陸 芳，王 衛(wèi)

（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070）

氯霉素醋酸曲安奈德搽劑為《天津市醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》2016 年版收載品種，處方中含有氯霉素、醋酸曲安奈德、薄荷腦、苯酚、甘油和60%乙醇。有止癢、消炎、抗過敏、抗感染作用，用于各種皮炎、瘙癢癥與蟲咬癥等?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅以容量法對氯霉素做了含量測定控制，尚無醋酸曲安奈德的含量測定方法，為控制制劑質(zhì)量，保證用藥安全有效，現(xiàn)建立HPLC法同時測定氯霉素和醋酸曲安奈德兩成分的含量。修訂后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性及重現(xiàn)性好，可用于日常質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Waters e2695 高效液相色譜儀（美國沃特斯公司），Empower 色譜工作站；XSE 205DU 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限責(zé)任公司）。氯霉素對照品（批號130303-202115）由中國藥品生物制品檢定所提供，醋酸曲安奈德對照品（批號100125-202007）由中國藥品生物制品檢定所提供，氯霉素原料（批號009180512）由東北制藥集團(tuán)生產(chǎn)提供，醋酸曲安奈德原料（批號NTAC200501）由天津天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)提供，氯霉素醋酸曲安奈德搽劑樣品（批號20211110、20211220、20220906，規(guī)格為每1 ml 含氯霉素5 mg、醋酸曲安奈德0.25 mg）及空白輔料溶液均為天津市第一中心醫(yī)院生產(chǎn)。甲醇為色譜純（默克股份兩合公司生產(chǎn)），庚烷磺酸鈉為色譜純（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司生產(chǎn)），水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相A：取30 g 庚烷磺酸鈉加30%甲醇溶解并稀釋至1 000 ml，流動相B：甲醇，梯度洗脫（洗脫程序見表1）；檢測波長為240 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

表1 洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取醋酸曲安奈德對照品25 mg，置10 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 ml，置10 ml 量瓶中，同時精密稱取氯霉素對照品50 mg 加入同一量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品直接進(jìn)樣。

2.2.3 空白溶液的制備 按處方配比，制備不含氯霉素和醋酸曲安奈德的空白溶液。

2.3 空白干擾試驗(yàn) 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及空白溶液各20 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果空白溶液在兩主峰對應(yīng)的保留時間處無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）供試品（B）空白（C）HPLC 色譜圖

2.4 線性關(guān)系考查 精密稱定氯霉素適量，加甲醇制成1、2、4、5、6 和10 mg/ml 的溶液；另精密稱定醋酸曲安奈德適量，加甲醇制成0.05、0.1、0.2、0.25、0.3 和0.5 mg/ml 的溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件試驗(yàn)，記錄色譜圖；以濃度為橫坐標(biāo)（C），以相對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（A），進(jìn)行線性回歸。 結(jié)果表明，氯霉素在0.989 5～9.895 0 mg/ml 的濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線性關(guān)系（r=0.999 5，n=6），其線性方程為Y=1×107X+106；醋酸曲安奈德在0.051 3～0.513 0 mg/ml 的濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線性關(guān)系（r=0.999 5，n=6），其線性方程為Y=4×107X -11 216。

2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密量取本品和輔料各5 ml，進(jìn)行專屬性試驗(yàn)。①酸破壞：加1 mol/L 的鹽酸溶液2 ml，放置30 min，用1 mol/L 氫氧化鈉溶液液調(diào)至pH 為中性。②堿破壞：加1 mol/L 的氫氧化鈉溶液2 ml，放置30 min，用1 mol/L 鹽酸溶液液調(diào)至pH為中性。③氧化破壞：加30%過氧化氫溶液2 ml，放置30 min。④高溫破壞：80 ℃加熱30 min，放冷。⑤光照破壞：自然光照5 d。分別取上述5 種溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果表明在上述5 種苛刻試驗(yàn)條件下，均有不同程度的降解，但降解的雜質(zhì)均能與主峰達(dá)到完全的分離，不影響主峰的測定。見圖2 和圖3。

