任紅岳,侯文蓉,楊曉帆,張 輝,張春斌,3

(1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部/基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部科研平臺(tái),福建 漳州 363000;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007;3.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系/轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)檢測(cè)應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,福建 漳州 363000)

膽管癌是起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤[1]。我國(guó)是膽管癌的第2高發(fā)區(qū),其發(fā)生率在(2.5～5.6)/10萬(wàn)人,處于消化道腫瘤中第5位,且逐年上升[2]。根據(jù)解剖位置可以將膽管癌分為肝內(nèi)、肝外和遠(yuǎn)端膽管癌。膽管癌是一類異質(zhì)性極高的腫瘤,不同的解剖位置,其致病機(jī)制、腫瘤細(xì)胞的起源和基因組學(xué)都存在較大的差異。這些異質(zhì)性給膽管癌的診斷和治療帶來(lái)的極大的困難[3]。雖然手術(shù)治療是膽管癌公認(rèn)的根治手段,但是由于膽管癌解剖位置特殊,起病隱匿,缺乏早期癥狀,大多數(shù)患者確診時(shí)已到晚期,無(wú)法接受手術(shù)治療,導(dǎo)致膽管癌治療很大程度依賴于藥物化療,然而膽管癌對(duì)現(xiàn)有化療藥物不敏感,且極易產(chǎn)生抗藥性,5 年存活率極低[4]。因此,尋找有效的抗膽管癌藥物就變得十分必要且急迫。

厚樸酚是從中草藥厚樸中發(fā)現(xiàn)的一種主要活性成分,不僅具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗寄生蟲(chóng)的效果,在腫瘤治療方面也有明顯的生物學(xué)作用[5]。有文獻(xiàn)表明,厚樸酚對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有抑制作用,包括乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、鼻咽癌和膽管癌等[6]。本研究表明,厚樸酚與膽管癌關(guān)系密切,其可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-kB 炎癥信號(hào)通路影響膽管癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,特別是在膽管癌的生長(zhǎng)、遷移和侵襲方面,厚樸酚發(fā)揮了明顯的抑制作用[7],提示厚樸酚是治療膽管癌的潛在藥物,但仍需進(jìn)一步探討兩者的具體作用機(jī)制。基于以上科學(xué)問(wèn)題及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),本研究擬以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法為切入點(diǎn),探索厚樸酚治療膽管癌的具體作用靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 厚樸酚成分靶點(diǎn)及膽管癌相關(guān)靶基因篩選

以“Magnolol”為關(guān)鍵詞,在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、STITCH(http://stitch.embl.de/)、Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索并篩選與厚樸酚成分相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn),最后將上述 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)合并,同時(shí)刪除重復(fù)靶點(diǎn)。

1.2 膽管癌相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

以“Cholangiocarcinoma”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索,在GeneCards(https://www.genecards.org/)和DisGeNET(https://www.disgenet.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與膽管癌疾病相關(guān)靶點(diǎn),最后將上述兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)合并,同時(shí)刪除重復(fù)靶點(diǎn)。

1.3 厚樸酚與膽管癌相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

將上述數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的厚樸酚與膽管癌相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0在線平臺(tái)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny),取交集后得到疾病與藥物的共同靶點(diǎn),即為厚樸酚治療膽管癌相關(guān)靶點(diǎn)。并利用CytoScape 3.9.1軟件將相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行可視化分析。

1.4 蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)建立

將上述厚樸酚與膽管癌交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)進(jìn)而構(gòu)建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò),將結(jié)果保存為TSV文件,隨后通過(guò)CytoScape3.9.1軟件進(jìn)行可視化分析,構(gòu)建共同靶基因互作網(wǎng)絡(luò),篩選厚樸酚與膽管癌的Top10-Hub(核心)靶點(diǎn)。

1.5 GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析

為了研究厚樸酚治療膽管癌的潛在作用機(jī)制,利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david-d.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)的富集分析,導(dǎo)出的數(shù)據(jù)結(jié)果使用微生信在線平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)進(jìn)行可視化處理與分析。

