劉霞飛,楊合霖,王念民,呂偉華,徐 偉,曹頂臣,張 穎

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江 哈爾濱 150076;2.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧 大連 116023)

鱘魚隸屬于輻鰭亞綱(Actimopterygii)、軟骨硬鱗總目(Chondrostei)、鱘形目(Acipenser iforms),起源于白堊紀(jì)時(shí)期,被譽(yù)為“水中活化石”[1],具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營養(yǎng)價(jià)值和科研價(jià)值。20世紀(jì)80年代以來,由于過度捕撈、水質(zhì)污染和水利工程等原因,世界范圍內(nèi)鱘魚野生資源量銳減,已于1998年被列為《瀕危動(dòng)植物國際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ保護(hù)物種[1]。為滿足市場(chǎng)需求,鱘魚生產(chǎn)已逐漸由捕撈轉(zhuǎn)變?yōu)槿斯ゐB(yǎng)殖,20世紀(jì)90年代至今,我國先后攻克鱘魚人工繁育、苗種馴養(yǎng)、病害防治、飼料生產(chǎn)、魚子醬及相關(guān)產(chǎn)品加工等一系列關(guān)鍵技術(shù),已發(fā)展為世界上最大的鱘魚養(yǎng)殖國和魚子醬出口國,目前,我國的養(yǎng)殖年產(chǎn)量達(dá)9萬t,占世界鱘魚產(chǎn)量的80%以上[2]。雜交鱘鱘龍1號(hào)(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂)作為我國魚子醬生產(chǎn)的主要品種,兼具生長快和性腺發(fā)育早等優(yōu)勢(shì),深受養(yǎng)殖戶的歡迎[3]。

某高層住宅樓采用剪力墻結(jié)構(gòu)、筏板基礎(chǔ)。地基處理采用C20的CFG樁提高地基承載力，CFG樁樁徑500 mm，樁長24 m，樁間距1.6 m，按正三角形梅花形滿堂布置，總樁數(shù)660根，復(fù)合地基承載力特征值不小于450 kPa。場(chǎng)地工程地質(zhì)條件如表1所示。

我國內(nèi)陸有大量的中高鹽堿水域處于荒蕪狀態(tài),拓寬這些宜漁水域,是保持漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑,此外,通過漁農(nóng)綜合治理,也可有效緩解土地次生鹽堿化程度,使無法耕作的低洼鹽堿地得到利用。且我國內(nèi)陸鹽堿水資源豐富,以西北和東北地區(qū)的碳酸鹽型的鹽堿湖泊、沼澤及淺層地下半咸水居多,具有擴(kuò)張的趨勢(shì)。研究證實(shí),“以漁改堿”是開發(fā)利用鹽堿水資源的有效途徑,因此,鹽堿漁業(yè)相關(guān)技術(shù)的研究對(duì)改善鹽堿地區(qū)的生態(tài)環(huán)境,有效地利用鹽堿水域具有重要的作用[4]。目前,有關(guān)淡水魚類耐鹽堿馴養(yǎng)研究的相關(guān)報(bào)道較多,如對(duì)黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[5]、烏蘇里擬鲿(Pseudobagrusussuriensis)[6]、歐鲇(Silurusglanis)[7]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[8-10]、卡拉白魚(Chalcalburnuschalcoidesaralensis)[11]、葉爾羌高原鰍(Triplophysayarkandensis)[12]、淡水白鯧幼魚(Colossomabrachypomum)[13]等魚類的耐鹽堿研究表明,淡水魚類的耐鹽堿范圍比較寬泛,且耐鹽堿機(jī)制也各不相同,目前,關(guān)于鱘魚鹽堿馴養(yǎng)的相關(guān)研究多數(shù)集中在鹽度對(duì)其的影響[14-15],而關(guān)于鱘魚的堿度馴養(yǎng)的相關(guān)研究報(bào)道則較少。

在進(jìn)行林木種苗培育的過程中，另外一個(gè)非常重要的管護(hù)因素就是光照因素。管理人員應(yīng)該依照林木種苗的生長需要來嚴(yán)格控制種苗接受光照的時(shí)間和強(qiáng)度。在遇到特殊情況的時(shí)候（如干旱），管理人員應(yīng)該及時(shí)通過各種方式來對(duì)光照進(jìn)行調(diào)控，這樣才可以更好的保證林木種苗的健康成長。

魚類皮膚在維持魚類體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的同時(shí),還參與機(jī)體與外界水環(huán)境的免疫調(diào)節(jié),包括免疫防御、體液調(diào)節(jié)、運(yùn)動(dòng)感知以及繁殖活動(dòng)等[16-17],且皮膚長期暴露于水環(huán)境中,是與外界環(huán)境接觸面積最大的黏膜層組織[18],尤其是對(duì)于鱘魚這種無鱗魚類,皮膚是魚體與外界直接接觸的第一道門戶[19],當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境刺激后,體表的黏液細(xì)胞則大量分泌,其中含有黏多糖、糖蛋白、免疫球蛋白及各種水解性酶類等多種活性物質(zhì)[20-21],以此來緩沖鹽堿環(huán)境下機(jī)體受到的傷害。因此,本研究基于轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序?qū)\龍1號(hào)皮膚組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,比較分析正常條件下和堿脅迫下雜交鱘鱘龍1號(hào)的皮膚分子特征,并構(gòu)建代謝通路互作網(wǎng)絡(luò),以期為揭示無鱗魚類的耐鹽堿機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

