣品分離的可培細(xì)菌中分別有33%、26%、25%、16%、30%的菌株可降解正十六烷.

表1 菌株篩選統(tǒng)計(jì)

間隔24 h對(duì)菌落數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將87株正十六烷降解菌的生長(zhǎng)狀況制作成熱圖（圖1），以表征菌株降解正十六烷的能力.

圖1 降解正十六烷菌株生長(zhǎng)情況

由圖1可知，篩選出的87株菌株在第3～5 d普遍生長(zhǎng)，在第7 d已經(jīng)全部長(zhǎng)出并且其中大多數(shù)菌株具備較好的降解正十六烷的能力.87株降解正十六烷菌株以聚乙烯薄膜為唯一碳源選擇性篩選，從塑料片、昆蟲(chóng)、土壤、蜂巢、松脂等樣品中篩選出的8株聚乙烯降解菌株，在熱圖中已標(biāo)識(shí)出其鑒定的種屬.其中：Brevundimonas sp.GP1、Acinetobacter sp.GP3、Enterobacter sp.GF21、Acinetobacter sp.GF1-2、Stenotrophomonas sp.GAJ2-3、Pseudomonas sp.GFC9-3最終在平皿上形成的菌落數(shù)大于80，Enterococcus sp.D2-3最終在平皿上形成的菌落數(shù)約為50，Bacillus sp.GMG4-2最終在平皿上形成的菌落數(shù)約為20.

2.2 不同類(lèi)型樣品群落分析與聚乙烯降解菌株的鑒定結(jié)果

為探究篩選出聚乙烯降解菌株的不同類(lèi)型樣品其群落組成結(jié)構(gòu)，基于屬水平對(duì)無(wú)（寡）聚乙烯底物樣品鞘翅目昆蟲(chóng)擬步甲、阿爾金山無(wú)人區(qū)土壤以及自然界產(chǎn)生的聚乙烯結(jié)構(gòu)類(lèi)似物（松脂）這些樣品進(jìn)行群落組成分析（圖2）.擬步甲樣品組中腸桿菌屬（Enterobacter）相對(duì)豐度為15.07%，腸球菌屬（Enterococcus）相對(duì)豐度為11.79%，不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）相對(duì)豐度為1.49%.松脂樣品組中無(wú)色桿菌屬（Achromobacter）是優(yōu)勢(shì)菌群（相對(duì)豐度為42.65%）.阿爾金山無(wú)人區(qū)土壤樣品組中微紅微球菌屬（Rubellimicrobium）是優(yōu)勢(shì)菌群（相對(duì)豐度為4.02%）.不同類(lèi)型樣品的微生物群落組成差異明顯，昆蟲(chóng)與松脂樣品中微生物組成較為平均，阿爾金山無(wú)人區(qū)土壤群落中有大量豐度較低以及未鑒別出的種屬.

為比較不同類(lèi)型樣品中篩選出的聚乙烯降解菌株的分類(lèi)差異，應(yīng)用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3A）.8株聚乙烯降解菌株中Enterococcus sp.D2-3和Bacillus sp.GMG4-2為革蘭氏陽(yáng)性菌，其余6株為革蘭氏陰性菌.8株聚乙烯降解菌株有2株隸屬不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），降解率最高的為Stenotrophomonas sp.GAJ2-3，而Acinetobacter sp.GP3的降解率最低，Enterobacter sp.GF21的降解率為3.05%.