1.6 厚樸酚與靶點(diǎn)分子對(duì)接

為了驗(yàn)證厚樸酚與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能力,從 PubChem[8]數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索厚樸酚的2D分子結(jié)構(gòu),將數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Chem-Bio 3D Ultro 14.0 軟件并轉(zhuǎn)化為 MOL2 文件。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)檢索和下載厚樸酚治療膽管癌的Top10-Hub(核心)靶點(diǎn)的“PDB”格式 3D 結(jié)構(gòu)文件,再利用 PyMOL軟件去水處理及提取原配體結(jié)構(gòu)。隨后使用 Auto Dock Tools-1.5.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接,一般認(rèn)為分子對(duì)接結(jié)果中結(jié)合能越低,結(jié)合親和力越高,當(dāng)結(jié)合能 ≤-5.0 kcal/mol時(shí),表明厚樸酚和核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合能力較為良好,最后使用PyMOL軟件將對(duì)接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 厚樸酚靶點(diǎn)篩選

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到31個(gè)厚樸酚的相關(guān)靶點(diǎn),從Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到100個(gè)靶點(diǎn),從STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到16個(gè)靶點(diǎn),將上述 3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶點(diǎn)進(jìn)行合并,同時(shí)刪除重復(fù)的相關(guān)靶點(diǎn),最終得到135個(gè)厚樸酚的作用靶點(diǎn)。

2.2 膽管癌相關(guān)靶基因篩選

在GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到818個(gè)靶點(diǎn),從DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到877個(gè)靶點(diǎn),將上述兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶點(diǎn)進(jìn)行合并,同時(shí)刪除重復(fù)的相關(guān)靶點(diǎn),最后得到1417個(gè)膽管癌的作用靶點(diǎn)。

2.3 厚樸酚治療膽管癌靶點(diǎn)分析

將膽管癌疾病靶點(diǎn)與厚樸酚藥物靶點(diǎn)取交集,最終得到厚樸酚治療膽管癌相關(guān)靶點(diǎn)47個(gè),見(jiàn)圖1,同時(shí)具體的潛在靶點(diǎn)名稱,見(jiàn)圖2。

圖1 膽管癌與厚樸酚靶點(diǎn)取交集Venn圖

圖2 厚樸酚治療膽管癌的潛在作用靶點(diǎn)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建相關(guān)靶點(diǎn)間的相互作用,將厚樸酚治療膽管癌的47個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),得到PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖3,其中,包含47個(gè)節(jié)點(diǎn),預(yù)期邊線106,實(shí)際邊線327,平均節(jié)點(diǎn)度13.9,PPI 富集P<1.0E-16。利用CytoScape3.9.1軟件及插件獲取 PPI網(wǎng)絡(luò)中拓?fù)鋮?shù),并篩選厚樸酚與膽管癌的Top10-Hub(核心)靶點(diǎn)。見(jiàn)圖4,節(jié)點(diǎn)代表目標(biāo)蛋白,節(jié)點(diǎn)的大小、顏色與靶點(diǎn)的度值相關(guān),節(jié)點(diǎn)越大且顏色越接近紅色表示度值越大,連線代表蛋白之間的相互作用,節(jié)點(diǎn)之間連線的數(shù)量越多,表示該節(jié)點(diǎn)蛋白越重要。利用CytoScape3.9.1軟件中CytoHubba插件篩選出厚樸酚與膽管癌的Top10-Hub(核心)靶點(diǎn),見(jiàn)圖5,包括AKT1(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1,Degree=76.0),IL6(白細(xì)胞介素-6,Degree=68.0),CASP3(胱天蛋白酶 3,Degree=64.0),CCND1(細(xì)胞周期蛋白D1,Degree=60.0),PTGS2(過(guò)氧化物合酶2,Degree=56.0),EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體,Degree=54.0),ERBB2(酪氨酸激酶受體2,Degree=50.0),MMP9(基質(zhì)金屬蛋白酶9,Degree=50.0),MMP2(基質(zhì)金屬蛋白酶2,Degree=42.0),KDR(激酶插入?yún)^(qū)受體,Degree=36.0),說(shuō)明這些核心靶點(diǎn)在厚樸酚治療膽管癌中發(fā)揮重要的作用。