今年的年會(huì)上，學(xué)會(huì)推薦報(bào)送的論文中，云南電網(wǎng)有限責(zé)任公司注冊(cè)參會(huì)28篇，電力科學(xué)研究院《大容量STATCOM裝置在直流交換站的控制策略及響應(yīng)分析》獲優(yōu)秀論文獎(jiǎng)，5篇參加會(huì)議宣講，18篇參加會(huì)議張貼。參加會(huì)議宣講的作者代表均到現(xiàn)場(chǎng)參與了交流分享。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)養(yǎng)殖7 d后進(jìn)行樣品采集,用40 mg/L的 MS-222 在試驗(yàn)相同鹽堿濃度下麻醉。于對(duì)照組和最高濃度處理組分別隨機(jī)采取5尾魚進(jìn)行解剖,將其皮膚于液氮臨時(shí)保存,轉(zhuǎn)于-80 ℃冰箱保存,用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

每組隨機(jī)試養(yǎng)15尾雜交鱘進(jìn)行耐受試驗(yàn),試驗(yàn)期間水溫為14～16 ℃,溶氧量大于9 mg/L,投喂顆粒飼料每天2次(9:00和15:00),日投餌率為1%。根據(jù)水質(zhì)情況,每2～3日更換相同堿度新水,保持水質(zhì)清潔。

在進(jìn)行施工準(zhǔn)備工作前，一定要積極配合建設(shè)單位進(jìn)行組織設(shè)計(jì)的交底工作，對(duì)于施工的設(shè)計(jì)文件一定要進(jìn)行仔細(xì)的審核，也要結(jié)合實(shí)際的工程需要，進(jìn)行必要的驗(yàn)證以及補(bǔ)測(cè)。對(duì)于可能發(fā)生塌方的區(qū)域，必須要做好一定的必要準(zhǔn)備，在施工的過程中，必須做好相對(duì)應(yīng)的預(yù)防措施。在必要的情況下，采取相對(duì)的應(yīng)急措施以消除各種不利因素的影響。只有這樣，才可以避免塌方的產(chǎn)生。由于隧洞的地質(zhì)條件相對(duì)比較復(fù)雜，對(duì)于質(zhì)量的監(jiān)控以及地址預(yù)報(bào)的工作必須要做好。

試驗(yàn)魚為30日齡的雜交鱘鱘龍1號(hào),取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院呼蘭養(yǎng)殖基地。養(yǎng)殖水體為食用級(jí)碳酸氫鈉(純度為99%)溶于曝氣2 d的自來水,體積為180 L。本試驗(yàn)設(shè)置了1個(gè)對(duì)照組與3個(gè)處理組,對(duì)照組為自來水,實(shí)際測(cè)定堿度為3.13～3.20 mmol/L,試驗(yàn)組為添加99%純度的食用NaHCO3,試驗(yàn)組實(shí)際測(cè)定堿度分別為7.47～7.73 mmol/L,11.6～12.6 mmol/L,14.4～16.67 mmol/L,每組設(shè)3個(gè)平行組,每個(gè)平行組養(yǎng)殖15尾,共180尾。

將試驗(yàn)組和對(duì)照組分別采集皮膚,腎臟組織,于Bouin′s 液中固定,48 h后更換新的固定液后4 ℃保存。

人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株U937購自中科院上海細(xì)胞庫。細(xì)菌菌株：大腸桿菌DH5α購自TIANGEN生物公司。質(zhì)粒：pMD-18T載體，購自Takara公司。T4 DNA連接酶、Taq DNA Polymerase、High Fidelity PrimeScript RT-PCR、DNA凝膠回收試劑盒、High Fidelity PrimeScript RT-PCR Kit、5'-Full RACE Kit、3'-Full RACE Kit均購自Takara公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈徸訲IANGEN公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 利用TRIzol法抽提試劑盒提取總RNA。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各RNA樣品的純度、濃度及完整性等。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司(上海)完成,利用 Illumina Hi Seq 500(Illumina,America)平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序,其方法可以參考Nan等[22]。使用Cytoscape軟件構(gòu)建代謝通路互作網(wǎng)絡(luò)。

1.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋 將原始數(shù)據(jù)(Raw reads)進(jìn)行分析和過濾,把接頭序列、未知序列以及低質(zhì)量序列除去,得到干凈數(shù)據(jù)(Cleanreads)。轉(zhuǎn)錄本的拼裝通過Trinity(v2.5.1 版本)軟件實(shí)現(xiàn),每個(gè)基因的最長的轉(zhuǎn)錄本被讀為單基因(Unigene)[23],將其作為后續(xù)深入分析的參考序列保留。

為了解上述基因的詳細(xì)信息,將其與Nt、Nr、KOG、Swiss-Prot、KEGG[24]、Pfam[25-26]、GO[27]等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)注釋。