圖3 菌株GF21的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

從富集聚乙烯底物樣品中篩選出的2株聚乙烯降解菌株，分別隸屬不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和短波單胞菌屬（Brevundimonas）.從無(wú)（寡）聚乙烯底物類(lèi)型樣品中篩選出的4株聚乙烯降解菌株，分別隸屬腸桿菌屬（Enterobacter）、寡氧單胞菌屬（Stenotrophomonas）、腸球菌屬（Enterococcus）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）.從自然界動(dòng)植物產(chǎn)生的聚乙烯結(jié)構(gòu)類(lèi)似物樣品中篩選出的2株聚乙烯降解菌株，分別隸屬假單胞菌屬（Pseudomonas）和芽孢桿菌屬（Bacillus）.3種類(lèi)型樣品中具有聚乙烯降解能力的細(xì)菌種屬差異明顯.從動(dòng)植物樣品擬步甲中篩選出的3株聚乙烯降解菌株，分別隸屬腸桿菌屬（Enterobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），這一結(jié)果從側(cè)面印證了多樣性分析中腸桿菌屬（Enterobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）是擬步甲內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種屬.

對(duì)8株聚乙烯降解菌株造成聚乙烯膜片的失重情況進(jìn)行了測(cè)量，結(jié)果表明：這8株聚乙烯降解菌可對(duì)聚乙烯膜片造成不同程度的重量減少，30 d的培養(yǎng)周期后，可使聚乙烯失重0.22%～8.76%（圖4）.篩選自阿爾金山無(wú)人區(qū)土壤的Stenotrophomonas sp.GAJ2-3造成膜片的失重率最高，為8.76%；篩選自鞘翅目昆蟲(chóng)擬步甲中的Enterococcus sp.D2-3、Enterobacter sp.GF21的降解率分別為8.30%、3.05%.

圖4 篩選菌株對(duì)聚乙烯地膜的降解率

為研究菌株對(duì)聚乙烯地膜的降解機(jī)制，通過(guò)掃描電鏡觀察菌株對(duì)聚乙烯膜片造成表面微觀形貌的改變，掃描電鏡觀察結(jié)果顯示：接菌培養(yǎng)后，聚乙烯地膜表面出現(xiàn)了不同程度的破損（圖5B～圖5I）.其中Enterobacter sp.GF21在本次實(shí)驗(yàn)中對(duì)聚乙烯地膜表面造成的破損最嚴(yán)重.

圖5 菌株處理后聚乙烯地膜掃描電鏡圖（×10.0 k）

已有研究從鞘翅目的黃粉蟲(chóng)以及鱗翅目的印度谷螟和蠟螟等昆蟲(chóng)體內(nèi)篩選出了聚乙烯降解菌株[8－10]，本研究著重對(duì)分離自擬步甲體內(nèi)且降解能力較好的菌株GF21進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn).將測(cè)序獲得的菌株GF21 16S rDNA基因序列與NCBI中序列進(jìn)行在線比對(duì)，菌株GF21與腸桿菌屬的Enterobacter sp.CSCRZ6.1、Enterobacter sp.WXBRN3、Enterobacter sp.NCCP-755等多株菌株序列相似性達(dá)到99%以上.應(yīng)用MEGA 7.0軟件將該菌株的16S rDNA基因序列與其它相似度較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3B）.根據(jù)形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株GF21初步鑒定為腸桿菌Enterobacter sp.，命名為菌株Enterobacter sp.GF21并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).其16S rDNA基因序列已提交GenBank，登錄號(hào)為OM278539.其余聚乙烯地膜降解菌株的研究成果將另文闡述.

2.3 Enterobacter sp.GF21的形態(tài)

分別對(duì)Enterobacter sp.GF21菌落和菌體形態(tài)特征進(jìn)行了觀察.采用平板劃線法將Enterobacter sp.GF21接種于LB培養(yǎng)基上37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，Enterobacter sp.GF21菌落呈白色、近圓形、表面光滑，菌落邊緣整齊.革蘭氏染色陰性，掃描電鏡觀察菌體為橢圓形，無(wú)芽孢、鞭毛（圖6）.

