范依琳,趙 丹,馬 妍,岳永起,馮欣欣,張姬越,字向東,熊顯榮,付 偉,熊 燕

(1.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610041;2.西南民族大學(xué),青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041;3.西南民族大學(xué),青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)作為世界最著名牛種之一,能夠生活在低溫、缺氧、惡劣的高海拔地區(qū),被譽(yù)為“高原之舟”[1]。牦牛不僅是我國(guó)高寒牧區(qū)重要的反芻畜種[2-3],還為青藏高原及鄰近地區(qū)的牧民提供肉奶等必需品[4],擁有無(wú)法取代的生態(tài)經(jīng)濟(jì)學(xué)地位。但牦牛的繁殖效率低、具有明顯季節(jié)性,極大地限制其飼養(yǎng)和生產(chǎn)效率,因此,提高牦牛繁殖性能成為畜牧工作者的工作重點(diǎn)。

膜聯(lián)蛋白(Annexin,ANX)是Ca2+依賴(lài)的磷脂結(jié)合膜聯(lián)蛋白家族,已發(fā)現(xiàn)12個(gè)成員存在于脊椎動(dòng)物;ANX能夠可逆的錨定到細(xì)胞膜上[5],具有多種生物學(xué)功能,包括參與細(xì)胞膜組成、調(diào)節(jié)離子通道、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[6]。膜聯(lián)蛋白A5基因(ANXA5)位于染色體4q26-q28上,包含內(nèi)含子12個(gè),外顯子13個(gè)[5]。ANXA5最早在人類(lèi)胎盤(pán)中被發(fā)現(xiàn),稱(chēng)為胎盤(pán)抗凝血蛋白[7],研究表明其為可溶性蛋白,以Ca2+依賴(lài)性方式結(jié)合到包含帶負(fù)電荷的磷脂(主要是磷脂酰絲氨酸)的生物膜上[8];同時(shí)ANXA5是膜聯(lián)蛋白家族中最小的成員,因?yàn)樗梢栽谀け砻嫔献灾鹘M裝成有序的二維(2D)陣列,被稱(chēng)之為具有獨(dú)特膜結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)[9]。此外,ANXA5也被廣泛認(rèn)為是磷脂酶A2和蛋白激酶C的內(nèi)源性抑制劑[10],目前,對(duì)于A(yíng)NXA5基因的研究大多集中于癌細(xì)胞的調(diào)控方面。

已有研究證明,ANXA5對(duì)雄性生殖器官發(fā)揮正常功能具有調(diào)控作用。如ANXA5是miR-506-3p的靶基因,抑制ANXA5表達(dá)可在體內(nèi)外一定程度上加重大鼠睪丸氧化應(yīng)激的損傷[11]。其他研究表明,ANXA5通過(guò)ERK/Nrf2途徑保護(hù)睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cell)和支持細(xì)胞(Sertoli cell)免受氧化應(yīng)激的損傷[12]。ANXA5的表達(dá)水平影響復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)的發(fā)病機(jī)制,抑制ANXA5的表達(dá)可增加RPL的風(fēng)險(xiǎn);ANXA5啟動(dòng)子的單倍型還可以用作預(yù)測(cè)RPL預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[13]。此外,有研究發(fā)現(xiàn),ANXA5在卵巢中呈細(xì)胞型特異性表達(dá)[14]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn),ANXA5在黃體細(xì)胞中有表達(dá),但不在顆粒細(xì)胞中表達(dá),提示ANXA5可能與顆粒細(xì)胞黃體化過(guò)程密切相關(guān)[15]。由此可見(jiàn),ANXA5對(duì)動(dòng)物生殖器官維持正常生理功能具有重要作用,但目前未見(jiàn)有關(guān)牦牛ANXA5基因的報(bào)道,關(guān)于A(yíng)NXA5是否參與牦牛繁殖過(guò)程的調(diào)控尚不清楚。本研究旨在通過(guò)克隆牦牛ANXA5基因,分析其生物學(xué)特性,測(cè)定其在牦牛組織和顆粒細(xì)胞中表達(dá)模式,為深入研究ANXA5對(duì)牦牛繁殖調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

