王中海

（ 甘肅省和政縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，甘肅 臨夏 731200 ）

免疫膠體金技術(shù)是一種以膠體金為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體的新型免疫標(biāo)記技術(shù)[1]，可對(duì)血清及尿液進(jìn)行檢測(cè)，且檢測(cè)時(shí)間很短，通常只需5～10 min即可完成檢測(cè)。免疫膠體金技術(shù)作為臨床中常見的一種標(biāo)記技術(shù)，近年來逐漸發(fā)展成熟，并在多個(gè)領(lǐng)域得到了應(yīng)用，獸醫(yī)臨床也開始廣泛使用免疫膠體金技術(shù)診斷多種疾病。目前，膠體金免疫層析技術(shù)和斑點(diǎn)金免疫滲濾法是免疫膠體金技術(shù)最常見的兩種應(yīng)用類型。本文總結(jié)了免疫膠體金技術(shù)的應(yīng)用類型，探究其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，闡述其在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為免疫膠體金技術(shù)在獸醫(yī)臨床中更加廣泛的應(yīng)用與研究提供參考。

1 免疫膠體金技術(shù)的應(yīng)用類型

1.1 電鏡標(biāo)記技術(shù)

1962年，有研究首次提出使用膠體金作為一種電鏡示蹤標(biāo)志物，其具有的球形外觀和高電子密度能夠在圖像中得到較為清晰的顯示，可輕松地分辨膠體金和抗原。膠體金顆粒大小直徑在3～150 mm，根據(jù)使用者采取的制備方式，最終得到的膠體金顆粒大小也會(huì)有所不同[2]。電鏡標(biāo)記技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和定位精確等特點(diǎn)，還可對(duì)抗原進(jìn)行定量、定性、定位的分析與觀察。應(yīng)用ICG 雙重或多重標(biāo)記法，可將形態(tài)、功能和結(jié)構(gòu)的研究融為一體，有助于了解同一組織或細(xì)胞內(nèi)不同分子的相互關(guān)系及其合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)等代謝過程。通過膠體金免疫電鏡觀察，單個(gè)和個(gè)別堆集的病毒顆粒周圍有許多金顆粒附著，金顆粒出現(xiàn)強(qiáng)烈反差，因此，觀察時(shí)找到金顆粒聚集的地方即可找到病毒顆粒，表明該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏直觀等特點(diǎn)，大大提高了檢測(cè)效果[3]。

1.2 膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)是近年來臨床中廣泛應(yīng)用于診斷多種疾病的新技術(shù)，該技術(shù)同樣使用膠體金為示蹤物，其中最常用的是免疫膠體金層析試紙條（ICTSs）[4-6]。膠體金免疫層析技術(shù)作用原理是通過硝酸纖維素膜上毛細(xì)管的作用，樣品滴入后隨著硝酸纖維素膜上移，定位在纖維素膜上的受體與待測(cè)樣品結(jié)合，產(chǎn)生特異性反應(yīng)；抗原和抗體的復(fù)合物不斷積累，膠體金的標(biāo)志物通過沉淀顯示出顏色，以此實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的。膠體金免疫層析技術(shù)最初應(yīng)用于檢測(cè)人絨毛膜促進(jìn)性腺激素（HCG），隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)進(jìn)步，近年來該技術(shù)的應(yīng)用范圍越來越廣。膠體金免疫層析技術(shù)具有快捷迅速、安全簡(jiǎn)便、靈敏準(zhǔn)確、成本低廉的優(yōu)勢(shì)，但由于免疫層析是肉眼水平的免疫檢測(cè)，因此只能提供定性結(jié)果；其次，檢測(cè)的準(zhǔn)確度受到抗體質(zhì)量影響較大。

1.3 斑點(diǎn)金免疫滲濾法

斑點(diǎn)金免疫滲濾法又稱滴金免疫測(cè)定法，該方式將膠體金作為標(biāo)志物，能夠在不對(duì)樣品的蛋白質(zhì)生物活性造成影響的前提下開展測(cè)試，具備良好的穩(wěn)定性。與免疫層析法相比，兩者具備相似的作用原理，但斑點(diǎn)金免疫滲濾法的過濾方式是液體過濾，過濾過程更順暢，檢測(cè)效率也更高。斑點(diǎn)金免疫滲濾法不受環(huán)境溫度影響，檢測(cè)時(shí)間短，省去了酶標(biāo)底物反應(yīng)過程，但滲濾裝置復(fù)雜、成本較高。