圖3 厚樸酚治療膽管癌的潛在作用靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖(STRING)

圖4 厚樸酚治療膽管癌的潛在作用靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖(CytoScape3.9.1)

圖5 Hub關(guān)鍵基因

2.5 GO富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)47個(gè)共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析,見(jiàn)圖6～8,其中靶點(diǎn)的富集程度用圓圈表示,靶點(diǎn)在通路富集的多少用圓圈的大小表示。在厚樸酚治療膽管癌靶基因生物過(guò)程(biological process,BP)富集分析中共得到230條結(jié)果,其中前3位的富集生物過(guò)程包括負(fù)調(diào)控凋亡過(guò)程(negative regulation of apoptotic process),正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖(positive regulation of cell proliferation)和蛋白質(zhì)自身磷酸化(protein autophosphorylation),見(jiàn)圖6。在厚樸酚治療膽管癌靶基因細(xì)胞組分(cellular component,CC)富集分析中共得到45條結(jié)果,其中前3位的富集細(xì)胞組分包括細(xì)胞質(zhì)的核周圍區(qū)域(perinuclear region of cytoplasm),細(xì)胞膜(plasma membrane)和受體復(fù)合物(receptor complex),見(jiàn)圖7。在厚樸酚治療膽管癌靶基因分子功能(molecular function,MF)富集分析中共得到49條結(jié)果,其中前3位的富集分子功能包括蛋白激酶活性(protein kinase activity),蛋白酪氨酸激酶活性(protein tyrosine kinase activity)和結(jié)合ATP(ATP binding),見(jiàn)圖8。

圖6 厚樸酚治療膽管癌靶基因生物過(guò)程(BP)富集分析

圖7 厚樸酚治療膽管癌靶基因細(xì)胞組分(CC)富集分析

圖8 厚樸酚治療膽管癌靶基因分子功能(MF)富集分析

2.6 KEGG通路富集分析

在厚樸酚治療膽管癌靶基因KEGG富集分析結(jié)果中共得到120條相關(guān)通路,主要涉及PI3K-Akt、FoxO及EGFR等信號(hào)通路,其中前3位的富集KEGG通路包括癌癥信號(hào)通路(Pathways in cancer),內(nèi)分泌耐藥(Endocrine resistance)和膀胱癌(Bladder cancer)。見(jiàn)圖9。

圖9 厚樸酚治療膽管癌靶基因KEGG通路富集分析

2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

為了驗(yàn)證結(jié)論的可信度,利用Autodock軟件對(duì)degree值前10個(gè)核心靶點(diǎn)與厚樸酚進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果顯示這10組的結(jié)合能均<-5.0 kcal/mol,表明厚樸酚和核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合能力較為良好,見(jiàn)表1。其中,與厚樸酚結(jié)合能力最好的是PTGS2(-8.4 kcal/mol)和MMP9(-8.1 kcal/mol)。將這兩組對(duì)接結(jié)果較好的厚樸酚和蛋白晶體進(jìn)行可視化,見(jiàn)圖10,厚樸酚可以與PTGS2蛋白結(jié)構(gòu)中PRO-528形成氫鍵,與MMP9蛋白結(jié)構(gòu)中HIS-405、GLU-402、和Zn形成氫鍵。

3 討論

膽管癌是起源于膽道系統(tǒng)的惡性腫瘤,由于膽道系統(tǒng)的特殊解剖及膽管癌高侵襲性的特點(diǎn)使手術(shù)治療效果并不理想[9]。藥物治療成為晚期膽管癌患者的主要選擇,然而膽管癌對(duì)現(xiàn)有化療藥物不敏感,且極易產(chǎn)生抗藥性。中醫(yī)是中華民族的傳統(tǒng)瑰寶,將傳統(tǒng)的中醫(yī)藥與腫瘤治療結(jié)合起來(lái)已然成為醫(yī)學(xué)界的重要關(guān)注點(diǎn)。厚樸酚是從中草藥厚樸中發(fā)現(xiàn)的主要活性成分之一,既往研究表明厚樸酚具有抗腫瘤作用,可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),包括乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、鼻咽癌和膽管癌等[6]。研究表明,厚樸酚與膽管癌的關(guān)系密切,但機(jī)制不明[7]。因此,本研究擬以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法為切入點(diǎn),探索厚樸酚治療膽管癌的具體作用靶點(diǎn)。