采集5頭體況正常、年齡4～5歲的金川母牦牛,采樣地點(diǎn)為成都青白江唐家寺屠宰場(chǎng)。屠宰后,使用無(wú)菌剪刀剪取組織,包括心、肝、脾、肺、腎、子宮、卵巢、輸卵管等,用生理鹽水沖洗,迅速放入液氮保存。其中,2頭牦牛一側(cè)卵巢置于PBS中,另一側(cè)卵巢置于4%的多聚甲醛,進(jìn)行顆粒細(xì)胞培養(yǎng)以及切片的免疫組化分析。

1.2 主要試劑

TRIzol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD-19載體購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司;膠回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、購(gòu)于成都擎科梓熙生物技術(shù)公司;DEME/Ham′s F12購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;2×Plus SYBR real-time PCR pre mixture 購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)公司;一抗Rabbit Anti-ANXA5 antibody購(gòu)于沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司。

1.3 牦牛ANXA5基因克隆

根據(jù)GenBank上黃牛的ANXA5基因(NM_001040477牛),預(yù)測(cè)牦牛的ANXA5基因克隆序列,Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物(表1),合成引物工作交由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。模板為通過(guò)TRIzol法提取的總RNA,參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系為20 μL(Taq酶 12.5 μL,上下游引物各1 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 9.5 μL),反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,設(shè)置32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸15 min,4 ℃保存。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物,并根據(jù)膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收。將純化后的產(chǎn)物與pMD-19載體連接并置于16 ℃過(guò)夜,后將連接產(chǎn)物加入DH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化后加入LB液體培養(yǎng)基振蕩搖勻后培養(yǎng)45 min,將復(fù)蘇后的菌液涂布于含0.1 mg/mL氨芐的LB固體培養(yǎng)基表面,37 ℃培養(yǎng)12～16 h,挑出3個(gè)單克隆分別加入有含氨芐的液體LB液體培養(yǎng)基中搖床4～6 h后進(jìn)行菌液PCR,將陽(yáng)性克隆送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序,得到ANXA5基因序列。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

1.4 牦牛ANXA5基因生物學(xué)特性分析

通過(guò)DNAMAN軟件拼接,獲得牦牛ANXA5基因序列,而后分析牦牛ANXA5基因生物學(xué)特性:開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/);序列比對(duì)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/);蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析(https://web.expasy.org/protparam/、http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/、https://web.expasy.org/protscale/、http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/、https://psort.hgc.jp/form2.html/、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc-4.0/);蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及互作預(yù)測(cè)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html/、https://swissmodel.expasy.org/interactive/、https://string-db.org/)。利用DNAMAN軟件、MEGA 7.0軟件分別比對(duì)物種間氨基酸與核苷酸序列,并采用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建物種進(jìn)化樹(shù),構(gòu)建方法如下:NCBI上Blast后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MEGA 7.0軟件、進(jìn)行多序列比對(duì)、利用多序列比對(duì)結(jié)果建樹(shù)、完善樹(shù)枝名稱(chēng)信息、導(dǎo)出系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果圖。

1.5 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)

首先用75%乙醇快速清洗牦牛卵巢2次,再用PBS清洗3次。使用帶有10 mL針頭的注射器從2～8 mm的卵泡中依次吸取卵泡液后加到15 mL離心管中[15],用移液槍多次吹打,使顆粒細(xì)胞充分分散。而后在2 000 r/min的條件下離心,棄上清,讓細(xì)胞再次懸浮于含1%青霉素/鏈霉素以及10%胎牛血清的DEME/Ham′s F12中[16]。在24孔板中每孔加入約1×105個(gè)細(xì)胞,37 ℃,5% CO2下培養(yǎng)72 h后直接傳代,用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 RT-qPCR