1.4 液相免疫測(cè)定

通過結(jié)合膠體金與抗體建立微量凝集試驗(yàn)檢測(cè)相應(yīng)的抗原，肉眼可直接觀察到凝集顆粒。利用免疫學(xué)反應(yīng)時(shí)金顆粒凝聚導(dǎo)致顏色減退的原理建立的均相溶膠顆粒免疫測(cè)定法（sol particle immunoassay，SPIA）已成功應(yīng)用于檢測(cè)PCG，直接應(yīng)用分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析[7-9]。液相免疫測(cè)定不僅用于分離簡(jiǎn)單化合物，還用于從細(xì)胞混合物中分離特定蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合，剩余的溶液通過柱子，然后使用另一種溶液釋放蛋白質(zhì)并收集。這需要高度熟練的技術(shù)人員隨時(shí)監(jiān)控色譜柱并確保該過程完全按計(jì)劃運(yùn)行，才能保障檢驗(yàn)的順利進(jìn)行。

1.5 金標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)

膠體金可明顯改變紅色激光的散射角。有研究利用膠體金標(biāo)記的羊抗鼠Ig 抗體應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)分析不同類型細(xì)胞的表面抗原；結(jié)果顯示，膠體金標(biāo)記的細(xì)胞在波長(zhǎng)632 nm下，90度散射角可放大10倍以上，而且不影響細(xì)胞活性，與熒光素共同標(biāo)記時(shí)彼此互不干擾[10]。流式細(xì)胞術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于擁有強(qiáng)大的分選功能，能夠在分析的同時(shí)分選特定群體，還可對(duì)多種類樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)速度快、樣本多。但其檢測(cè)的樣品必須為單細(xì)胞懸液，限制較大。

2 免疫膠體金技術(shù)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

免疫膠體金技術(shù)的操作十分簡(jiǎn)單，只需要通過專門的試劑盒或試劑條即可進(jìn)行樣品的檢測(cè)，不要借助其他儀器及設(shè)備、試劑等，大大縮短了檢測(cè)的時(shí)間和流程。其次對(duì)于樣品的要求不高，通常只需在檢測(cè)前對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單處理，甚至不需要處理即可進(jìn)行檢測(cè)。能夠應(yīng)用于檢測(cè)的樣品也十分多樣，除了常見的血清外，還可使用組織液、糞便、尿液等進(jìn)行檢測(cè)，極大地方便了樣品檢測(cè)，促進(jìn)檢測(cè)流程的簡(jiǎn)單化。常規(guī)檢測(cè)診斷技術(shù)需要經(jīng)過復(fù)雜儀器的種種檢驗(yàn)，且檢測(cè)過程需花費(fèi)數(shù)小時(shí)，而免疫膠體金技術(shù)十分方便快捷，只需5～10 min 即可得到結(jié)果。與其相似的ELISA技術(shù)相比，同樣是選用試劑盒或試劑條的形式進(jìn)行檢測(cè)，ELISA 診斷得到結(jié)果需要1～2 h，PCR 所需時(shí)間更長(zhǎng)，由此可見，免疫膠體金技術(shù)的診斷效率更高[11]。同時(shí)免疫膠體金技術(shù)對(duì)于檢測(cè)環(huán)境的要求不高，能夠在日常生活環(huán)境中使用，受到場(chǎng)地限制較小。方便快捷的同時(shí)又能夠保障靈敏度。成本低也是免疫膠體金技術(shù)的另一項(xiàng)顯著優(yōu)勢(shì)，一方面本身的試劑盒或試劑條較為實(shí)惠，另一方面是因?yàn)槟z體金技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果十分顯著，通常檢測(cè)者只需要通過肉眼觀察就能夠直觀地看到檢測(cè)結(jié)果，而不需要借助顯微鏡以及一些特殊設(shè)備，縮小檢測(cè)者的使用成本。免疫膠體金技術(shù)具有明顯的特異性，在不同的檢測(cè)條件下仍然能夠保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。其次在檢測(cè)的過程中能夠同時(shí)對(duì)各個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行檢測(cè)，有利于提升樣品的使用率，減少檢測(cè)過程中的浪費(fèi)。

