傅 星，楊振春，孫 麗

（江蘇省宿遷市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 宿遷 223800）

復(fù)方氯化鈉滴眼液是一種以氯化鈉、氯化鉀等為主要成分的多劑量眼用制劑，適用于干眼癥，眼睛疲勞等。2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0105 眼用制劑規(guī)定［1］，多劑量眼用制劑一般可加適當(dāng)抑菌劑以抑制微生物的滋生［2-5］。羥苯乙酯為尼泊金類(lèi)抑菌劑，抑菌效果良好，廣泛用于多種眼用制劑中［6-8］，但過(guò)量使用會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)及類(lèi)激素作用［9］。2015年版《中國(guó)藥典（四部）》收載現(xiàn)行抑菌效力檢查法［10］，而市售復(fù)方氯化鈉滴眼液大部分首次獲批于此前，尚缺乏相關(guān)抑菌效力評(píng)價(jià)?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)并未對(duì)復(fù)方氯化鈉滴眼液中抑菌劑的添加量有明確要求，且無(wú)相應(yīng)的檢驗(yàn)方法，各生產(chǎn)企業(yè)的抑制劑添加量標(biāo)準(zhǔn)均不相同。從安全性考慮，有必要對(duì)該制劑進(jìn)行定量檢測(cè)［11-12］及抑菌效力測(cè)定［13-15］，以評(píng)估抑菌劑的添加是否合理、有效。為此，本研究中建立了測(cè)定產(chǎn)品中羥苯乙酯含量的高效液相色譜法，并評(píng)價(jià)其抑菌效力?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥、培養(yǎng)基與菌株

1.1 儀器

安捷倫1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；XS105DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；KH5200 型超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；IPP260型低溫培養(yǎng)箱（德國(guó)Memmert公司）。

1.2 試藥

復(fù)方氯化鈉滴眼液（A 公司，批號(hào)分別為2008041，2008281，2102231，2104081，2106161，2103071；B 公司，批號(hào)分別為210909，210606；C 公司，批號(hào)為21091401；規(guī)格均為每瓶10 mL）；羥苯乙酯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100847-202105，含量為100.0%）；羥丙甲纖維素（Ⅰ型，黏度為100 mPa·s）；乙腈、磷酸二氫銨、氯化鈉均為色譜純，氯化鉀為分析純，水為超純水。

1.3 培養(yǎng)基

pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉- 蛋白胨培養(yǎng)基，胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養(yǎng)基，胰酪大豆胨肉體（TSB）培養(yǎng)基，沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養(yǎng)基，沙氏葡萄糖肉體（SDB）培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司，均已進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003，銅綠假單胞菌CMCC（B）10104，大腸埃希菌CMCC（B）44102，白色念珠菌CMCC（F）98001，黑曲霉CMCC（F）98003，均由中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC）提供，用于菌液制備的工作菌株均為第3代。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/ L 磷酸二氫銨溶液（氨水調(diào)pH 至5.0）-乙腈（60∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：256 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

取羥苯乙酯對(duì)照品10.58 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL容量瓶中，加2 mL乙腈溶解，加流動(dòng)相定容，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液，備用。精密量取樣品2 mL，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，作為供試品溶液。按2020年版《中國(guó)藥典（四部）》復(fù)方氯化鈉滴眼液項(xiàng)下處方工藝（除抑菌劑）配制，取氯化鈉0.9 g、氯化鉀0.014 g、碳酸氫鈉0.02 g，精密稱(chēng)定，以及羥丙甲纖維素適量（視終溶液黏度調(diào)整），加注射用水至100 mL，制成空白對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，輔料及主藥均不干擾抑菌劑羥苯乙酯的測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.EthylparabenA.Reference solution B-D.Test solution（Lot No.：2008041，210909，21091401） E.Blank reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線(xiàn)性關(guān)系考察：精密量取2.2項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)貯備液，加流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度分別為3.31，6.61，13.23，26.45，52.90，105.80 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程Y=56.798X-5.799 1（r=1，n= 6）。結(jié)果表明，羥苯乙酯質(zhì)量濃度在3.31～105.80 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