特異引物根據(jù)牦牛ANXA5基因序列設(shè)計(jì)(表1),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)檢測(cè)ANXA5基因在牦牛不同組織中的表達(dá)以及在培養(yǎng)24,36,48,72 h牦牛卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá),并將GAPDH用作內(nèi)參基因以校正表達(dá)水平。反應(yīng)體系為15 μL(PowerUpTMSYBRTMGreen MasterMix 7.5 μL,上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L),cDNA 1 μL,ddH2O 5.5 μL),反應(yīng)程序同PCR反應(yīng)。

1.7 免疫組化

從4%多聚甲醛中取出固定24 h的牦牛卵巢組織,制成石蠟切片。切片在0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中煮沸15 min以進(jìn)行抗原修復(fù),然后將切片置于PBS(pH值7.4)脫色搖床上,洗滌3次,每次5 min。阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,滴加3% BSA,室溫下封閉30 min。將一抗滴于切片上,將切片平放于潮濕的盒子中,4 ℃孵育過(guò)夜。棄去一抗,然后加入二抗室溫孵育1 h。加入新制備的DAB顯色溶液,在顯微鏡下控制顯色時(shí)間,陽(yáng)性為棕黃色,然后用無(wú)菌水沖洗。蘇木精反染后,將載玻片脫水固定。使用蔡司共聚焦顯微鏡采集圖片。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法[17]分析熒光定量結(jié)果。通過(guò)GraphPad Prism軟件的One-way ANOVA法分析基因表達(dá)的差異顯著性,數(shù)據(jù)表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”。P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛ANXA5基因克隆

利用瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,獲得一條清晰條帶,條帶長(zhǎng)度符合預(yù)測(cè)序列的擴(kuò)增長(zhǎng)度(圖1-A)。通過(guò)Sanger測(cè)序得到PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 168 bp,CDS區(qū)966 bp,編碼321個(gè)氨基酸。與黃牛的核苷酸序列相似度為99.38%,堿基序列存在6個(gè)突變位點(diǎn)(圖1-B)。

A.牦牛ANXA5基因擴(kuò)增結(jié)果:M.DL2000 DNA Marker,1—4.ANXA5目的條帶;B.牦牛和黃牛ANXA5基因序列差異。A.Amplification of yak ANXA5 gene:M.DL2000 DNA Marker,1—4.ANXA5 target band;B.Sequence difference of ANXA5 gene between yak and cattle.圖1 牦牛ANXA5基因克隆Fig.1 Cloning of yak ANXA5 gene

2.2 物種間ANXA5基因同源性比較與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

克隆得到的牦牛ANXA5基因,分別與黃牛(Bostaurus,NP 001035567.3)、瘤牛(Bosindicus,XP 019817755.1)、山羊(Caprahircus,XP 017904654.1)、綿羊(Ovisaries,XP 012034784.2)、貓(Feliscatus,XP 006930945.1)、人(Homosapiens,NP 001145.1)、大鼠(Rattusnorvegicus,NP 037264.2)、小鼠(Musmusculus,NP 033803.1)、原雞(Gallusgallus,NP 001026709.1)的ANXA5基因進(jìn)行同源性對(duì)比(表2),發(fā)現(xiàn)與黃牛的核苷酸和氨基酸相似性最高,牦牛和其他哺乳動(dòng)物ANXA5基因相似性均高于90%,可見(jiàn)ANXA5基因在物種間保守。用核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖2)的結(jié)果顯示,牦牛和黃牛、瘤牛聚為一類(lèi);與原雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),符合物種進(jìn)化規(guī)律。

表2 牦牛與10個(gè)物種ANXA5基因相似性比對(duì)Tab.2 Gene similarity between yak ANXA5 gene and other 10 species %

圖2 基于A(yíng)NXA5基因核苷酸構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on nucleotide sequence of yak ANXA5 gene

