劉豐平，皮聞森，肖運(yùn)祥，趙紅衛(wèi)

三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院脊柱外科，湖北 宜昌 443000

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是最常見的骨與軟組織原發(fā)性惡性腫瘤，多發(fā)生于兒童和青少年。目前，手術(shù)治療、放療和大劑量化療是骨肉瘤的主要治療方法。雖然近年來(lái)新輔助化療藥物使得患者生存率有所提高，但是幾十年來(lái)五年生存率未見提仍未超過(guò)60%。其中，OS 患者的死亡原因主要是肺部轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生5年生存率低于20%[1]。因此，為了提高患者生存率，更需進(jìn)一步闡明OS 轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，明確OS轉(zhuǎn)移防治的有效的策略及靶點(diǎn)。當(dāng)前諸多研究已經(jīng)證實(shí)NPM1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是一種在多種惡性腫瘤中高表達(dá)的癌基因。本研究采用人源骨肉瘤細(xì)胞系(143B、U2-OS 細(xì)胞株)，探討沉默和過(guò)表達(dá)NPM1 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞惡性表型遷移、增殖和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人源骨肉瘤細(xì)胞系143B和人源骨肉瘤細(xì)胞系U2-OS 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海)，NPM1 過(guò)表達(dá)、沉默及陰性對(duì)照慢病毒均購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因。侵襲試驗(yàn)小室購(gòu)于北京萌狀科技公司。凝膠制備試劑盒(AR018)購(gòu)于Boster 公司。DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司。蛋白提取試劑盒(BB-3101)購(gòu)于BestBio公司。NPM1單克隆抗體(兔抗人)購(gòu)于美國(guó)ABcam公司(美國(guó))。HRP標(biāo)記山羊抗鼠多克隆抗體、β-actin 單克隆抗體(鼠抗人)和HRP 標(biāo)記山羊抗兔多克隆抗體均購(gòu)于中杉金橋公司(北京)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 于Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，設(shè)置類別為骨肉瘤，得到NPM1在骨肉瘤中的表達(dá)水平情況(https://www.oncomine.com/resource/login.html)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為L(zhǎng)v/NPM1 組、Lv/ShNPM1 組、NC(Lv/negative)組。試驗(yàn)參照轉(zhuǎn)染手冊(cè)(吉?jiǎng)P公司)，將各組別載體慢病毒顆粒分別轉(zhuǎn)染人源骨肉瘤細(xì)胞系143B 和人源骨肉瘤細(xì)胞系U2-OS細(xì)胞株。

1.2.3 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后消化、收集上述各組細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)BCA 蛋白定量法測(cè)定蛋白含量。SDS-PAGE 分離蛋白，于冰上濕轉(zhuǎn)，依照Western blotting 實(shí)驗(yàn)手冊(cè)操作，其中抗兔NPM1 單克隆抗體比例為1∶2 000；抗鼠β-actin 抗體比例為1∶2 000；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG 比例為1∶5 000。洗膜后，加入ECL顯色液，暗室內(nèi)曝光。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將轉(zhuǎn)染72 h

后的U2-OS和143B細(xì)胞(3 000/孔)用于試驗(yàn)操作，96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，時(shí)間為0 h、24 h 和48 h。依照CCK-8 法操作手冊(cè)，每份實(shí)驗(yàn)平行做6次。

1.2.5 Wound healing 法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 轉(zhuǎn)染72 h后各組細(xì)胞，用于試驗(yàn)操作，胰蛋白酶消化后接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)(細(xì)胞密度為5×105/mL，500 μL/孔，每種細(xì)胞5孔)。依照Wound healing法操作手冊(cè)，每份實(shí)驗(yàn)平行做6次。試驗(yàn)結(jié)果采用Image J 1.47H軟件分析。

1.2.6 Transwell invasion法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 轉(zhuǎn)染72 h 后，胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，接種于Transwell 侵襲小室內(nèi)(細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，150 μL/室)，依照Transwell invasion 法操作手冊(cè)進(jìn)行操作。試驗(yàn)結(jié)果采用Image J 1.47H 軟件分析

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)作圖軟件為Raphpad6.0，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)結(jié)果 于Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索顯示，NPM1在骨肉瘤中呈高表達(dá)，見圖1。

圖1 生物信息學(xué)分析結(jié)果Figure 1 Results of bioinformatics analysis

2.2 NPM1 轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lv/ShNPM1 組、NC 組和Lv/NPM1 組中NPM1 蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示：與NC組比較，Lv/ShNPM1組NPM1 蛋白水平明顯降低，Lv/NPM1 組NPM1 蛋白水平增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)NPM1蛋白的表達(dá)Figure 2 Detection of NPM1 protein expression by Western blot

2.3 NPM1增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力 U2-OS細(xì)胞中NC組、Lv/NPM1組和Lv/ShNPM1組細(xì)胞遷移率分別為(49.7±3.3)%、(64.1±7.4)%、(24.3±6.6)%，143B細(xì)胞分別為(63.5±4.3)%、(75±3.7)%、(30.1±5.9)%。兩種細(xì)胞Lv/ShNPM1 組遷移率明顯低于NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 Wound healing 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞的遷徙能力(×200)Figure 3 The migratory ability of osteosarcoma cells was detected by the Wound healing assay(×200)