研究顯示,厚樸酚與膽管癌有47個(gè)共同靶點(diǎn),說(shuō)明這些靶點(diǎn)是厚樸酚治療膽管癌的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)建立 PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析,獲得10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn),分別是AKT1、IL6、CASP3、CCND1、PTGS2、EGFR、ERBB2、MMP9、MMP2、KDR。其中,AKT1信號(hào)通路與細(xì)胞癌變有關(guān),調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞存活,并且AKT1通路的失調(diào)可能在肝內(nèi)膽管癌的發(fā)展中起重要作用[10]。IL6作為炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子參與腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展過(guò)程,有研究表明IL6促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。CASP3是多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)。CCND1編碼的分子是調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白,可以促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖與遷移[11]。PTGS2編碼過(guò)氧化物合酶2(COX2),大量研究表明COX2相關(guān)信號(hào)通路在膽管中發(fā)揮重要作用,抑制COX2介導(dǎo)的前列腺素信號(hào)通路可以為膽管癌的治療與預(yù)防提供新的方向。EGFR信號(hào)有助于膽管癌的發(fā)生和進(jìn)展,EGFR抑制劑降低膽管癌細(xì)胞環(huán)氧COX2的表達(dá)[12]。ERBB2是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)家族成員之一,與膽管癌的進(jìn)展密切相關(guān),在小鼠中,ERBB2的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致膽道上皮形成腫瘤。MMP9和MMP2基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員,與膽管癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與預(yù)后不良有關(guān)[13]。KDR也稱血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2 (VEGFR-2),參與膽管癌細(xì)胞新生血管的形成,促進(jìn)其增殖。綜上所述,這些關(guān)鍵靶點(diǎn)主要在炎癥、細(xì)胞周期、血管生成等方面發(fā)揮作用,進(jìn)而影響膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移、耐藥及血管生成等生物學(xué)過(guò)程,促進(jìn)膽管癌的發(fā)生發(fā)展。因此,厚樸酚可以通過(guò)調(diào)控炎癥、細(xì)胞周期、血管生成等方面進(jìn)而治療膽管癌。另外,本研究對(duì)前10個(gè)核心靶點(diǎn)與厚樸酚進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)合能均<-5.0 kcal/mol,表明厚樸酚和核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合能力較為良好,進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。

GO 功能富集分析結(jié)果顯示厚樸酚治療膽管癌的基因功能主要體現(xiàn)在負(fù)調(diào)控凋亡過(guò)程、正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)自身磷酸化等方面;細(xì)胞組分富集分析主要集中在細(xì)胞質(zhì)的核周圍區(qū)域、細(xì)胞膜和受體復(fù)合物等方面;分子功能富集分析中主要體現(xiàn)在蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性和結(jié)合ATP等方面。KEGG通路富集分析結(jié)果提示厚樸酚治療膽管癌相關(guān)的信號(hào)通路主要體現(xiàn)在癌癥、內(nèi)分泌耐藥和膀胱癌等信號(hào)通路。

綜上所述,基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接分析結(jié)果顯示,厚樸酚可以通過(guò)調(diào)控PTGS2和MMP9等關(guān)鍵分子影響膽管癌細(xì)胞的增殖和凋亡等生物學(xué)過(guò)程,從而發(fā)揮治療膽管癌的作用。此項(xiàng)研究為今后開(kāi)展相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)可以提供一定參考依據(jù),未來(lái)隨著研究的進(jìn)一步深入,將厚樸酚作為治療膽管癌的潛在藥物提供更多的可能,為膽管癌患者長(zhǎng)期生存獲益帶來(lái)新希望。