2.3 牦牛ANXA5蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

用軟件分析ANXA5蛋白質(zhì)理化性質(zhì),分子式C1593H2551N429O502S8,理論等電點(diǎn)4.97,分子質(zhì)量36.001 ku,半衰期30 h,脂肪系數(shù)92.40,不穩(wěn)定系數(shù)36.34,總平均親水性-0.324。此外ANXA5由321個(gè)氨基酸組成,其中含量超過(guò)8%的氨基酸有4種,分別是亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)和天冬氨酸(Asp);帶負(fù)電荷(Asp+Glu)的氨基酸殘基總數(shù)更高,為54,提示牦牛ANXA5可能帶負(fù)電荷。牦牛ANXA5蛋白無(wú)信號(hào)肽(圖3-A)和跨膜結(jié)構(gòu)(圖3-B)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示,牦牛ANXA5基因主要存在于細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasmic)。

A.牦牛ANXA5基因信號(hào)肽分析;B.牦牛ANXA5基因跨膜結(jié)構(gòu)分析。A.Signal peptide analysis of yak ANXA5 gene;B.Transmembrane analysis of yak ANXA5 gene.圖3 牦牛ANXA5基因預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of yak ANXA5 gene

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,ANXA5蛋白包含α-螺旋為73.83%,無(wú)規(guī)則卷曲為22.12%,β-轉(zhuǎn)角為2.49%,延伸鏈結(jié)構(gòu)為1.56%(圖4-A)。預(yù)測(cè)ANXA5的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型與二級(jí)結(jié)構(gòu)相符(圖4-B)。蛋白相互作用分析顯示,有多種蛋白可能與ANXA5蛋白發(fā)生相互作用,如CASP8、CASP3、AKT1等(圖4-C)。

A.牦牛ANXA5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè):e.延伸鏈,h.α-螺旋,c.自由卷曲,t.β-轉(zhuǎn)角;B.牦牛ANXA5蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)圖;C.牦牛ANXA5蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。A.Secondary structure prediction of yak ANXA5 protein:e.Extended strand,h.α-helix,c.Random coil,t.β-turn;B.Tertiary structure of yak ANXA5 protein;C.Protein interaction network of yak ANXA5 protein.圖4 牦牛ANXA5蛋白預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of yak ANXA5 protein

2.4 牦牛ANXA5基因的組織表達(dá)譜及ANXA5卵巢定位

采用qPCR法檢測(cè)ANXA5基因在8種不同牦牛組織中的表達(dá)情況(圖5-A)。結(jié)果表明,肺的表達(dá)量最高,其次是子宮,二者與其他組織間差異極顯著(P<0.01);在輸卵管中表達(dá)量較高,與卵巢組織相比差異顯著(P<0.05),與其他組織間表達(dá)量同樣具有極顯著差異(P<0.01);在卵巢組織中也有中度的表達(dá),其與脾中表達(dá)量呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05),與其余組織間有極顯著表達(dá)差異(P<0.01)。運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)ANXA5在牦牛卵巢中的表達(dá)模式(圖5-B)。結(jié)果顯示,ANXA5在牦牛卵巢中表達(dá),但黃體細(xì)胞陽(yáng)性染色程度較高,閉鎖卵泡內(nèi)亦出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)(圖5-C)。

A.ANXA5在牦牛不同組織中的相對(duì)表達(dá)量(以腎表達(dá)水平作為對(duì)照,GAPDH作為內(nèi)參基因);B.ANXA5在牦牛卵巢中的定位:a.陰性對(duì)照-次級(jí)卵泡,b.陰性對(duì)照-黃體,c.陰性對(duì)照-閉鎖卵泡,d.ANXA5陽(yáng)性染色-次級(jí)卵泡,e.ANXA5陽(yáng)性染色-黃體,f.ANXA5陽(yáng)性染色-閉鎖卵泡;C.ANXA5在顆粒細(xì)胞及黃體中的平均染色強(qiáng)度。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05);不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖6同。A.The relative expression level of yak ANXA5 gene in different organizations(The kidney expression level was used as the control,GAPDH as the internal reference gene);B.Localization of ANXA5 in yak ovary:a.Negative control-Secondary follicle,b.Negative control-Corpus luteum,c.Negative control-Atresia follicle,d.ANXA5 positive staining-Secondary follicle,e.ANXA5 positive staining-Corpus luteum,f.ANXA5 positive staining-Atresia follicle;C.Average staining intensity of yak ANXA5 in granular cells and corpus luteum.Different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).The same as Fig.6.圖5 牦牛ANXA5基因組織表達(dá)與ANXA5蛋白定位Fig.5 Tissue expression of ANXA5 gene and mapping of ANXA5 protein in yak

