劉霞　孫沖　黃勤琴等

關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序；花椒屬；葉綠體基因組；九葉青花椒；系統(tǒng)進(jìn)化

中圖分類號(hào)：S718.46 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1498（2023）01-0100-09

九葉青花椒（Zanthoxylum armatum'Jiuyeqing'）為蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum L.）竹葉花椒的主要栽培品種，具有矮化、豐產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)、抗逆等優(yōu)良特性，其果實(shí)清香，麻味純正，備受消費(fèi)者喜愛，市場(chǎng)需求旺盛。我國(guó)花椒屬植物的基礎(chǔ)研究十分薄弱，花椒屬物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尚待進(jìn)一步解析。

長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)花椒屬植物的研究大都集中在其化學(xué)成分的提取和分離，以及提取物種所具有的生物活性和相應(yīng)的藥用價(jià)值方面，僅有少數(shù)學(xué)者基于少量的核基因（ETS和ITS）、葉綠體基因（rps16和trnL-trnF）、分子標(biāo)記（SSR、RAPD和SRAP）開展了花椒屬內(nèi)幾個(gè)物種間的親緣關(guān)系研究。但基于單個(gè)片段或分子標(biāo)記其有效信息位點(diǎn)不足，花椒屬內(nèi)物種間的系統(tǒng)位置支持率不高，花椒屬內(nèi)種間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系未能很好的解析。因此，解析九葉青花椒的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為花椒種質(zhì)資源的分子鑒定、品種選育和農(nóng)藝經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳分析具有重要意義，亦為花椒屬系統(tǒng)進(jìn)化研究提供依據(jù)。

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的重要細(xì)胞器，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。葉綠體基因組一般具有保守的四分體結(jié)構(gòu)，即包括大單拷貝區(qū)（Large Single Copy，LSC），小單拷貝區(qū)（SmallSingle Copy，SSC），2個(gè)反向重復(fù)區(qū)（Inverted Repeat Region，IRs）。大多數(shù)被子植物葉綠體基因組為母系遺傳，且葉綠體基因組的核苷酸替換率適中，因此，葉綠體基因組是進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化和分化時(shí)間分析的理想標(biāo)記。近年來(lái)，隨著葉綠體基因組測(cè)序成本降低，使其在植物系統(tǒng)進(jìn)化分析中廣泛應(yīng)用。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行主栽品種九葉青花椒葉綠體全基因組測(cè)序，通過(guò)組裝、拼接和注釋得到其全長(zhǎng)葉綠體基因組序列，并對(duì)其葉綠體基因組結(jié)構(gòu)、組成及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，旨在豐富花椒的遺傳信息，為未來(lái)研究花椒屬植物間的系統(tǒng)進(jìn)化、親緣關(guān)系及品種鑒定提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

九葉青花椒葉片采于重慶文理學(xué)院特色植物研究院花椒示范基地，植物標(biāo)本（2021023jyq）放置于重慶文理學(xué)院園林與生命科學(xué)學(xué)院標(biāo)本館。采用改良CTAB法對(duì)九葉青花椒提取基因組DNA，-20℃冰箱保存，備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1葉綠體基因組測(cè)序和注釋 利用提取的DNA構(gòu)建shotgun文庫(kù)，并在BGISEQ-500平臺(tái)（中國(guó)，廣州）進(jìn)行測(cè)序。PE150雙末端測(cè)序得到raw data，過(guò)濾掉低質(zhì)量序列后得到reads進(jìn)行拼接組裝。使用SOAPnuke軟件進(jìn)行質(zhì)量控制后，以花椒（Zanthouxylum bungeanum Maxim.）的葉綠體基因組作為參考，用SPAdes v3.13.0軟件組裝葉綠體基因組?；蚪M注釋采用GeSeq（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.ht-ml）軟件。注釋后的葉綠體基因組序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中。