1.2.3 基因表達(dá)水平和差異表達(dá)分析 把得到的Clean reads與轉(zhuǎn)錄本用Bowtie 2軟件比對(duì),得到相應(yīng)基因的read count數(shù)目[28]。將其進(jìn)行處理后分析得到該基因的表達(dá)水平。用DEG-seq進(jìn)行差異分析。

1.2.4 差異基因的富集分析 將DEG基因采用GO富集分析,然后進(jìn)行功能描述。找出DEG基因被注釋的基因相對(duì)應(yīng)的顯著富集的pathway。根據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫資源,進(jìn)行通路富集分析,并使用KOBAS軟件對(duì)其差異基因進(jìn)行富集統(tǒng)計(jì)[29]。

1.2.5 qPCR 驗(yàn)證 為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,篩選了7個(gè)具有差異表達(dá)的基因(表1) 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)。使用與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序同批次的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得相應(yīng)的cDNA,稀釋后每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù),以β-actin為參考基因,在Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-time PCR System定量儀中進(jìn)行 qPCR。反應(yīng)體系包括5 μL 2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus),上、下游引物各0.4 μL(10 μmol/L),1 μL cDNA,3 μL ddH2O,0.2 μL 50×ROX Reference Dye Ⅱ,總體系為 10 μL。反應(yīng)程序采用三步法:預(yù)變性95 ℃ 180 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s(收集熒光),40 個(gè)循環(huán);熔解曲線分析PCR 產(chǎn)物的特異性。最后,使用 SPSS 17.0 軟件及采用2-ΔΔCt方法分析結(jié)果。

表1 引物及序列Tab.1 Primers and sequences

1.3 組織切片及拍照觀察

將組織于Bouin′s 固定液中取出,取體積約為2.0 cm×1.5 cm×0.3 cm,進(jìn)行梯度脫水,透明,包埋,切片,脫蠟,染色,封片。具體實(shí)驗(yàn)操作步驟參照高珊等[30]的方法。最后用光學(xué)顯微鏡(Leica)觀察并拍照。

從表2的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)來看：游覽次數(shù)分布比較平均，占比最多的是2次，占35.03%。游覽時(shí)間最多的是周末和自由時(shí)間，均占比39.25%。游覽目的首要的是陪伴小朋友及家人，占比53.7%；其次是休閑放松、舒緩壓力，占比37.85%。信息獲取渠道主要通過熟人介紹、網(wǎng)絡(luò)信息、旅游宣傳冊(cè)和電視廣告，四項(xiàng)合計(jì)占比87.45%。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及組裝

本研究提取了鱘龍1號(hào)皮膚的總RNA,并構(gòu)建了相應(yīng)的cDNA文庫[31]。通過Illumina NextSeq 500平臺(tái)對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序,共獲得的41.5 G的Clean data,各樣本的有效數(shù)據(jù)量分布在 6.59～7.27 G,Q30堿基分布在 95.76%～96.29%,平均 GC含量均在45%以上。該結(jié)果顯示測(cè)序質(zhì)量可靠,構(gòu)建文庫可用于后續(xù)分析(表2)。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Summary of RAN-seq dates

通過Trinity軟件拼接,并挑選出最長的序列作為Unigene。最終獲得Unigene數(shù)量80 422條,總長度為88 658 788 bp(表3)。

表3 轉(zhuǎn)錄本拼接結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab.3 Statistics of transcript splicing results

利用Bowtie 2 將 Clean reads 比對(duì)到 Unigene,總比對(duì)率為88.64%～91.09%,多位點(diǎn)比對(duì)率為24.48%～28.63%,單一位點(diǎn)比對(duì)率為62.18%～66.61%(表4)。

表4 Clean reads與 Unigene 比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab.4 Comparison results statistics of Clean reads and Unigene

2.2 轉(zhuǎn)錄組功能注釋

為獲得全面的 Unigene 功能信息,將Unigene與 NR、NT、KEGG、Swiss-Prot、Pfam、KOG和GO公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示,NR注釋的Unigene比例最高(38.64%),共注釋到31 078個(gè)Unigene,KEGG注釋的Unigene比例最低(22.71%),共注釋到18 262個(gè)Unigene(表5)。

表5 NR、NT、KEGG、Swiss-Prot、Pfam、KOG和GO數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果Tab.5 Annotation results of NR,NT,KEGG,Swiss-Prot,Pfam,KOG and GO

2.3 雜交鱘差異表達(dá)基因聚類分析

堿脅迫組與對(duì)照組在皮膚的差異表達(dá)基因數(shù)量為1 849個(gè),顯著上調(diào)基因1 302個(gè),顯著下調(diào)基因?yàn)?47個(gè)(圖1)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類熱圖分析(圖2),結(jié)果顯示,鱘龍1號(hào)的淡水組和堿脅迫組的差異表達(dá)基因分別聚類,同組樣本不同重復(fù)表達(dá)相似。

紅色代表上調(diào)基因;綠色代表下調(diào)基因(P<0.05)。The red balls represent up regulated gene;the green balls represent down regulated gene.圖1 對(duì)照組與脅迫組差異基因表達(dá)火山圖Fig.1 Volcano plot of differential gene expression between control and stress groups

