李營(yíng)營(yíng),張昊堃,賈皓帆,郭婧瑤,楊喜喜,王志亮,李明娜,王欣榮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

小尾寒羊(Ovisaries)是我國(guó)高繁殖力綿羊品種之一,因其具有遺傳性能穩(wěn)定、繁殖力高、性成熟早、常年發(fā)情等多種優(yōu)良性狀,常被用作研究綿羊繁殖性能的理想模型[1]。母羊5月齡發(fā)情,發(fā)情周期16.8 d,發(fā)情持續(xù)期29.4 h,6～8月齡可初配,當(dāng)年即可產(chǎn)羔,年平均產(chǎn)羔率高達(dá)267.1%[2-3]。已有大量研究顯示,小尾寒羊的繁殖力受多種基因的調(diào)控。如,FecB基因不僅在生殖過程中具有累加效應(yīng)[4-5],而且還可通過甲基化調(diào)控小尾寒羊排卵率和產(chǎn)羔率[6];多羔相關(guān)基因BMPR1B、ESR2和FSHR的部分SNP位點(diǎn)突變可使小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)增加[7];生殖激素濃度變化還可影響PCNX4、FAS、RPL36AL和JCHAIN等相關(guān)等位基因的特異性表達(dá),對(duì)小尾寒羊排卵率和產(chǎn)羔率也有一定影響[8]。因此,有關(guān)小尾寒羊高繁殖力的具體遺傳機(jī)制尚不明確。

B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)家族相關(guān)因子調(diào)控的細(xì)胞凋亡可參與哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育[9]。BMF(Bcl-2 modifying factor)作為Bcl-2家族成員,是細(xì)胞凋亡的重要誘導(dǎo)因子,能啟動(dòng)內(nèi)源性線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并通過轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾調(diào)控多種生物學(xué)過程[10-11]。2001年,Puthalakath等[12]采用酵母雙雜交技術(shù)在小鼠胚胎cDNA文庫中初次篩選獲得了BMF基因。有研究表明,Bcl-2家族的促凋亡基因在胎兒到成人的整個(gè)卵巢發(fā)育過程中占主導(dǎo)地位[13-15]。另有研究表明,敲除小鼠BMF基因可有效增加卵巢中原始卵泡的數(shù)量,延長(zhǎng)小鼠繁殖年限[16-17],也可減少卵泡中卵母細(xì)胞的丟失[18]。BMF突變型小鼠在出生20～50 d后卵巢中閉鎖卵泡數(shù)少于野生型小鼠[19]。在體外培養(yǎng)的小尾寒羊顆粒細(xì)胞中,敲低BMF基因可提高卵泡顆粒細(xì)胞的增殖率[20]。因此,推測(cè)BMF基因可能通過特定的凋亡途徑參與哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育與卵子發(fā)生。然而有關(guān)BMF是否參與家畜生殖活動(dòng),特別是在小尾寒羊卵泡發(fā)育過程中的作用鮮有報(bào)道。

本研究以成年雌性小尾寒羊?yàn)檠芯繉?duì)象,采用RT-qPCR、Western Blot及IF技術(shù)檢測(cè)BMF基因在不同生理階段卵巢中的表達(dá),初步探索BMF基因是否參與卵巢周期性活動(dòng);接著剝離卵泡,進(jìn)一步檢測(cè)BMF基因在不同直徑卵泡中的表達(dá)模式,深入分析BMF在卵泡發(fā)育過程中的生物學(xué)功能,為將來揭示BMF基因調(diào)控小尾寒羊卵巢周期性活動(dòng),卵子發(fā)生和卵泡發(fā)育機(jī)制提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集

在臨夏縣興華牧業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)選取相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下,生長(zhǎng)發(fā)育正常,體質(zhì)量相近,健康的2～3歲純種雌性小尾寒羊8只,放置陰道孕酮栓CIDR(300 mg孕酮)(Bioniche Animal Health Pty,新西蘭)實(shí)施同期發(fā)情處理。試驗(yàn)處理期間,均不注射任何外源激素,正常飼喂,自由飲水。12 d后撤除孕酮栓塞,在撤栓后第18,42小時(shí)各屠宰4只,采集卵巢組織,用生理鹽水沖洗干凈,將右側(cè)卵巢放入4% 的多聚甲醛溶液中固定,左側(cè)卵巢用凍存管裝好,投入液氮保存,用于后續(xù)試驗(yàn)。