檢測(cè)限和定量限確定：取2.2 項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)貯備液，加流動(dòng)相逐級(jí)稀釋?zhuān)?.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各質(zhì)量濃度下對(duì)照品峰的信噪比（S/N）。以S/N為3∶1和10∶1 時(shí)的質(zhì)量濃度作為檢測(cè)限和定量限. 結(jié)果羥苯乙酯的檢測(cè)限為0.08 μg/mL，定量限為0.15 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：精密量取樣品（批號(hào)為2008041）適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果羥苯乙酯峰面積的RSD為0.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取精密度試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果羥苯乙酯峰面積的RSD為1.50%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取精密度試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫放置0，4，8，12，16，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果羥苯乙酯峰面積的RSD為0.61%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品（批號(hào)2008041）1.0 mL，共9 份，置10 mL 容量瓶中，分別加入標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.25，0.40，0.50 mL，加流動(dòng)相定容，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果平均加樣回收率為99.81%，RSD為1.42%（n=9）。

耐用性試驗(yàn)：分別改變柱溫（25～35 ℃）、流速（0.8～1.2 mL/ min）、檢測(cè)波長(zhǎng)（251～261 nm）、流動(dòng)相pH 值（4.8～5.2）和色譜柱［Zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），Ultimate LP-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）］，其他條件不變，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果測(cè)定結(jié)果不受影響，表明方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測(cè)定

分別取9 批樣品各適量，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定3次，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品中羥苯乙酯含量測(cè)定結(jié)果（mg/mL，n=3）Tab.1 Results of the content determination of ethylparaben in samples（mg/mL，n=3）

2.5 抑菌效力測(cè)定

2.5.1 菌液制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物接種于TSB培養(yǎng)基中，取白色念珠菌和黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至SDB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h 后，用pH 7.0 的無(wú)菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液逐級(jí)稀釋至10-7，分別用TSA 培養(yǎng)基和SDA 培養(yǎng)基計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將原菌液配制成含菌107～108cfu/mL 的菌懸液，備用。

2.5.2 抑菌效力測(cè)定

取企業(yè)A、企業(yè)B、企業(yè)C的復(fù)方氯化鈉滴眼液各5瓶，分別加入上述5種菌液0.1 mL，使每瓶滴眼液中含菌量為105～106cfu/ mL，20 ℃避光貯存，分別于6，24 h 及7，14，28 d 取樣，稀釋法計(jì)數(shù)，換算成lg 值，并與接種菌數(shù)lg值比較差值。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中羥苯乙酯抑菌效力測(cè)定結(jié)果Tab.2 Evaluation results of the bacteriostatic efficacy of ethylparaben in samples

3 討論

由表1可知，各批號(hào)的復(fù)方氯化鈉滴眼液中羥苯乙酯的含量均未超過(guò)相應(yīng)標(biāo)示量，各生產(chǎn)企業(yè)較好地控制了制劑中羥苯乙酯的含量。

通過(guò)對(duì)3 家企業(yè)生產(chǎn)的復(fù)方氯化鈉滴眼液進(jìn)行抑菌效力評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)制劑中添加的羥苯乙酯的抑菌效力都不能完全達(dá)到2020年版《中國(guó)藥典（四部）》所規(guī)定的抑菌效力的要求；從抑菌效力的結(jié)果來(lái)看，制劑的抑菌效力是隨著羥苯乙酯的添加量而增強(qiáng)的。提示生產(chǎn)企業(yè)在合理范圍內(nèi)可適當(dāng)增加羥苯乙酯的添加量而保障制劑的抑菌效果。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于復(fù)方氯化鈉滴眼液中抑菌劑的種類(lèi)及添加量均無(wú)明確要求。眼用制劑中的常用抑菌劑有羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯扎氯銨、苯扎溴銨、硫柳汞等，市售復(fù)方氯化鈉滴眼液中的抑菌劑均為羥苯乙酯，且不同的生產(chǎn)企業(yè)的添加量有較大差異，但各滴眼液的抑菌效力均不符合2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1121 抑菌效力檢查法的要求。

羥苯乙酯對(duì)眼刺激性較大，美國(guó)食品和藥物管理局并未推薦其在眼用制劑中使用，在口服和皮膚制劑的最大用量為0.05%［16］。相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)重新對(duì)復(fù)方氯化鈉滴眼液中所用抑菌劑種類(lèi)及添加量進(jìn)行篩選和評(píng)估。