圖2 對(duì)照組和脅迫組差異基因表達(dá)熱圖Fig.2 Heatmap of differential gene expression between control and stress groups

2.4 雜交鱘差異表達(dá)基因GO富集分析

差異表達(dá)基因富集到生物過程的主要有細(xì)胞膜鈣離子濃度的調(diào)節(jié)、肌肉收縮和蛋白質(zhì)側(cè)鏈脫谷氨?；?富集到細(xì)胞組分主要有肌鈣蛋白復(fù)合物、肌漿網(wǎng)膜連接和肌球蛋白絲;分子功能主要有肌鈣蛋白T結(jié)合、肌鈣蛋白C結(jié)合、肌鈣蛋白Ⅰ結(jié)合和核糖體結(jié)構(gòu)成分等,這些富集條目的相關(guān)基因表達(dá)均顯著上調(diào)(表5、圖3)。

1.細(xì)胞膜鈣離子濃度調(diào)節(jié);2.肌肉收縮;3.蛋白質(zhì)側(cè)鏈脫谷氨?；?4.骨骼肌收縮;5.C-末端蛋白質(zhì)脫谷氨?；?6.賴諾丁敏感鈣釋放通道的正調(diào)控;7.調(diào)節(jié)肌肉收縮;8.鈣離子釋放至胞液;9.心肌收縮;10.ATP響應(yīng);11.肌鈣蛋白復(fù)合物;12.肌漿網(wǎng)膜連接;13.肌球蛋白;14.肌原纖維;15.呼吸鏈;16.橫紋肌;17.膠原蛋白三聚體;18.Z板(肌間盤);19.肌纖維;20.鈣通道復(fù)合體;21.肌鈣蛋白T結(jié)合;22.肌鈣蛋白C結(jié)合;23.肌鈣蛋白Ⅰ結(jié)合; 24.5-氨基乙酰丙酸合酶活性;25.肌肉的結(jié)構(gòu)組成;26.鈣離子結(jié)合;27.金屬羧肽酶活性 ;28.神經(jīng)遞質(zhì):鈉同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性;29.系統(tǒng)活性; 30.核糖體的結(jié)構(gòu)成分。1.Regulation of cytosolic calcium ion concentration;2.Muscle contraction;3.Protein side chain deglutamylation;4.Skeletal muscle contraction;5.C-terminal protein deglutamylation;6.Positive regulation of ryanodine-sensitive calcium-release channel;7.Regulation of muscle contraction;8.Regulation of release of sequestered calcium ion into cytosol by;9.Cardiac muscle contraction;10.Response to ATP;11.Troponin complex;12.Junctional sarcoplasmic reticulum membrane;13.Myosin filament;14.Myofibril;15.Respiratory chain;16.Striated muscle thin filament;17.Collagen trimer;18.Z disc;19.Sarcomere;20.Calcium channel complex;21.Troponin T binding;22.Troponin C binding;23.Troponin Ⅰ binding;24.5-aminolevulinate synthase activity;25.Structural constituent of muscle;26.Calcium ion binding;27.Metallocarboxypeptidase activity;28.Neurotransmitter:sodium symporter activity;29.Channel activity;30.Structural constituent of ribosome.圖3 皮膚差異基因代謝通路GO顯著富集結(jié)果Fig.3 Significant enrichment of Go in skin differential gene metabolic pathway

2.5 雜交鱘差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

為進(jìn)一步了解 DEGs 的功能,對(duì)所有 DEGs進(jìn)行 KEGG 富集分析。共注釋到18 262個(gè)Unigene,注釋比例為22.71%。將差異表達(dá)基因反映的代謝通路進(jìn)行KEGG富集分析,結(jié)果顯示,對(duì)照組和堿脅迫組在代謝通路上顯著富集主要有糖酵解/糖異生,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝、淀粉和蔗糖代謝等通路,且這些主要富集通路的相關(guān)基因均表達(dá)上調(diào)(圖4)。

1.擴(kuò)張型心肌癥 ko05414;2.肥厚型心肌癥 ko05410;3.甲狀腺癌 ko05216;4.金黃色葡萄球菌感染 ko05150;5.朊病毒疾病 ko05020;6.蛋白質(zhì)的消化和吸收 ko04974;7.血小板激活 ko04611;8.補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián) ko04610;9.間隙連接 ko04540;10.緊密連接 ko04530;11.ECM受體相互作用 ko04512;12.局部粘連 ko04510;13.腎上腺素能在心肌細(xì)胞中的信號(hào)傳遞 ko04261;14.心肌收縮 ko04260;15.鈣信號(hào)通路 ko04020;16.核糖體 ko03010;17.卟啉和葉綠素的新陳代謝 ko00860;18.淀粉和蔗糖代謝 ko00500;19.甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝 ko00260;20.糖酵解/糖異生 ko00010。顏色梯度由紅到綠對(duì)應(yīng)富集顯著性由高到低;圓球大小代表顯著富集基因的數(shù)量。1.Dilated cardiomyopathy;2.Hypertrophic cardiomyopathy(HCM);3.Thyroid cancer;4.Staphylococcus aureus infection;5.Prion diseases;6.Protein digestion and absorption;7.Platelet activation;8.Complement and coagulation cascades;9. Gap junction;10.Tight junction;11.ECM-receptor interaction;12.Focal adhesion;13.Adrenergic signaling in cardiomyocytes;14.Cardiac muscle contraction;15.Calcium signaling pathway;16.Ribosome;17.Porphyrin and chlorophyll metabolism;18.Starch and sucrose metabolism;19.Glycine, serine and threonine metabolism;20.Glycolysis/Gluconeogenesis.The color gradient is from red to green and the corresponding enrichment is from high to low;the size of the sphere represents the number of significantly enriched genes.圖4 TOP20皮膚差異基因代謝通路KEGG顯著富集結(jié)果Fig.4 The significantly enriched pathways and corresponding DEGs number of each pathway