在臨夏市康泰屠宰場(chǎng)采集自然生長(zhǎng)發(fā)育的健康小尾寒羊卵巢,浸沒于37 ℃生理鹽水的培養(yǎng)皿中迅速剝離卵泡,并用游標(biāo)卡尺測(cè)量卵泡直徑。根據(jù)卵泡直徑將其分為小卵泡(直徑≤2 mm)、中卵泡(3.5 mm≤直徑≤4.5 mm)和大卵泡(直徑≥6 mm),分裝后置于液氮中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 將卵巢和卵泡組織置于液氮中充分研磨后,取各組織粉末100 mg,加入1 mL 總RNA提取試劑TransZol Up溶劑(全式金,北京)充分裂解,并參照TransZol Up說明,用氯仿、異丙醇、乙醇提取總RNA。使用超微量分光光度儀NanoDropTMOne 2000(Thermofisher,中國(guó))檢測(cè)RNA濃度及純度。統(tǒng)一將RNA濃度稀釋為500 ng/μL,用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ(艾科瑞,湖南)按說明書兩步法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索綿羊(Ovisaries)BMF基因(XM_042252260.1)和內(nèi)參基因β-actin(XM_004013078.5)的參考序列,利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物,然后用NCBI中的在線軟件Primer-BLAST檢測(cè)引物特異性,將引物序列送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司合成。引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息Tab.1 Information of primer sequences

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè) 使用實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x(LightCycler 480Ⅱ型,Roche,瑞士)進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè),反應(yīng)體系為:SYBR? Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(艾科瑞,湖南)10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,無RNA 酶水7.2 μL,cDNA 2 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性 95 ℃,2 min;變性95 ℃ 15 s,退火60 ℃ 15 s,延伸65 ℃ 15 s,循環(huán)40次。以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照,每個(gè)樣品做3次重復(fù)。程序結(jié)束后,獲得擴(kuò)增曲線、溶解曲線和循環(huán)閾值(Ct),采用2-ΔΔCt方法[21]進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

1.2.4 Western Blot分析用液氮充分研磨組織后,加入高效RIPA組織裂解液(索萊寶,北京)和苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)(索萊寶,北京)提取總蛋白,置于冰上裂解30 min,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,吸取上清,采用BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒(碧云天,上海)測(cè)定各組織總蛋白濃度,定量后將蛋白上清與4×蛋白上樣緩沖液(塞維爾,武漢)按照4∶1混合,于100 ℃沸水變性15 min,冷卻5 min,-20 ℃保存。根據(jù)BMF蛋白分子量,按照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒要求(索萊寶,北京)配制5%濃縮膠和12%分離膠,依次加入蛋白Marker(索萊寶,北京) 5 μL、樣品各6 μL進(jìn)行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)(80 V、30 min,100 V、90 min)。電泳結(jié)束后對(duì)照蛋白Marker切膠,濕法轉(zhuǎn)膜(80 V、70 min),5%脫脂奶粉(塞維爾,武漢)室溫?fù)u床封閉2 h,用含吐溫的TBST(索萊寶,北京)清洗4次、每次5 min。1∶500稀釋Anti-BMF rabbit polyclonal antibody(生工,上海)、1∶1 000稀釋Anti-bata-Actin(博奧森,北京),4 ℃孵育過夜,PBS(索萊寶,北京)洗膜。1∶1 000稀釋二抗Goat Anti-Rabbit IgG/HRP(博奧森,北京),室溫?fù)u床孵育1 h,PBS洗膜。用化學(xué)發(fā)光液(ECL)(碧云天,上海)顯影、曝光,Image J分析蛋白條帶灰度值。