2.4 NPM1增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力 U2-OS細(xì)胞中NC 組、Lv/NPM1 組、Lv/ShNPM1 組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為98±26.3、164±41、38±14.6，143B細(xì)胞分別為104±19.1、191±32.4、41±27.6。兩種細(xì)胞Lv/ShNPM1組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯少于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4。

圖4 Transwell invasion實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U2-OS細(xì)胞和143B細(xì)胞的侵襲能力(×200)Figure 4 The invasion ability of U2-OS cells and 143B cells was detected by Transwell invasion assay(×200)

2.5 NPM1 增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力 CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示143B 和U2-OS 細(xì)胞Lv/ShNPM1 組增殖能力明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

圖5 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U2-OS細(xì)胞和143B細(xì)胞的增殖能力Figure 5 The proliferation ability of U2-OS cells and 143B cells was detected by CCK8 assay

3 討論

NPM1(nucleophosmin 1)是一種由294個(gè)氨基酸組成的具有高活性的核仁蛋白。其具有多種分子生物學(xué)功能，包括核糖體蛋白組裝，染色質(zhì)重塑等[2]。經(jīng)過(guò)磷酸化、乙酰化和泛素化等多種翻譯后修飾，NPM1 在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間不斷穿梭，所處于的亞細(xì)胞區(qū)域不同，導(dǎo)致行使的功能也不一樣[3]。也有一些研究表明，NPM1 在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)化中起著至關(guān)重要的作用，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和中心體復(fù)制[4]。

大量研究已經(jīng)證實(shí)在人血液系統(tǒng)惡性腫瘤中檢測(cè)到突變的NPM1，特別是急性髓性白血病(AML)。NPM1 可能是AML 的良好預(yù)后標(biāo)志物，甚至是血液系統(tǒng)惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)[5-6]。與AML相反，NPM1的突變?cè)趯?shí)體瘤中很少被檢測(cè)到。但是，越來(lái)越多的證據(jù)表明，NPM1的在多種實(shí)體瘤中表達(dá)增高與預(yù)后不良有關(guān)，包括膀胱尿路上皮癌[7]、胃癌[8]。另外，最新的一項(xiàng)納入了11項(xiàng)研究和997例患者的薈萃分析也表明NPM1的過(guò)表達(dá)是大多數(shù)實(shí)體腫瘤預(yù)后不良的潛在獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，包括尤文氏肉瘤、肝細(xì)胞癌、胃癌、卵巢漿液性癌、結(jié)直腸癌等[9]。Loubeau等[10]報(bào)道了沉默NPM1能抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和MAPK信號(hào)的傳到。最新的研究報(bào)道了NPM1可能是前列腺癌免疫診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，從而彌補(bǔ)PSA缺乏特異性的缺點(diǎn)[11]。Liu等[12]證實(shí)運(yùn)用siRNA下調(diào)NPM1后能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性表型。本研究中通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示NPM1在骨肉瘤中高表達(dá)。以此推測(cè)NPM1在人骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移中同樣扮演著重要角色。為此，進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默NPM1降低了骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、增殖和遷移能力，而過(guò)表達(dá)NPM1增強(qiáng)了骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、增殖和遷移能力。但是NPM1在骨肉瘤中發(fā)揮作用的內(nèi)在分子機(jī)制仍然不清楚。

NPM1能夠調(diào)節(jié)一些重要的腫瘤抑制因子，如p53和ARF 的活性和穩(wěn)定性[13]，還可以通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和c-Myc 相互作用，從而參與轉(zhuǎn)錄激活[14-15]。Boudra等[16]報(bào)道了mTOR密切參與NPM1基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，從而引起NPM1 的高表達(dá)。另外一項(xiàng)研究證實(shí)RNAi沉默NPM1 基因能下調(diào)前列腺癌細(xì)胞中ERK1/2 的磷酸化水平[17]。ERK 的磷酸化能夠促使NF-κβ從包漿轉(zhuǎn)移至核內(nèi)[18]，從而促使MMP-2、MMP-9 等與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)諸多腫瘤轉(zhuǎn)移，其中包括骨肉瘤[19-20]。Shandilya等[21]報(bào)道了Aurora-B通過(guò)磷酸化NPM1發(fā)揮其調(diào)節(jié)有絲分裂的作用。研究已經(jīng)證實(shí)下調(diào)Aurora-B通過(guò)NF-κβ信號(hào)通路抑制骨肉瘤惡性表型[22]?？傊甆PM1在骨肉瘤中發(fā)揮作用的內(nèi)在分子機(jī)制仍有需更深入的探索研究。

綜上所述，本研究證實(shí)了NPM1能夠在體外促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的惡性表型。為今后進(jìn)一步研究NPM1參與骨肉瘤的發(fā)生、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及可能機(jī)制打下前期基礎(chǔ)。