圖6 Enterobacter sp.GF21形態(tài)特征（×20.0 k）

2.4 以聚乙烯為唯一碳源Enterobacter sp.GF21的生長(zhǎng)曲線

為測(cè)定Enterobacter sp.GF21在以聚乙烯地膜為唯一碳源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，分別測(cè)定第1 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d、第35 d不同培養(yǎng)時(shí)間菌株的OD600值.如圖7所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，接菌搖瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)物逐漸渾濁，28 d后OD600值從0.04增加至0.14，未接菌對(duì)照組OD600與初始狀態(tài)持平.表明Enterobacter sp.GF21可利用聚乙烯地膜作為唯一碳源生長(zhǎng).

圖7 Enterobacter sp.GF21在不同處理聚乙烯地膜培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

2.5 Enterobacter sp.GF21的掃描電鏡與傅里葉紅外光譜結(jié)果

為評(píng)估自然環(huán)境下陽(yáng)光照射的聚乙烯殘膜在結(jié)晶度發(fā)生改變后，對(duì)菌株降解過(guò)程造成的影響，使用Enterobacter sp.GF21對(duì)紫外線照射不同時(shí)長(zhǎng)后的聚乙烯地膜進(jìn)行降解.對(duì)照組設(shè)置為紫外線照射1 h、168 h后未接菌組，實(shí)驗(yàn)組設(shè)置為紫外線照射1 h、168 h后接菌組，紫外燈功率為16 W，紫外線波長(zhǎng)為253.7 nm.搖培30 d后發(fā)現(xiàn)紫外線長(zhǎng)時(shí)照射實(shí)驗(yàn)組相比短時(shí)照射組聚乙烯地膜失重率從1.11%增加到2.29%（圖8B）.

通過(guò)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組的聚乙烯地膜進(jìn)行掃描電鏡和傅里葉紅外光譜分析.由圖8A的掃描電鏡圖可知，紫外線照射1 h實(shí)驗(yàn)組聚乙烯地膜降解后可見(jiàn)表面粗糙不平、有破損，而對(duì)照組地膜表面光滑平整.紫外線照射168 h實(shí)驗(yàn)組降解后發(fā)現(xiàn)地膜表面有清晰裂痕，對(duì)照組聚乙烯地膜表面無(wú)破損.

使用傅里葉紅外光譜表征聚乙烯地膜上相關(guān)官能團(tuán)對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)峰的消減和位置偏移，1 720 cm－1附近的為C=O振動(dòng)峰，1 026 cm－1附近的為C-O振動(dòng)峰，1 370 cm－1、1 460 cm－1、2 850 cm－1、2 923 cm－1附近的為C-H振動(dòng)峰.未經(jīng)紫外線照射未接菌組（圖8C1）與紫外線照射后未接菌組（圖8C2、圖8C3）相比圖譜無(wú)明顯差異.紫外線照射后未接菌組（圖8C2、圖8C3）與紫外線照射后接菌組（圖8C4、圖8C5）相比差異明顯，后者在1 026 cm－1、1 720 cm－1附近出現(xiàn)了振動(dòng)峰.紫外線照射1 h接菌組（圖8C4）與紫外線照射168 h接菌組（圖8C5）相比，長(zhǎng)時(shí)間紫外線照射接菌后720 cm－1、1 370 cm－1、1 460 cm－1、2 850 cm－1、2 923 cm－1附近的振動(dòng)峰變?nèi)趿?聚乙烯是線性的飽和碳?xì)浠衔铮碚鞑煌鶊F(tuán)振動(dòng)峰的變化間接說(shuō)明Enterobacter sp.GF21在以聚乙烯地膜為唯一碳源生長(zhǎng)代謝過(guò)程中降解了聚乙烯地膜，導(dǎo)致其表面的化學(xué)官能團(tuán)產(chǎn)生了變化.