2.6 雜交鱘KEGG代謝通路互作網(wǎng)絡(luò)分析

qPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中 7 個(gè)表達(dá)差異顯著的基因,并將其與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相比較,結(jié)果表明,這些基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致,說明 RNA-Seq 結(jié)果的可靠性(圖5)。

2.7 qPCR 驗(yàn)證和組織表達(dá)檢測(cè)

對(duì)KEGG中顯著富集到皮膚組織的27個(gè)代謝通路(P<0.05)構(gòu)建代謝通路互作網(wǎng)絡(luò),其中黏著斑(Focal adhesion)、蛋白質(zhì)消化吸收(Protein digestion and absorption)和血小板活化(Platelet activation)等途徑為主效途徑,這些途徑的相關(guān)基因在堿脅迫組的皮膚組織中均表達(dá)上調(diào),顯著富集的通路中有補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)(Complement and coagulation cascades),缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路等病理相關(guān)途徑表達(dá)下調(diào)。

縱坐標(biāo)為差異倍數(shù)的 log2值。The vertical coordinate is log2(Fold Change)of the difference multiplier.圖5 qPCR檢測(cè)RNA-Seq結(jié)果Fig.5 Validation of RNA-Seq data using qPCR

2.8 NaHCO3脅迫下對(duì)雜交鱘腎臟、皮膚的結(jié)構(gòu)變化

NaHCO3堿度脅迫下T1、T2與T3組的腎小球和腎小管隨著堿度升高,均發(fā)生了比較明顯的皺縮,T2與T3組腎小球皺縮,體積變小,囊腔變大,其中T3組腎小球上皮細(xì)胞發(fā)生脫落、彌散;此外,各級(jí)腎小管萎縮,間質(zhì)空隙變大,T3組中遠(yuǎn)曲小管萎縮尤為明顯,上皮細(xì)胞體積減小,管壁變薄。

如圖7所示,C組和T1組在正常情況下由表皮層和真皮層構(gòu)成。表皮層主要由扁平上皮細(xì)胞、棒狀細(xì)胞和黏液細(xì)胞,以及基底細(xì)胞等組成;真皮層位于表皮層之下,主要由黏液細(xì)胞、色素細(xì)胞等構(gòu)成。健康下的雜交鱘皮膚表皮層上皮細(xì)胞和棒狀細(xì)胞排列緊密且規(guī)則,棒狀細(xì)胞因嗜酸,所以伊紅染色十分顯著,且細(xì)胞核較小;黏液細(xì)胞無腫脹現(xiàn)象,并且黏液細(xì)胞數(shù)量較少;真皮層由疏松層和致密層構(gòu)成,前者較厚,后者較薄。疏松層主要為疏松結(jié)締組織,呈網(wǎng)狀,網(wǎng)眼細(xì)長,含有黑色素細(xì)胞,數(shù)量極少;致密層是纖維排列緊密的致密結(jié)締組織,有明顯的橫紋肌。

A—D.C組、T1組、T2組、T3組;Gl.腎小球;CS.頸段;DCT.遠(yuǎn)曲小管;PCT.近曲小管。A—D.Group C,T1,T2 and T3 respectively;Gl.Glomerulus;CS.Cervical segment;DCT.Distal convoluted tubule;PCT.Proximal convoluted tubule.圖6 不同堿度對(duì)腎臟的影響Fig.6 Effects of different alkalinity on kidney

如圖6所示,C組和T1組在正常情況下雜交鱘腎臟由腎小球、腎小管、連接小管和集合小管組成。腎小球形似一圓囊,其中包括一小球,乃血管纏繞形成,其上皮細(xì)胞延伸包圍該小球。腎小管與腎小球緊密相連,起首處近曲小管很細(xì),內(nèi)壁刷狀緣豐富,上皮細(xì)胞呈柱狀,核較大,呈橢圓形,延伸后形成遠(yuǎn)曲小管,遠(yuǎn)曲小管微絨毛不發(fā)達(dá),核較大,呈橢圓形,且居中位,腎小管末端很細(xì),上皮細(xì)胞偏小,形似圓形或方形。連接小管主要連接腎小管和集合小管,起首部較細(xì),延伸后較粗,其上皮細(xì)胞系長方形或正方形,細(xì)胞內(nèi)緣無刷狀質(zhì),嗜伊紅,以此明顯區(qū)分腎小管。集合小管與腎小管及連接小管明顯不同,上皮細(xì)胞系長柱形,管徑要明顯大于腎小管。