2.5 牦牛ANXA5基因的體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞時(shí)序表達(dá)模式

選擇GAPDH基因?yàn)閰⒄?運(yùn)用qPCR法檢測(cè)在不同時(shí)期卵巢顆粒細(xì)胞中牦牛ANXA5基因的表達(dá)情況(圖6)。結(jié)果表明,培養(yǎng)72 h的顆粒細(xì)胞中ANXA5表達(dá)量最高,與培養(yǎng)24 h顆粒細(xì)胞間差異極顯著(P<0.01),與36 h顆粒細(xì)胞間差異極顯著(P<0.01);其次是在培養(yǎng)48 h的顆粒細(xì)胞中表達(dá)量較高,與培養(yǎng)24 h顆粒細(xì)胞間差異極顯著(P<0.01),與培養(yǎng)36 h顆粒細(xì)胞間差異顯著(P<0.05),但培養(yǎng)72 h顆粒細(xì)胞與培養(yǎng)48 h顆粒細(xì)胞間、培養(yǎng)36 h顆粒細(xì)胞與培養(yǎng)24 h顆粒細(xì)胞間表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖6 ANXA5在牦牛不同時(shí)期卵巢顆粒細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 The relative expression of yak ANXA5 gene in ovarian granular cells at different stages

3 結(jié)論與討論

本研究經(jīng)過(guò)克隆得到了牦牛ANXA5基因的產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 168 bp,CDS區(qū)966 bp,在堿基序列中編碼321個(gè)氨基酸。其中,占比最高的是Leu。有研究表明,存在于胎盤(pán)上的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)調(diào)控著Leu轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),而Leu轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是氨基酸從母體進(jìn)入胚胎血循環(huán)的關(guān)鍵[18]。此外,ANXA5是一種在胎盤(pán)中大量表達(dá)的蛋白質(zhì),有助于妊娠時(shí)胎兒的正常發(fā)育[19],表明ANXA5對(duì)于調(diào)控牦牛的胚胎發(fā)育具有重要的作用。牦牛與10個(gè)物種對(duì)比ANXA5基因相似性,黃牛與其核苷酸、氨基酸相似性皆為最高,與進(jìn)化樹(shù)分析的結(jié)果一致。氨基酸比對(duì)分析中還顯示,牦牛ANXA5基因與其他哺乳動(dòng)物相比,相似性超過(guò)90%,這符合物種進(jìn)化演變規(guī)律。

蛋白相互作用分析顯示,與ANXA5可能存在相互作用關(guān)系的蛋白有10個(gè),包括CASP8、CASP3、AKT1等。其中,CASP8在前列腺癌組織中蛋白表達(dá)更高;而與非復(fù)發(fā)性前列腺癌患者相比,復(fù)發(fā)性前列腺癌患者的CASP8 mRNA水平也更高,這提示CASP8可能是潛在高危前列腺癌和腎癌的生物標(biāo)志物[20]。其他互作蛋白如AKT1,研究發(fā)現(xiàn)其過(guò)表達(dá)和活化狀態(tài)在子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用[21]。由此可見(jiàn),與ANXA5存在相互作用的蛋白主要與生殖相關(guān)器官的病變有關(guān)。