3 免疫膠體金技術(shù)在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用

3.1 免疫膠體金技術(shù)在病毒病診斷中的應(yīng)用

免疫膠體金技術(shù)在獸醫(yī)臨床中得到廣泛應(yīng)用，其中對(duì)于各種疾病的診斷具有良好效果。在對(duì)病毒病的診斷中，李華斌[12]選擇單抗3A4為金標(biāo)抗體，單抗4F11作為檢測(cè)線抗體，羊抗鼠二抗為質(zhì)檢抗體，制備了貓杯狀病毒（FCV）抗原檢測(cè)膠體金試紙條。組裝的試紙條對(duì)3種常見的貓病毒FCV及其他3種常見的貓病毒：貓細(xì)小病毒毒株（FPV）、貓皰疹病毒毒株（FHV）及貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）進(jìn)行檢測(cè),顯示特異性良好，無交叉反應(yīng)；與RT-PCR 方法同時(shí)對(duì)94 份貓鼻咽拭子進(jìn)行檢測(cè)，符合率在90%以上。楊曉童[13]分離了7 株新型鵝星狀病毒，制備了抗新型鵝星狀病毒的單克隆抗體和多克隆抗體，并建立了針對(duì)新型鵝星狀病毒的膠體金層析檢測(cè)方法。該方法最低檢出病毒量為1.2 mg/L，除新型鵝星狀病毒檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性外,常見禽源病原DAst V、GPV、H9-AIV、FAd V-4、DHAV-3 和TMUV 等檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，無交叉反應(yīng)；使用不同批次的試紙條均能夠檢出病毒，且與PCR 方法的符合率為92.5%。此外，在25 ℃室溫條件下該試紙條可穩(wěn)定保存3 個(gè)月，4 ℃條件下可穩(wěn)定保存5 個(gè)月，提示ICTSs 的穩(wěn)定性較優(yōu)。李書劍[14]制備的ICTSs能夠準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速地檢測(cè)C 型逆轉(zhuǎn)錄病毒禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒抗原，5～15 min 即可得到結(jié)果，不需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)，適用于基層獸醫(yī)部門等不同單位對(duì)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒的快速檢測(cè)，且成本低廉，經(jīng)濟(jì)效益良好。2018年，非洲豬瘟首次在我國(guó)發(fā)生，隨后各地陸續(xù)出現(xiàn)疫情，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成一定影響。該病的蔓延也對(duì)獸醫(yī)臨床診斷技術(shù)提出了新的要求，ICTSs 特異性、敏感性和穩(wěn)定性良好，也成為臨床診斷非洲豬瘟的一種方法[15]。崔鶴馨等[16]在探究梅花鹿黏膜病病毒的快速檢驗(yàn)方式中，嘗試研發(fā)免疫膠體金試紙條，最終結(jié)果顯示免疫膠體金技術(shù)的檢測(cè)效率高，對(duì)黏膜病病毒實(shí)現(xiàn)了有效鑒別，能夠達(dá)到快速檢測(cè)的效果。由此可見，免疫膠體金技術(shù)能夠?yàn)樾笄莶《拘约膊√峁┯行У脑\斷技術(shù)，實(shí)現(xiàn)臨床的快速診斷。

3.2 免疫膠體金技術(shù)在細(xì)菌病診斷中的應(yīng)用

有報(bào)道總結(jié)，免疫膠體金技術(shù)可臨床診斷布魯氏菌、牛分枝桿菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、鴨疫里默桿菌、鰻弧菌、出血性大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌、副雞禽桿菌、空腸彎曲菌、炭疽桿菌、李斯特菌、土拉熱弗朗西斯菌、破傷風(fēng)桿菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌等多種細(xì)菌病[17]。韓文龍[18]研制了鴨疫里默氏桿菌OmpA單克隆抗體和免疫膠體金檢測(cè)試紙條，研制的試紙條可用于細(xì)菌培養(yǎng)物中鴨疫里默氏桿菌的檢測(cè)和鴨疫里默氏桿菌感染病鴨的臨床快速診斷，而且使用試紙條檢測(cè)感染鴨心臟組織樣品的檢出率高于組織樣品細(xì)菌分離鑒定的結(jié)果。王海麗等[19]在豬種布魯氏菌S2 株外膜蛋白OMP25 表達(dá)純化的基礎(chǔ)上，對(duì)金黃色葡萄球菌蛋白A進(jìn)行膠體金標(biāo)記，并噴涂于玻璃纖維上，制備了布魯氏菌抗體檢測(cè)膠體金免疫層析試紙條。該試紙條對(duì)羊布魯氏菌病陽(yáng)性血清具有高度特異性，靈敏度與ELISA相當(dāng)，在4 ℃條件下可保存9個(gè)月，室溫條件下可保存6 個(gè)月。楊松鑫等[20]基于Tris 輔助法制備均勻度好、穩(wěn)定性強(qiáng)的膠體金，優(yōu)化試紙條的最適pH 值、蛋白量和重懸比，建立的沙門氏菌膠體金免疫層析試紙條敏感性高、特異性好、重復(fù)性好，各方面性能均達(dá)到臨床快速檢測(cè)要求。陳詩(shī)勝[21]開發(fā)了檢測(cè)奶牛乳房炎主要致病菌的PCR核酸免疫層析試紙條，不需要進(jìn)行核酸擴(kuò)增后的凝膠電泳復(fù)雜操作環(huán)節(jié)，檢測(cè)方法更加安全、簡(jiǎn)單、快速、便捷、廉價(jià)，可作為替代核酸凝膠電泳的新方法。