1.2.2葉綠體基因組結(jié)構(gòu)組成分析 九葉青葉綠體基因組序列的GC含量采用Editseq v7.1.0軟件計(jì)算，OGDRAW軟件制作九葉青花椒葉綠體基因組圖譜。CodonW v.1.4.2軟件分析相對(duì)密碼子使用度（Relative Synonymous Codon Usage，RSCU），研究其偏好性。

1.2.3重復(fù)序列預(yù)測(cè) 通過(guò)Tandem Repeats Finder（https：//tandem.bu.edu/trf/trf.html）搜.尋基因組序列中的串聯(lián)重復(fù)序列，用REPuter（https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer/）在線服務(wù)分析葉綠體基因組中的重復(fù)序列（正向、反向、回文和互補(bǔ)重復(fù)），采用MISA （https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）在線預(yù)測(cè)九葉青花椒葉綠體基因組包含的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Reapeat，SSR），其中，一、二、三、四、五、六堿基重復(fù)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分別設(shè)置為10，6，5，5，5，5。2個(gè)SSR之間的最小距離設(shè)置為100 bp，小于100 bp時(shí)，2個(gè)微衛(wèi)星組成1個(gè)復(fù)合微衛(wèi)星。

1.2.4系統(tǒng)進(jìn)化分析 從NCBI上下載得到12個(gè)蕓香科物種的完整葉綠體基因組序列，將這些葉綠體基因組序列與本研究得到的九葉青花椒的完整葉綠體基因組序列通過(guò)MAFFT軟件進(jìn)行比對(duì)分析，其中黃檗（PheHodendron amurense Rupr.）和川黃檗（Phellodendron chinense Schneid.）的葉綠體基因組序列作為外類群。采用RAxML軟件構(gòu)建ML（Maximum Likelihood）樹，建樹過(guò)程中通過(guò)GTR模型確定最優(yōu)樹。MrBayes3.1.2軟件構(gòu)建Bl（Bayesian）樹，采用GTR替代模型和伽馬分布率，每1000代進(jìn)行1次計(jì)算。

2結(jié)果與分析

2.1九葉青花椒葉綠體全基因組結(jié)構(gòu)及特征

注釋組裝獲得九葉青花椒完整的葉綠體基因組圖譜見圖1。該葉綠體基因組序列全長(zhǎng)158 579 bp，包括大單拷貝區(qū)域（LSC）長(zhǎng)85 780 bp，小單拷貝區(qū)域（SSC）長(zhǎng)17 603 bp，2個(gè)反向重復(fù)區(qū)（IRa和IRb）相等長(zhǎng)度為27 598 bp。共注釋了133個(gè)基因，其中，88個(gè)蛋白編碼基因，37個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因。葉綠體基因組總的GC含量為38.5%，IR區(qū)域（42.5%）的GC含量明顯高于LSC區(qū)域（36.8%）和SSC區(qū)域（33.6%），這可能主要是IR區(qū)域具有高GC含量的rRNA基因造成的。在注釋的九葉青花椒葉綠體基因組中18個(gè)特異基因具有內(nèi)含子，包括12個(gè)特異編碼基因和6個(gè)特異tRNA基因。除pafl具有2個(gè)內(nèi)含子外，其余均具有1個(gè)內(nèi)含子。rps12基因被截?cái)酁?個(gè)片段，其中，1個(gè)外顯子位于LSC區(qū)域，另外2個(gè)外顯子位于IR區(qū)域。最長(zhǎng)內(nèi)含子位于trnK-UUU基因，長(zhǎng)2503 bp，主要是因?yàn)閮?nèi)部包含matK基因；rps12基因內(nèi)含子最短（538 bp）。