1.2.5 免疫熒光染色(Immunofluorescence technique,IF) 將經(jīng)過4%的多聚甲醛固定成型的組織樣品通過乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片等步驟制成石蠟切片。切片再經(jīng)脫蠟、水洗、PBS清洗后在檸檬酸鹽緩沖液(谷歌,武漢)中進(jìn)行抗原修復(fù),微波爐中高火5 min、中火10 min,放至常溫后用PBS清洗。然后使用5% 的山羊血清(博奧森,北京)室溫封閉30 min,PBS清洗。滴加BMF一抗(1∶300),37 ℃孵育1 h,PBS清洗。避光條件下滴加熒光標(biāo)記的二抗(1∶500)(愛必信,上海),濕盒中室溫孵育1 h,PBS清洗。DAPI(1∶800)(索萊寶,北京)染色10 min,PBS清洗,封片。熒光顯微鏡觀察結(jié)果并采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMF基因及其編碼蛋白在不同生理階段卵巢中的表達(dá)

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果如圖1所示,BMF基因mRNA在撤栓后18,42 h的卵巢組織中均有表達(dá),且相對(duì)表達(dá)量存在差異。撤栓后18 h的卵巢組織中BMF相對(duì)表達(dá)量顯著低于撤栓后42 h(P<0.05)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2,4,5同。The different letters means significant difference(P < 0.05).The same as Fig.2,4,5.圖1 BMF mRNA在小尾寒羊不同生理階段卵巢中的表達(dá)Fig.1 Expression of BMF mRNA in ovary of Small-tailed Han Sheep at different physiological stages

Western Blot結(jié)果如圖2所示,BMF蛋白在小尾寒羊不同生理階段的卵巢中均有表達(dá),且在撤栓后18 h的相對(duì)表達(dá)量顯著低于撤栓后42 h(P<0.05)。該基因蛋白表達(dá)趨勢(shì)與mRNA表達(dá)趨勢(shì)相一致。

A.不同生理階段卵巢中BMF蛋白印跡條帶; B.BMF蛋白在不同生理階段卵巢中的表達(dá)。A.BMF blotting bands in ovaries at different physiological stages;B.BMF protein expression in different physiological stages of ovary.圖2 BMF蛋白在小尾寒羊不同生理階段卵巢中的表達(dá)Fig.2 Expression of BMF protein in ovary of Small-tailed Han Sheep at different physiological stages

2.2 BMF在小尾寒羊卵巢組織中的定位

通過免疫熒光染色分析BMF蛋白在不同生理階段卵巢組織中的定位,結(jié)果如圖3所示:BMF蛋白在2個(gè)生理階段的卵巢組織中均有表達(dá),其中在顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中呈免疫陽性反應(yīng),并且顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度較間質(zhì)細(xì)胞中高。

GC.顆粒細(xì)胞;LC.間質(zhì)細(xì)胞;TC.膜細(xì)胞。GC.Granulosa cells;LC.Leydig cells;TC.Theca cells.圖3 BMF蛋白在小尾寒羊不同生理階段卵巢中的分布情況(200×)Fig.3 Distribution of BMF protein in ovary of Small-tailed Han Sheep at different physiological stages(200×)

2.3 BMF基因及其編碼蛋白在不同直徑卵泡中的表達(dá)

BMF基因mRNA在不同直徑卵泡組織中的表達(dá)情況如圖4所示,BMF在小卵泡、中卵泡及大卵泡中均有表達(dá),且在中卵泡中的表達(dá)量顯著高于小卵泡和大卵泡(P<0.05),而在大卵泡中的表達(dá)量顯著高于小卵泡(P<0.05)。

圖4 BMF mRNA在不同直徑卵泡中的表達(dá)Fig.4 Expression of BMF mRNA in follicles of different diameters

Western Blot結(jié)果如圖5所示,BMF蛋白在小卵泡、中卵泡及大卵泡中均有表達(dá),且在不同直徑卵泡中的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05),在中卵泡中的表達(dá)量最高,大卵泡次之,小卵泡最低。BMF蛋白表達(dá)趨勢(shì)與mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致。