醫(yī)護(hù)英語智慧課堂教學(xué)模式是順應(yīng)時(shí)代要求的專門用途英語教學(xué)的新型課堂教學(xué)模式，有利于學(xué)生的個(gè)性化學(xué)習(xí)，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)造性學(xué)習(xí)的能力學(xué)生，促進(jìn)學(xué)生創(chuàng)新思維的發(fā)展，提升學(xué)生解決問題的能力，使學(xué)生發(fā)展成為真正的“智慧者”[3]。

NaHCO3堿度脅迫下T1、T2與T3組的皮膚的表皮中間層排列隨堿度的升高逐漸稀疏,并有脫落的現(xiàn)象發(fā)生,尤其是黏液細(xì)胞隨堿度的升高數(shù)量明顯增加,且逐漸有腫脹現(xiàn)象發(fā)生;同時(shí),棒狀細(xì)胞的細(xì)胞核也有明顯的固縮現(xiàn)象,此外,T2與T1組的扁平上皮細(xì)胞脫落尤為明顯,棒狀細(xì)胞排列尤為緊密;T3組的表皮層與真皮層有明顯的分離并即將脫落的現(xiàn)象,細(xì)胞基底層與其他堿度組相比較薄。

3 結(jié)論與討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

廣義上來說,轉(zhuǎn)錄組是指在某一生理?xiàng)l件下,細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合[32]。近年來,轉(zhuǎn)錄組技術(shù)主要應(yīng)用在水生生物的環(huán)境脅迫方面,其中,包括溫度、低氧、運(yùn)輸以及鹽堿脅迫等。通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的應(yīng)用,宋慧[33]發(fā)現(xiàn)不同鹽度梯度條件下大銀魚(Protosalanxhyalocranius)胚胎的分子適應(yīng)機(jī)制;劉韜等[34]通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)探索青田田魚(Tripod fish)在急性低氧脅迫復(fù)氧恢復(fù)條件下幼腦組織的生理調(diào)節(jié)機(jī)制;壽晨艷[35]對(duì)褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)溫度鹽度下進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組研究,探索了其在溫度和鹽度脅迫條件下關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)機(jī)制。目前,轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在對(duì)水生生物的鹽堿脅迫方面的研究還不夠成熟,還需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

本研究中,對(duì)雜交鱘鱘龍1號(hào)進(jìn)行從頭裝配(Denovoassembly)獲得80 422條Unigene,總長度為88 658 788 bp,與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示,拼接質(zhì)量較好,表明了該雜交鱘的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)可靠。與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果顯示,鱘龍1號(hào)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)到Nr數(shù)據(jù)庫僅38.64%,說明仍有約60%的基因未能比對(duì)到Nr數(shù)據(jù)庫中。此外,在國際公共數(shù)據(jù)庫GO、KOG和KEGG中的功能注釋顯示,只有25%左右的Unigene序列被注釋到,表明了鱘科魚類的基因序列在國際公共數(shù)據(jù)庫中收錄較少。本研究的Unigene序列結(jié)果進(jìn)一步補(bǔ)充了數(shù)據(jù)庫中鱘科魚類的基因資源,并且通過基因功能注釋,初步揭示了鱘科魚類部分基因的功能、生物過程和代謝途徑,有效為鱘科魚類的功能基因挖掘提供數(shù)據(jù)支持。

3.2 差異基因的表達(dá)和富集分析

研究證實(shí),高堿環(huán)境對(duì)魚體主要產(chǎn)生滲透脅迫和離子脅迫2種脅迫作用,其中滲透脅迫主要是因?yàn)榄h(huán)境中離子濃度升高,水分難以進(jìn)入細(xì)胞造成的,而離子脅迫則多指離子過量積累造成的毒害作用[36]。本研究的GO注釋和KEGG注釋結(jié)果表明,雜交鱘皮膚組織中胞漿內(nèi)鈣離子濃度、肌肉收縮、氨基酸代謝、糖代謝和蛋白代謝等相關(guān)差異基因均上調(diào)表達(dá)。在非等滲環(huán)境中,魚體對(duì)外界環(huán)境作出反應(yīng),而這一過程需要能量的消耗[37],消耗的部分主要是從外界的食物供給中獲得,所以用于滲透調(diào)節(jié)的能量越多,用于生長的能量就越少,生長就相對(duì)緩慢[38]。隨著鹽堿度的增加,魚體抗病能力也會(huì)隨之下降,根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果[39]顯示,在當(dāng)碳酸鹽型堿度超過12 mmol/L,雜交鱘幼魚的攝食量減少、呼吸頻率增加,易驚厥游動(dòng)速度相對(duì)加快,生長受到顯著抑制,堿脅迫組的生長速度顯著慢于對(duì)照組,這也與郭雯翡等[40]研究結(jié)果相符。