ANXA5在各組織中廣泛分布,本研究通過(guò)熒光定量PCR試驗(yàn)得知,ANXA5在牦牛肺組織中表達(dá)最高,說(shuō)明ANXA5可能對(duì)肺組織有較強(qiáng)的直接作用,這是否與牦牛對(duì)高海拔低氧環(huán)境的適應(yīng)性相關(guān)有待進(jìn)一步研究;在子宮、輸卵管和卵巢組織中表達(dá)水平較高,可能與這些組織抗氧化損傷,維持正常生殖功能有關(guān)。此前有報(bào)道稱(chēng)ANXAS在宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌內(nèi)的表達(dá)相較正常組織中有所減少[22],這表明ANXA5的表達(dá)量確實(shí)參與生殖器官病變的發(fā)生,但究竟ANXA5是導(dǎo)致癌變的原因還是癌癥帶來(lái)的結(jié)果,目前尚未可知。

ANXA5在牦牛卵巢中有廣泛表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示,ANXA5在牦牛卵巢髓質(zhì)及皮質(zhì)均表達(dá),其主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá),這與孫旭娟[23]采用免疫熒光法觀(guān)察ANXA5定位的結(jié)果一致。在黃體中ANXA5表達(dá)更為顯著,呈現(xiàn)陽(yáng)性染色,而在次級(jí)卵泡中的顆粒細(xì)胞胞質(zhì)中未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng),這與在小鼠上的研究結(jié)果大致相符[15],說(shuō)明ANXA5在卵巢中的表達(dá)不具有物種特異性。此外,觀(guān)察到閉鎖卵泡中同樣有ANXA5表達(dá)。以前有報(bào)道稱(chēng)部分哺乳動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)閉鎖黃體[24],推測(cè)可能是卵泡閉鎖過(guò)程中發(fā)生了黃體化,ANXA5在進(jìn)入塌陷卵泡腔內(nèi)的濾泡細(xì)胞中表達(dá)。

ANXA5在牦牛不同時(shí)期卵巢顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),熒光定量PCR結(jié)果表明ANXA5的表達(dá)隨著顆粒細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。此前,有研究表明血清培養(yǎng)48 h后顆粒細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生黃體化[25],表明ANXA5與牦牛卵巢組織黃體化過(guò)程密切相關(guān)。然而,上述結(jié)果與Kawaminami團(tuán)隊(duì)[14]研究得到ANXA5在黃體細(xì)胞中表達(dá),而不在顆粒細(xì)胞中表達(dá)的結(jié)果不完全一致。此外,有報(bào)道稱(chēng)ANXA5參與真核細(xì)胞質(zhì)膜修復(fù)機(jī)制,ANXA5與被破壞的膜區(qū)域結(jié)合,促進(jìn)破裂質(zhì)膜快速重新密封[26]。因此,推測(cè)ANXA5在早期體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)可能發(fā)揮維持卵巢顆粒細(xì)胞質(zhì)膜完整性,保護(hù)卵巢顆粒細(xì)胞在體外環(huán)境中正常生長(zhǎng)等作用。

本試驗(yàn)成功克隆了產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 168 bp,CDS區(qū)為966 bp,共編碼321個(gè)氨基酸的牦牛ANXA5基因。ANXA5基因表達(dá)于牦牛多種組織,肺組織是ANXA5表達(dá)水平最高的部位,子宮、輸卵管和卵巢次之,可能ANXA5對(duì)牦牛這些組織生理功能的維持具有重要調(diào)節(jié)作用。同時(shí),ANXA5基因在不同時(shí)期牦牛卵巢顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),尤其在培養(yǎng)48 h后的顆粒細(xì)胞中顯著表達(dá),這可能與體外培養(yǎng)48 h后的顆粒細(xì)胞開(kāi)始黃體化有關(guān),免疫組化結(jié)果顯示,ANXA5主要在牦牛卵巢中的黃體細(xì)胞表達(dá),為進(jìn)一步研究ANXA5調(diào)控牦牛的繁殖調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。