2.2九葉青花椒葉綠體基因組的重復(fù)序列和簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析

通過(guò)軟件測(cè)算在九葉青花椒葉綠體基因組中存在19個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，其中，長(zhǎng)度最大為25bp，最小為14 bp，長(zhǎng)度為18bp的重復(fù)序列最多，有6個(gè)。該葉綠體基因組中共檢測(cè)到長(zhǎng)片段重復(fù)序列49個(gè)，其中，21個(gè)正向重復(fù)，8個(gè)反向重復(fù)，19個(gè)回文重復(fù)和1個(gè)互補(bǔ)重復(fù)（圖2）。重復(fù)長(zhǎng)度范圍為19～50 bp，其中，長(zhǎng)度為20 bp的重復(fù)最多（10個(gè)），其次是19 bp（9個(gè)），而重復(fù)長(zhǎng)度為26、31、48、50 bp的最少，均1個(gè)。在九葉青花椒葉綠體基因組中共預(yù)測(cè)到70個(gè)SSR，包括60個(gè)單核苷酸，1個(gè)二核苷酸，9個(gè)復(fù)合型SSR（表1）。75.7%的SSR位于IGS和內(nèi)含子等非編碼區(qū)域且A/T堿基在SSR中出現(xiàn)頻率較高，在60個(gè)單核苷酸SSR中，包含A堿基SSR有26個(gè)，包含T堿基SSR有32個(gè)。從表1可以看出，SSR在葉綠體基因組中分布隨機(jī)，表明SSR數(shù)量豐富，遺傳信息含量高，可篩選具有多態(tài)性的引物，為未來(lái)研究花椒種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)提供參考。

2.3密碼子偏好性分析

在九葉青花椒葉綠體基因組中的蛋白編碼基因共有26398個(gè)密碼子（不包括終止密碼子），其中，亮氨酸Leu的密碼子最豐富（2821個(gè)），占總數(shù)的10.69%，編碼Leu的6種同義密碼子中TTA數(shù)量最多；編碼半胱氨酸Cys的數(shù)量最少（310個(gè)），僅占密碼子總數(shù)的1.17%。通過(guò)對(duì)密碼子使用頻率的計(jì)算結(jié)果表明：編碼異亮氨酸lle的ATT（1078）使用次數(shù)最多，編碼甲硫氨酸Met的ATT （1）和GTG （2）的使用次數(shù)最少。相對(duì)同義密碼子使用率值（RSCU）受影響密碼子使用模式的突變因子的影響，因此，RSCU<1表示密碼子使用率較低，RSCU>1表示密碼子使用率較高，RSCU=1表示無(wú)偏倚。經(jīng)計(jì)算分析，相對(duì)同義密碼子使用值（RSCU）的范圍為0.005（ATT）到2.986（ATG），分析還發(fā)現(xiàn)RSCU>1的密碼子有31種，說(shuō)明這些密碼子有一定的偏好性。在這些密碼子中，29個(gè)以A或T結(jié)尾，僅2個(gè)以G結(jié)尾，這說(shuō)明九葉青花椒在密碼子第三位堿基上有較強(qiáng)的A/T堿基偏好性。由圖3可以看出：編碼精氨酸Arg、亮氨酸Leu和絲氨酸Ser密碼子種類最多，有6種密碼子編碼。色氨酸Trp不存在密碼子偏好性（RSCU=1），只有1個(gè)密碼子（TGG）編碼。

2.4基于葉綠體基因組序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

以黃檗和川黃檗2個(gè)黃檗屬植物為外類群，連同花椒屬11個(gè)植物的全葉綠體基因組序列構(gòu)建ML和Bl系統(tǒng)進(jìn)化樹，2種方法得到的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，僅在個(gè)別分支節(jié)點(diǎn)支持率上略有差別。從圖4可看出：花椒屬物種聚為一支，2種方法在分支上的支持率均為100%，為單系類群。Z.panicu/-atum和Z.madagascariense位于分支基部與其他花椒物種構(gòu)成姊妹群關(guān)系，且分支支持率為100%和1（ML和BI）。狹葉花椒、青花椒和Z.pinnatum聚為一個(gè)分支與Z.tragodes、胡椒木、花椒、Z.sp. NH-2018、野花椒和九葉青花椒形成的分支構(gòu)成姊妹群關(guān)系，分支支持率均為100%，其中，九葉青花椒與野花椒呈姊妹關(guān)系，親緣關(guān)系最近，與花椒（Z.bungeanum）親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