醫(yī)學(xué)生應(yīng)深入調(diào)查并了解醫(yī)學(xué)畢業(yè)生的就業(yè)現(xiàn)狀和就業(yè)路徑，并進(jìn)行調(diào)查，深入了解創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)的個(gè)人價(jià)值和社會(huì)價(jià)值[6]，樹立醫(yī)學(xué)生創(chuàng)新意識(shí)和格局意識(shí)，轉(zhuǎn)變就業(yè)觀念，契合國家未來創(chuàng)新體系；各相關(guān)高等醫(yī)學(xué)院校應(yīng)把創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)融入醫(yī)學(xué)專業(yè)教育，成為終身教育；社會(huì)媒體的大力宣傳，營造全社會(huì)支持醫(yī)學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)的氛圍，醫(yī)學(xué)生應(yīng)從中提高認(rèn)識(shí)，抓住機(jī)遇，用所學(xué)知識(shí)為我國的醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)做出貢獻(xiàn)[3]。

本研究中,GO富集分析表明高堿養(yǎng)殖條件下,雜交鱘皮膚組織中與胞漿鈣離子濃度調(diào)節(jié)、肌肉收縮、肌鈣蛋白復(fù)合物、連接肌漿網(wǎng)膜、肌球蛋白絲及肌鈣蛋白結(jié)合等相關(guān)差異基因均上調(diào)表達(dá)。研究證實(shí),當(dāng)堿度發(fā)生變化時(shí),單向轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+的ATP酶(Ca2+泵)可為魚類的滲透調(diào)節(jié)提供能量[41]。肌質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)特化的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),其膜上最重要的膜蛋白就是Ca2+的ATP酶,以此發(fā)揮儲(chǔ)存鈣離子的功能[42]。肌細(xì)胞的細(xì)胞膜由于NaHCO3水解后的CO32-與OH-在水中大量聚集,導(dǎo)致細(xì)胞膜的選擇透過性下降甚至喪失,導(dǎo)致鈣離子通道就此打開,大量的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),引起肌肉收縮。也有研究證實(shí),堿性金屬元素(尤其是鈣離子)能夠有效地控制細(xì)胞的滲透性和保護(hù)細(xì)胞膜的完整性,鈣離子通過和細(xì)胞膜磷脂磷酸鹽的結(jié)合,增加細(xì)胞膜上的結(jié)合態(tài)脂質(zhì),降低膜的流動(dòng)性后最終使膜通透性降低[43]。Na2CO3和NaHCO3不僅與堿水環(huán)境中的Na+濃度有協(xié)同作用,導(dǎo)致其產(chǎn)生鹽脅迫,還可以借由自身電離和水解反應(yīng)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生高pH值脅迫[44]。呂富等[10]在研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)堿度到達(dá)10 mmol/L 時(shí),異育銀鯽由于水體的pH值升高,進(jìn)而影響魚的腸道內(nèi)的消化酶的最適pH值,導(dǎo)致消化酶活性降低后,抑制了魚的攝食量,威脅魚的生長。由此推斷,雜交鱘蛋白質(zhì)消化吸收主效途徑下調(diào)表達(dá)也與此有關(guān),但是具體的影響機(jī)制還待進(jìn)一步探討。

氨基酸不僅是蛋白質(zhì)合成的基本原料,還在調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和生理過程中發(fā)揮多種功效[45]。本研究表明在堿脅迫下,雜交鱘氨基酸代謝通路下調(diào)正常表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞的增殖分化、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及機(jī)體的免疫防御都有絲氨酸的參與,且絲氨酸處于調(diào)節(jié)生物體的多個(gè)生物代謝的重要位置[46],它不僅可以代謝為丙酮酸參與三羧酸循環(huán),也可生成甘氨酸[47],而這個(gè)過程是可逆的,甘氨酸在絲氨酸表達(dá)低時(shí),則可以重新合成甘氨酸[48-49]。此外,T 細(xì)胞的增殖也依靠絲氨酸分解代謝的產(chǎn)物,即一碳單位的嘌呤及嘧啶的合成行使生理功能,促進(jìn)機(jī)體的正常的生命活動(dòng)[50],從而影響一些免疫因子的表達(dá)[51]。Rodriguez 等[52]的研究結(jié)果也表明,當(dāng)從頭合成途徑受到阻礙后,絲氨酸來源受阻,導(dǎo)致小鼠巨噬細(xì)胞中的白細(xì)胞介素表達(dá)降低,免疫力明顯降低,存活率顯著下降。甘氨酸又通過脫羧反應(yīng)和甘氨酸脫氨-裂解酶系統(tǒng)被降解為對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)生危害的NH3和CO2,降解產(chǎn)物與環(huán)境中的水反應(yīng),對(duì)魚類產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的傷害[53]。

對(duì)于普通市民來說，這種社會(huì)援助要求常常是像查找不準(zhǔn)時(shí)的列車時(shí)刻表一樣，保證病人按時(shí)趕上火車，找到朋友和親人來照顧虛弱或是正在康復(fù)期的病人，或是為病人安排黃包車或是公交車作為交通工具。例如，有一次需要救護(hù)車護(hù)送一位病人去通州，但是通州超出了醫(yī)院救護(hù)車的行使范圍，我們便租了一輛公共汽車來充當(dāng)救護(hù)車。