圖8 Enterobacter sp.GF21對(duì)聚乙烯地膜降解效果的檢測(cè)

3 討論和結(jié)論

廢舊聚乙烯對(duì)環(huán)境的污染是目前困擾人類(lèi)社會(huì)的環(huán)境治理難題，尤其是干旱區(qū)內(nèi)陸農(nóng)業(yè)區(qū)廣泛使用的聚乙烯地膜殘留更是呈現(xiàn)面積大、數(shù)量多、治理難的現(xiàn)實(shí)困境.通過(guò)生態(tài)循環(huán)，殘留聚乙烯地膜碎片已廣泛分布于農(nóng)田土壤和部分自然水體中，并存在通過(guò)食物鏈傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn).尋找高效的生物降解途徑，是對(duì)其進(jìn)行有效治理的關(guān)鍵.

本研究從3種類(lèi)型樣品中共計(jì)分離出399株菌株，以正十六烷為唯一碳源進(jìn)行初篩，得到87株正十六烷降解菌株，以聚乙烯為唯一碳源進(jìn)行復(fù)篩，從塑料片、昆蟲(chóng)、土壤、蜂巢、松脂樣品中篩選出8株能夠降解聚乙烯的細(xì)菌，30 d可使聚乙烯失重0.22%～8.76%，其中Enterobacter sp.GF21、Stenotrophomonas sp.GAJ2-3、Enterococcus sp.D2-3降解率較高.除通過(guò)失重率來(lái)衡量菌株的降解能力外，為盡可能排除實(shí)驗(yàn)誤差等干擾，可使用掃描電鏡等先進(jìn)表征手段加以輔證[27]，因此本實(shí)驗(yàn)后續(xù)也進(jìn)行了掃描電鏡與傅里葉紅外光譜的測(cè)定.

在篩選方法上，以短鏈烷烴作為唯一碳源初步篩選長(zhǎng)碳鏈聚合物降解菌株已有一些報(bào)道[28－29].雖然聚乙烯與正十六烷相比其分子量更大、疏水性更強(qiáng)，但通過(guò)使用與聚乙烯分子結(jié)構(gòu)較為相似的正十六烷進(jìn)行初步篩選，發(fā)現(xiàn)可降解正十六烷的菌株中有9.2%可以降解聚乙烯，表明菌株降解正十六烷與降解聚乙烯之間存在關(guān)聯(lián)但沒(méi)有因果關(guān)系.8株聚乙烯降解菌株中有75%具備優(yōu)秀的降解正十六烷能力，降解正十六烷能力一般的Bacillus sp.GMG4-2降解聚乙烯能力也較差，因此可使用正十六烷對(duì)聚乙烯降解菌株進(jìn)行高效便捷的初步篩選.3種類(lèi)型樣品分離出聚乙烯降解菌株分別隸屬腸桿菌屬（Enterobacter）、寡氧單胞菌屬（Stenotrophomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸球菌屬（Enterococcus），不同類(lèi)型樣品的群落組成存在差異，不同類(lèi)型樣品的理化性質(zhì)不同、采集生境不同也影響著內(nèi)生細(xì)菌群落組成的不同.鞘翅目昆蟲(chóng)擬步甲中篩選出的3株聚乙烯降解菌分別隸屬腸桿菌屬（Enterobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），這一結(jié)果從側(cè)面印證了多樣性分析中發(fā)現(xiàn)的腸桿菌屬（Enterobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）是擬步甲內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種屬，更易分離培養(yǎng).