A.不同直徑卵泡中BMF蛋白印跡條帶:S.小卵泡,M.中卵泡,L.大卵泡;B.BMF蛋白在不同直徑卵泡中的表達(dá)。A.BMF imprinted bands in follicles of different diameters:S.Small follicles,M.Middle follicles,L.Large follicles;B.Expression of BMF protein in follicles of different diameters.圖5 BMF蛋白在不同直徑卵泡中的表達(dá)Fig.5 Expression of BMF protein in follicles of different diameters

3 結(jié)論與討論

綿羊初情期前后,在逐漸完善的下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控下,卵巢發(fā)生周期性活動(dòng),動(dòng)物表現(xiàn)出發(fā)情周期[22-24]。有研究對(duì)小尾寒羊?qū)嵤┩诎l(fā)情,發(fā)現(xiàn)撤栓后母羊血液中P4濃度在18 h顯著降低,直至36 h達(dá)到最低值,此時(shí)母羊發(fā)情率已超過90%。而E2濃度在撤栓后逐漸升高,且在撤栓后24 h達(dá)到峰值,之后一直維持在較高濃度。同時(shí)受下丘腦-垂體的正反饋?zhàn)饔?LH 濃度逐漸升高,在撤栓后42 h出現(xiàn)了LH峰;FSH濃度也迅速升高,并在48 h達(dá)到了峰值;隨后在LH和FSH的協(xié)同作用下促進(jìn)卵泡成熟并于52 h排卵[25-28]。因此,本試驗(yàn)對(duì)小尾寒羊?qū)嵤┩诎l(fā)情,選擇撤栓后18,42 h的卵巢,分別代表母畜處于2個(gè)不同的生理階段,即發(fā)情起始和排卵前期。卵泡作為卵巢的主要功能單位,在卵巢發(fā)生著周期性變化的同時(shí),卵泡也在生長(zhǎng)發(fā)育[29]。發(fā)情前期卵巢上的黃體萎縮、退化,新的卵泡開始大量募集,生長(zhǎng)發(fā)育。隨著卵泡的迅速發(fā)育,卵泡體積增大,動(dòng)物開始出現(xiàn)了發(fā)情表現(xiàn),直至排卵前卵泡發(fā)育至最大,卵泡壁擴(kuò)張變薄并凸出于卵巢表面,最終破裂排卵[3,30]。因此,本研究中所選擇的2個(gè)時(shí)間段(撤栓后18,42 h)分別代表卵巢中卵泡的募集與成熟過程,能夠反映卵巢在卵泡期的不同生理階段,可用于進(jìn)一步試驗(yàn)。

本研究發(fā)現(xiàn),BMF基因在撤栓后18 h卵巢中的表達(dá)量顯著低于撤栓后42 h,BMF蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與mRNA表達(dá)趨勢(shì)相一致,因此,推測(cè)BMF基因可能參與了卵巢的周期性活動(dòng),特別是對(duì)排卵前卵巢組織中卵泡的發(fā)育起到調(diào)控作用。這與BMF基因本身的促凋亡作用相一致[10],即BMF基因參與了排卵前大量卵泡的閉鎖。免疫熒光結(jié)果顯示,BMF蛋白可定位于不同生理階段卵巢組織中,其中在卵泡內(nèi)的熒光強(qiáng)度較卵泡外的其他部位高,且免疫陽性信號(hào)主要呈現(xiàn)在卵泡顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中,提示BMF基因可能會(huì)參與卵泡發(fā)育過程,進(jìn)而影響卵子發(fā)生。然而,有關(guān)BMF基因在卵泡發(fā)育過程中的具體作用,還需要進(jìn)一步縮小研究目標(biāo),分離卵泡進(jìn)行深入研究。