3討論

在大多數(shù)的被子植物中，葉綠體基因組具有典型的四分體結(jié)構(gòu)，序列長(zhǎng)度一般為120～160kb。九葉青花椒葉綠體基因組同樣具有相同的序列結(jié)構(gòu)特征，其葉綠體基因組總長(zhǎng)度為158 579 bp，其中，LSC長(zhǎng)85 780 bp，SSC長(zhǎng)17 603 bp，IRs長(zhǎng)度為27 598 bp，總的GC含量為38.5%，IR區(qū)域（42.5%）的GC含量明顯高于LSC區(qū)域（36.8%）和SSC區(qū)域（33.6%），這主要是因?yàn)镮R區(qū)域具有高GC含量的rRNA基因造成的。

九葉青花椒葉綠體基因組中的蛋白編碼基因共有26 398個(gè)密碼子，在31種RSCU>1的密碼子中，除了TTG和ATG外，其余密碼子均以A或T結(jié)尾，這說(shuō)明了九葉青花椒在密碼子的使用偏向于第三個(gè)密碼子位置為A和T，有較強(qiáng)的A/T堿基偏好性。研究結(jié)果與蒺藜苜蓿（Medicagotruncatu/a Gaertn.）、杓蘭（Cypripedium calceo/us L.）、和馬尾松（Pinus massonianaLamb.）等植物葉綠體基因的第3位密碼子偏好性趨勢(shì)相吻合，但與酸棗（Ziziphus jujuba var.Spinosa （Bunge） Hu ex H.F.Chow）、陸地棉（Gossypium hirsutum L.）和樟樹（Cinnamomum camphora （L.） Presl）等植物的葉綠體基因分析結(jié)果不同。這表明密碼子使用偏好性在不同物種中存在一定的差異。

葉綠體SSR是研究群體遺傳學(xué)、生物地理學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化等高效的分子標(biāo)記，在大量研究中廣泛應(yīng)用。在九葉青花椒葉綠體基因組SSR預(yù)測(cè)中，絕大多數(shù)為單堿基重復(fù)（60/70），這與肖蒲桃（Syzygium acuminatissimum （Blume）Candolle）、胡桃（Juglans regia L.）和金錢槭（Dipteronia sinensis Oliv.）等大多數(shù)植物研究結(jié)果一致。重復(fù)序列的分析為將來(lái)青花椒品種及其他植物的物種鑒定和個(gè)體水平的遺傳差異分析提供了豐富的遺傳信息支撐。

我國(guó)花椒屬物種繁多，品種較多，為該屬的物種、品種鑒定帶來(lái)極大困難。本研究基于葉綠體基因組序列得到的花椒屬系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果與Appelhans等利用葉綠體基因片段和核基因片段構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果一致，花椒屬物種均聚為一個(gè)分支，形成單系類群，這與Feng等的研究結(jié)果一致。花椒屬物種形成2大分支，即崖椒亞屬和花椒亞屬2大分支，這與傳統(tǒng)的分類學(xué)結(jié)果一致。本研究表明，九葉青花椒與野花椒親緣關(guān)系較近，與北方主栽花椒親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，這與Feng等的研究結(jié)果一致。但由于花椒屬物種較多，目前提交到數(shù)據(jù)庫(kù)中的葉綠體基因組序列有限，基于葉綠體基因組序列構(gòu)建花椒屬的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系還不夠全面，將來(lái)需獲取更多花椒屬物種的數(shù)據(jù)來(lái)全面分析物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

4結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，組裝和注釋了九葉青花椒完整的葉綠體基因組，并解析了該基因組的結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果表明，九葉青花椒葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征與其他花椒屬植物相似，為典型的四分體組成結(jié)構(gòu)，全長(zhǎng)序列為158579bp，編碼133個(gè)基因，26 398個(gè)密碼子，檢測(cè)到19個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，49個(gè)長(zhǎng)片段重復(fù)、70個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析表明，花椒屬為單系類群，九葉青花椒與野花椒關(guān)系密切。研究結(jié)果可為未來(lái)研究花椒種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)提供參考。