聚乙烯的降解可通過(guò)水分、氧氣、高溫、紫外線或微生物降解發(fā)生[30]，生物降解過(guò)程受到培養(yǎng)體系、聚合物的性質(zhì)、微生物類(lèi)型和預(yù)處理等多種因素影響[31].研究發(fā)現(xiàn)，初始非生物氧化有助于降低聚乙烯的分子量，形成容易生物降解的中間產(chǎn)物[32]，紫外線照射會(huì)破壞聚乙烯長(zhǎng)碳鏈中的碳鍵和氫鍵釋放出自由基，且長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度的紫外線照射還可能會(huì)增加聚乙烯的親水性，促進(jìn)細(xì)菌在聚乙烯表面的定殖[24－26]，因此紫外線照射可以作為聚乙烯降解的光氧化誘導(dǎo)劑.Jeon等[33]研究發(fā)現(xiàn)增加紫外線照射強(qiáng)度略微降低了含鐵硬脂酸鹽線性低密度聚乙烯的拉伸性能和分子量，但顯著提高了其生物降解性.本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：紫外線長(zhǎng)時(shí)照射實(shí)驗(yàn)組與紫外線短時(shí)照射實(shí)驗(yàn)組相比，接種菌株Enterobacter sp.GF21培養(yǎng)30 d后，聚乙烯地膜失重率從1.11%增加到2.29%.由于圖8中實(shí)驗(yàn)使用的聚乙烯材料與之前不是同一批，故菌株Enterobacter sp.GF21最初實(shí)驗(yàn)降解率為3.05%，高于后續(xù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果.

聚乙烯的生物降解過(guò)程十分緩慢，其表觀變化通常不明顯，借助掃描電鏡可以觀察菌株定殖的位置與密度、表面破損情況等[34]，聚乙烯的生物降解會(huì)導(dǎo)致聚乙烯地膜表面出現(xiàn)裂紋、空腔和層侵蝕[35]，Gao等[3]驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄表達(dá)的3種聚乙烯降解酶對(duì)聚乙烯表面造成了破損.本研究篩選出的聚乙烯降解菌株在聚乙烯表面形成的破損主要有裂痕和孔洞兩種類(lèi)型，造成這種情況的原因還需深入研究.通過(guò)掃描電鏡可以觀察到紫外線照射168 h實(shí)驗(yàn)組與紫外線照射1 h實(shí)驗(yàn)組菌株降解后的聚乙烯地膜表面均發(fā)生了破損.已有研究表明，聚乙烯的生物降解可以簡(jiǎn)單地分為3個(gè)步驟：首先，聚乙烯通過(guò)生物氧化或酶被分解為低聚體、二聚體或單體；隨后，通過(guò)進(jìn)一步的氧化反應(yīng)聚合物鏈斷裂形成脂肪酸；最后，脂肪酸被微生物代謝為二氧化碳和水.使用傅里葉紅外光譜儀對(duì)聚乙烯地膜的微觀破壞進(jìn)行表征，可以觀測(cè)在其表面識(shí)別的化合物[36].接菌培養(yǎng)后的聚乙烯形成了新的官能團(tuán)，如C=O（1 720 cm－1）的形成表明了聚乙烯的氧化，這與Zhang等[37]報(bào)道的菌株降解聚乙烯后傅里葉紅外光譜顯示出羰基出現(xiàn)的結(jié)果一致.1 026 cm－1附近的C-O振動(dòng)峰也為聚乙烯的生物氧化提供了證據(jù)，1 650～1 750 cm－1處形成的新峰可能代表醛類(lèi)和酮類(lèi)物質(zhì)，極有可能是聚乙烯生物降解的中間產(chǎn)物.1 370 cm－1、1 460 cm1、2 850 cm－1、2 923 cm－1附近的C-H振動(dòng)峰的寬度差異以及峰值變化，間接說(shuō)明了菌株在代謝利用聚乙烯地膜過(guò)程中C-H含量發(fā)生了變化.

本實(shí)驗(yàn)從3種類(lèi)型樣品中共計(jì)分離出399株可培菌，以正十六烷為唯一碳源進(jìn)行初篩，以聚乙烯為唯一碳源進(jìn)行復(fù)篩，最終從塑料片、昆蟲(chóng)、土壤、蜂巢、松脂樣品中篩選出了8株聚乙烯降解菌株，紫外線照射后菌株的降解率顯著增加.本研究豐富了聚乙烯降解菌株資源庫(kù)，篩選出的菌種資源可供進(jìn)行代謝機(jī)制方面的進(jìn)一步深入研究.