圖2 輔料未破壞（A）輔料酸、堿、加熱破壞（B）輔料氧化破壞（C）HPLC 色譜圖

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 系統(tǒng)精密度 分別選取對照品溶液和供試品溶液（1#樣品），各重復(fù)進(jìn)樣6 次，對照品溶液峰面積RSD 為1.18%（氯霉素）和1.29%（醋酸曲安奈德），供試品溶液峰面積RSD 為0.06%（氯霉素）和0.09%（醋酸曲安奈德）。

2.6.2 方法精密度 取1 批樣品（2# 樣品），分別取6份供試品，按上述測定方法進(jìn)樣，RSD 分別為0.29%和0.20%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對照品溶液在室溫下放置48 h，照上述方法測定，結(jié)果表明對照品溶液兩主峰面積相對平均偏差分別為1.6%（氯霉素）和1.5%（醋酸曲安奈德），本溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

圖3 樣品未破壞（A）酸破壞（B）堿破壞（C）氧化破壞（D）高溫破壞（E）光照破壞（F）HPLC 色譜圖

2.8 回收率試驗(yàn) 按照處方，精密稱定氯霉素原料約2.5 g，3 份，置25 ml 量瓶中，加空白輔料溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密稱定醋酸曲安奈德原料約0.25 g，3 份，置50 ml 量瓶中，加空白輔料溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取兩液各1 ml（3 份）、1 m（l3 份）、3 m（l3 份）置25 m（l3 份）、20 m（l3 份）、50 m（l3 份）量瓶中，加空白輔料溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制得到氯霉素和醋酸曲安奈德為80%、100%、120%的溶液9 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件試驗(yàn)，記錄色譜圖；計算平均回收率。結(jié)果氯霉素的平均回收率為97.60%，RSD 為0.45%；醋酸曲安奈德平均回收率為101.20%，RSD 為0.59%。表明在該方法的測定條件下，氯霉素和醋酸曲安奈德回收率均良好，輔料均無干擾。見表2 和表3。

表2 氯霉素回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 醋酸曲安奈德回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測定 取3 批樣品（批號分別為20211110、20211220、20220906），分別按照“2.1”項(xiàng)下方法測定，結(jié)果見表4。

2.10 粗放度試驗(yàn) 采用不同的儀器和改變色譜柱測定含量，進(jìn)行粗放度考核，具體色譜條件如下：儀器：安捷倫1200，色譜條件同Waters e2695。色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），其他條件同“2.1”項(xiàng)下。經(jīng)試驗(yàn)，3 批樣品的含量測定結(jié)果與“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)方法得到的結(jié)果基本一致，見表5。

表4 3 批樣品含量測定結(jié)果

表5 粗放度試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 波長的選擇 分別取醋酸曲安奈德及氯霉素對照品溶液在200～400 nm 處進(jìn)行紫外光譜掃描檢測顯示，醋酸曲安奈德在240 nm 處有最大吸收，氯霉素在240 nm 處也有吸收，但最大吸收是277 nm。處方中氯霉素是醋酸曲安奈德的20 倍，醋酸曲安奈德的量較少，故選擇240 nm 波長作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)［1］采用甲醇-水（60∶40）作為流動相時，樣品中苯酚色譜峰與氯霉素峰分離不完全，且出峰時間較早，不斷更換流動相［2-6］探索時發(fā)現(xiàn)，流動相中加入0.15 mol/L 的庚烷磺酸鈉時使苯酚、氯霉素和醋酸曲安奈德峰均后移，且實(shí)現(xiàn)了氯霉素與苯酚的分離，但醋酸曲安奈德出峰時間為60 min以后，故改為0.15 mol/L 的庚烷磺酸鈉的30%甲醇和甲醇的梯度洗脫，最終實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)保留時間適中，色譜分離情況較好。