3.3 KEGG代謝通路互作網(wǎng)絡(luò)

已有研究表明,物種表型多樣性不是由單個(gè)分子標(biāo)記或者基因決定的,而是由一組基因相互作用形成多種類型的分子網(wǎng)絡(luò)所引起[54]。魚類皮膚作為免疫器官,可通過多種信號(hào)通路及細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)機(jī)體健康[55]。補(bǔ)體作為固有免疫系統(tǒng)的組成成分,可以介導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[56-57],補(bǔ)體系統(tǒng)可以經(jīng)過3條途徑激活,而C3是這3條途徑的中間的重要成分,且補(bǔ)體 C3 的激活是攻膜復(fù)合體形成的必要條件[58],因此,C3被認(rèn)為是補(bǔ)體系統(tǒng)最關(guān)鍵的分子之一。而炎癥是防御免疫的重要表現(xiàn)之一,雜交鱘在鹽堿脅迫下,皮膚作為最大接觸面積的組織,受到的水環(huán)境的刺激也將是最直接的,因此,在皮膚感染炎癥后C3的裂解產(chǎn)物將毛細(xì)血管的通透性增加,使白細(xì)胞大量聚集到該部位[59],在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中顯示C3的下調(diào)表達(dá)意味著雜交鱘在鹽堿脅迫下,機(jī)體受到的刺激十分嚴(yán)重,且預(yù)計(jì)后期難以恢復(fù)。

MAPK(也稱為ERK)通路是一個(gè)高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶系統(tǒng)[60],對(duì)不同刺激的不同響應(yīng),將細(xì)胞膜上的信號(hào)傳遞到細(xì)胞核中,其中包括細(xì)胞增殖、分化、生長、炎癥和應(yīng)激反應(yīng)等生命活動(dòng)[61]。研究發(fā)現(xiàn),MAPK在低溫、干旱、高鹽高滲透和物理損傷的脅迫反應(yīng)應(yīng)答有關(guān)[62]。因此,在持續(xù)的鹽堿環(huán)境中,雜交鱘MAPK通路經(jīng)過被激活,經(jīng)過三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)的形式(MAPKKK→MAPKK→MAPK)傳導(dǎo)信號(hào),然后被其特異性抑制劑抑制表達(dá),從而阻止促炎介質(zhì)的上調(diào),改善雜交鱘的魚體機(jī)能。

從西便門橋向北經(jīng)北二環(huán)到東便門橋，全長16.5 km，中央隔離防撞墩采用特-4型鋼筋混凝土防撞緣石，底寬50 cm，頂寬30 cm，外露40 cm。防撞墩上設(shè)置防眩板，高80 cm，寬10 cm，間距50 cm，通過螺栓直接錨固在防撞緣石上。防眩板兩側(cè)是方形鋼護(hù)欄，高15cm，寬7cm，每隔1.5m通過螺栓固定在防撞緣石上方的立柱，如圖3所示。

3.4 NaHCO3脅迫下對(duì)雜交鱘腎臟、皮膚的結(jié)構(gòu)變化

魚類在鹽堿水環(huán)境中為了避免滲透壓的失衡,能量的過度消耗和免疫功能的變化需要不斷地改變自身的生理狀態(tài)來維持魚體環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[63-64]。魚類皮膚和鰓作為魚類黏膜層的重要組成部分,黑龍江水產(chǎn)研究所魚類繁殖生理實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果顯示,雜交鱘的鰓在碳酸氫鈉脅迫下鰓小片發(fā)生卷曲、融合、鰓上皮細(xì)胞細(xì)胞出現(xiàn)增生和膨大,已經(jīng)影響到雜交鱘的滲透調(diào)節(jié)和呼吸功能;在碳酸氫鈉脅迫下,雜交鱘的皮膚發(fā)生了肉眼可見的損傷。Hellio等[65]和Fast等[66]研究已證實(shí),黏液細(xì)胞分泌的黏液具有一些酶的活性,糖蛋白、免疫球蛋白以及一些抗細(xì)菌、真菌成分等。雜交鱘的黏液細(xì)胞數(shù)量隨堿度的升高逐漸增多,表明其在應(yīng)對(duì)鹽堿環(huán)境時(shí)皮膚會(huì)分泌大量的黏液細(xì)胞至體表,形成其免疫防護(hù)的第一道屏障。

腎臟作為魚類主要的滲透調(diào)節(jié)器官之一,在機(jī)體處于非等滲環(huán)境中,腎臟可以通過改變形態(tài)結(jié)構(gòu)[67]、離子通道[68]以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[69]和激素分泌水平[70]等來調(diào)整體內(nèi)外滲透壓的動(dòng)態(tài)平衡。在碳酸鹽脅迫下,雜交鱘通過腎臟對(duì)水環(huán)境的吸收以及尿液的重吸收來緩解因吞咽高滲水溶液造成的魚體失水。在T2和T3組中可以明顯看出,在非等滲環(huán)境中雜交鱘腎臟的過度損傷,腎小球管腔變窄,血流發(fā)生障礙,導(dǎo)致有效的血液循環(huán)受阻,腎小球的過濾能力下降。腎臟作為雜交鱘主要的免疫器官,在鹽堿水環(huán)境中減緩魚體損傷發(fā)揮著十分重要的作用,Tong等[71]對(duì)鹽堿環(huán)境中的青海湖裸鯉的腎臟和鰓進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了大量的免疫相關(guān)的候選基因也驗(yàn)證了這一結(jié)果。