在綿羊卵泡發(fā)育過程中,卵泡直徑的大小與其發(fā)育階段有關(guān)。直徑3 mm以下的卵泡為募集期卵泡,3～5 mm的卵泡是選擇期卵泡,該時(shí)期也是決定卵泡發(fā)育成為優(yōu)勢(shì)卵泡或閉鎖的關(guān)鍵階段,5 mm以上的卵泡則為優(yōu)勢(shì)卵泡和排卵期卵泡[31]。因此,本試驗(yàn)分離的小卵泡(直徑≤2 mm)屬于募集期卵泡、中卵泡(3.5 mm≤直徑≤4.5 mm)屬于選擇期卵泡、大卵泡(直徑≥6 mm)為優(yōu)勢(shì)卵泡和排卵期卵泡。本研究結(jié)果顯示,BMFmRNA及其編碼蛋白的表達(dá)量在中卵泡中最高。推測(cè)BMF可能參與卵泡發(fā)育的選擇過程,具體作用于從屬卵泡的閉鎖退化,進(jìn)而使得少數(shù)卵泡繼續(xù)發(fā)育形成優(yōu)勢(shì)卵泡,這與BMF蛋白的促凋亡作用相一致[12]。然而與中卵泡相比,大卵泡中BMFmRNA及其編碼蛋白的表達(dá)量較低,推測(cè)可能是由于BMF在大卵泡中的表達(dá)受抑制,也可能與卵泡發(fā)育后期優(yōu)勢(shì)卵泡體積增大,卵泡液增多,顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞占比較少有關(guān)[32-33]。BMFmRNA及其編碼蛋白在小卵泡中表達(dá)量最低,這可能與卵泡發(fā)育前期處于迅速募集階段,選擇程度較低有關(guān)。TGF-β1作為一種多肽類細(xì)胞因子,對(duì)哺乳動(dòng)物生殖發(fā)育過程至關(guān)重要,可參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、調(diào)控胚胎生長(zhǎng)發(fā)育及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等過程[34]。在藏羊不同直徑卵泡中,TGF-β1基因mRNA及其編碼蛋白的表達(dá)存在顯著差異,進(jìn)一步證實(shí)了TGF-β1在哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育過程中的作用[35]。同樣,在綿羊卵泡發(fā)育過程中,調(diào)控雌性動(dòng)物生殖發(fā)育的信號(hào)分子WNT2在綿羊不同大小卵泡中均有表達(dá)且差異顯著[36]。以上研究結(jié)果均與本研究相似,因此,筆者有理由推測(cè)BMF基因可能參與小尾寒羊卵泡募集、選擇和優(yōu)勢(shì)化過程,在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過程中起重要作用。然而有關(guān)其在卵泡發(fā)育過程中的具體作用機(jī)制尚不明確。

卵子的命運(yùn)取決于卵泡的發(fā)育,因此,卵泡發(fā)育與卵子發(fā)生緊密關(guān)聯(lián),互相調(diào)節(jié);其中顆粒細(xì)胞的增殖和分化起到了十分關(guān)鍵的作用。顆粒細(xì)胞能通過自分泌和旁分泌的形式分泌細(xì)胞因子和激素促進(jìn)卵泡發(fā)育,相反顆粒細(xì)胞凋亡則會(huì)引起卵泡閉鎖[37]。已有研究表明,敲低BMF基因可以顯著降低小尾寒羊體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞凋亡率[20]。本研究結(jié)果顯示,BMF蛋白在卵泡顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度較高。另有研究發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果,BMF蛋白在雌性野生型小鼠閉鎖卵泡和竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞中出現(xiàn)了免疫陽性反應(yīng)性,而在突變型小鼠任何發(fā)育階段卵泡中均未發(fā)現(xiàn)其陽性反應(yīng)[19]。據(jù)此可以推測(cè),BMF基因能夠通過調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖分化來影響卵泡發(fā)育和卵子發(fā)生。同時(shí),BMF基因能否作用于卵泡膜細(xì)胞進(jìn)而影響卵泡發(fā)育還有待進(jìn)一步研究。

對(duì)小尾寒羊?qū)嵤┩诎l(fā)情,BMF基因及其編碼蛋白在撤栓后18 h卵巢組織中的表達(dá)量顯著低于撤栓后42 h(P<0.05),且在中卵泡中的表達(dá)量顯著高于大卵泡和小卵泡(P<0.05),以上結(jié)果表明,BMF基因參與了卵巢周期性活動(dòng)及卵泡發(fā)育,特別是在卵泡的選擇和優(yōu)勢(shì)化過程發(fā)揮了重要作用。本研究對(duì)提高小尾寒羊生產(chǎn)力具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義,同時(shí)對(duì)提高其他綿羊品種繁殖性能具有理論參考價(jià)值。