3.3 免疫膠體金技術(shù)在寄生蟲病診斷中的應(yīng)用

寄生蟲病作為動(dòng)物疫病的主要病癥之一，不僅會(huì)對(duì)動(dòng)物的生活及生命安全造成影響，也可能會(huì)傳染人，因此必須注重對(duì)動(dòng)物寄生蟲病的診斷，及時(shí)遏制傳染趨勢(shì)?？芙鹑A等[22]制備1種檢測(cè)豬弓形蟲血清循環(huán)抗原的免疫膠體金試紙條，試驗(yàn)利用檸檬酸三鈉還原法制備40 nm的膠體金溶液，標(biāo)記抗弓形蟲表面抗原SAG3單克隆抗體（Anti-ASAG3-7），用另1 株抗弓形蟲表面抗原SAG3 單克隆抗體（Anti-A-SAG3-23）與羊抗小鼠IgG抗體分別包被檢測(cè)線和質(zhì)控線，制備并優(yōu)化免疫膠體金試紙條檢測(cè)條件。試紙條的靈敏度達(dá)1∶160，與豬囊蟲陽(yáng)性血清無交叉反應(yīng)，置于室溫至少可保存1個(gè)月有效，置于4 ℃可保存3個(gè)月有效。對(duì)廣東某地區(qū)、吉林某地區(qū)豬場(chǎng)的各94份豬待檢血清進(jìn)行檢測(cè),樣品陽(yáng)性率為18.08%、10.63%。趙阿普[23]在對(duì)豬旋毛蟲病的診斷中同樣應(yīng)用了免疫膠體金技術(shù)，研究結(jié)果顯示，與常規(guī)檢測(cè)方式相比，免疫膠體金的檢驗(yàn)準(zhǔn)確度高且成本低廉、易操作。邰利鑫[24]選用實(shí)驗(yàn)室制備保存的微小隱孢子蟲病毒單克隆抗體作為捕獲抗體，制備兔抗微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，制作檢測(cè)牛糞便樣品中是否存在微小隱孢子蟲感染的膠體金試紙條，并與雙抗夾心ELISA、Dot-ELISA 檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比分析，為牛微小隱孢子蟲的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供參考。金程佳[25]將DLC2蛋白對(duì)檢測(cè)線進(jìn)行劃線，以SPA 為標(biāo)志物進(jìn)行偶聯(lián)膠體金，質(zhì)控線以1 mg/mL 雞抗SPA 二抗進(jìn)行劃線，建立華支睪吸蟲病膠體金免疫層析法。該方法與日本血吸蟲、肝片吸蟲、日本棘隙吸蟲陽(yáng)性血清均不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性較好，可用于臨床樣本的快速診斷。試驗(yàn)還采用該方法對(duì)臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示寵物醫(yī)院樣本中陽(yáng)性率為2.1%，流浪犬陽(yáng)性率為5.6%，也為當(dāng)?shù)厝A支睪吸蟲感染情況提供了數(shù)據(jù)資料。

3.4 免疫膠體金技術(shù)在獸醫(yī)其他領(lǐng)域中的應(yīng)用

除了對(duì)疾病的檢測(cè)外，膠體金層析技術(shù)在食源性致病菌如大腸埃希氏菌O157、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌等方面也有大量應(yīng)用研究[26]，還可檢測(cè)乳中是否存在雌二醇[27]、環(huán)丙沙星等[28]的殘留。隨著飼料工業(yè)不斷發(fā)展，免疫膠體金技術(shù)也開始應(yīng)用于飼料中霉菌毒素（如黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮等）的檢測(cè)[29-32]。

4 結(jié)論

免疫膠體金技術(shù)作為一項(xiàng)發(fā)展成熟的檢疫技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、方便快捷、成本低、特異性強(qiáng)等多種優(yōu)勢(shì)，因此在各個(gè)領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。將免疫膠體金技術(shù)應(yīng)用于獸醫(yī)臨床及畜牧生產(chǎn)中能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)病原的快速診斷及目標(biāo)物質(zhì)的快速檢出，從而推動(dòng)我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。