周坤 王靜靜 李璐遙 王鑫 申雪 寇瑤瑤 馬百平 王梅 鄭曉暉 趙曄

摘要 糖脂代謝病是由遺傳、環(huán)境和精神狀況引起的一種復雜性疾病，其特點是糖、脂代謝紊亂，中醫(yī)學稱之為“消渴癥”，隨著生活水平和社會壓力的提高該疾病呈現(xiàn)多齡化趨勢。中藥的多組分協(xié)同增效使其在長期治療消渴癥方面具有明顯優(yōu)勢。山楂果、葉富含有機酸和黃酮類成分，在降糖降脂方面具有顯著效果。測定了山楂果、葉提取物中主要成分的含量，建立了T2DM大鼠模型，研究了山楂果葉提取物干預AMPKα／SREBP-1／ACCα信號通路進而調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用和機制，結(jié)合網(wǎng)絡藥理學方法分析山楂果、葉治療T2DM的有效成分、作用靶點和作用機制。結(jié)果表明，山楂果、葉配伍給藥能更顯著降低T2DM大鼠空腹血糖血脂水平，提高糖耐量水平，促進胰島素分泌，降低脂肪堆積，縮小脂肪細胞，同時調(diào)節(jié)肝腎功能，增加肝臟AMPKα及其磷酸化水平，降低SREBP-1、ACCα的蛋白表達。網(wǎng)絡藥理學共篩選到14個山楂果、葉的有效成分，與疾病交集靶點共150個，參與調(diào)控PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、胰島素抵抗等與糖脂代謝相關的多個信號通路。研究表明，山楂的果、葉配伍能夠通過干預AMPKα／SREBP-1／ACCα通路，協(xié)同調(diào)節(jié)糖脂代謝，并且對于PI3k-Akt信號通路、MAPK信號通路、胰島素抵抗等也有調(diào)節(jié)作用，具有良好的臨床應用前景。

關鍵詞 山楂果;山楂葉;AMPKα／SREBP-1／ACCα;網(wǎng)絡藥理學;糖脂代謝

中圖分類號：R28? DOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2023-01-009

Compatibility mechanism of hawthorn fruit and leaf regulating

glycolipid metabolism based on AMPKα／SREBP-1／ACCα pathway

ZHOU Kun1， WANG Jingjing1， LI Luyao1， WANG Xin1， SHEN Xue1，

KOU Yaoyao1， MA Baiping2， WANG Mei1，3， ZHENG Xiaohui1， ZHAO Ye1

（1.Chemistry of Chinese Materia Medical Research Laboratory， National Administration of

Traditional Chinese Medicine（Third Grade）， Northwest University， Xian 710069， China;

2.Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China;

3.Institute of Biology／SU Biomedicine， Leiden University-EuropeanCenter for Chinese Medicine and Natural Compounds， Leiden 2333BE， Netherlands）

Abstract Glucolipid metabolic disease is a complex disease characterized by disorder of glucose and lipid metabolism and caused by genetic， environmental and mental conditions. It is called "Xiaoke disease" in traditional Chinese medicine. With the improvement of living standards and social pressure， it shows a multi-aging trend. The multi-component synergy of traditional Chinese medicine has obvious advantages in the long-term treatment of diabetes. Hawthorn fruit and leaves are rich in organic acids and flavonoids， which have significant effect on lowering blood sugar and blood lipids. In this study， the contents of the main components in hawthorn fruit and leaf extracts were determined， and the T2DM rat model was established to study the effect and mechanism of hawthorn fruit and leaf extracts on AMPKα／SREBP-1／ACCα signaling pathway and regulation of glucose and lipid metabolism. Combined with the method of network pharmacology， the effective components， action targets and action mechanism of hawthorn fruit and leaf in the treatment of T2DM were analyzed. The results showed that the combined administration of hawthorn fruit and leaf could significantly reduce the fasting blood glucose and lipid level， improve the glucose tolerance level， promote insulin secretion， reduce fat accumulation， shrink adipocytes， regulate liver and kidney function and increase AMPKα phosphorylation， reduce protein expression of SREBP-1 and ACCα. A total of 14 active components of hawthorn fruit leaves were screened by network pharmacology， with a total of 150 disease intersection targets， which are involved in the regulation of PI3K／Akt signaling pathway， MAPK signaling pathway， insulin resistance and other signaling pathways related to glucose and lipid metabolism. This study shows that the compatibility of fruit and leaf of hawthorn can regulate glucose and lipid metabolism through AMPKα-SREBP-1-ACCα pathway， which has a good prospect of clinical application.

Keywords hawthorn fruit; hawthorn leaves; AMPKα／SREBP-1／ACCα; network pharmacology; glycolipid metabolism

糖脂代謝紊亂的主要特征是糖代謝紊亂與脂代謝紊亂，與II型糖尿?。═2DM）、高血脂、高血壓、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病密切相關，對人類的健康威脅日益嚴重［1］。中藥在治療糖尿病和高脂血癥等疾病上有著上千年的歷史。山楂果為藥食同源，入脾胃經(jīng)，具有消食化積之力，在改善高血脂癥［2］、動脈粥樣硬化病變［3］等疾病上具有很好的效果?！吨袊幍洹?020版中記載山楂葉具有“化濁降脂”的功效，可用于治療心血管疾?。?-6］?，F(xiàn)代研究表明山楂葉具有改善T2DM大鼠血糖血脂異常［7］、抑制胰島組織凋亡［8］、促進胰島β細胞分泌胰島素［9］等作用。本研究通過高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合注射鏈脲佐菌素誘導建立T2DM大鼠模型，研究山楂果、葉提取物基于AMPKα／SREBP-1／ACCα信號通路調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用；基于中醫(yī)整體觀和辨證論治的特點，結(jié)合網(wǎng)絡藥理學所構(gòu)建的基于疾病-表型-基因-藥物的多層網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)研究模式，分析山楂果、葉治療T2DM的有效成分、作用靶點和作用機制。該研究為闡明山楂果、葉協(xié)同調(diào)節(jié)糖脂代謝作用及機制提供理論依據(jù)，并為山楂果、葉的深入開發(fā)提供基礎研究支撐。

1 實驗材料和方法

1.1 儀器設備及試劑耗材

Velocity 12R型冷凍離心機（美國Dynamica）;Tocan240化學發(fā)光儀（上海領成）;DikMA C18色譜柱（漢邦科技）；LC-20高效液相色譜儀（日本島津）等。色譜級甲醇、醋酸、乙腈、四氫呋喃（天津科密歐）;對照品牡荊素葡萄糖苷（111668）、牡荊素鼠李糖苷（MUST-16011113）、牡荊素（130522）、蘆?。?00080）、金絲桃苷（111521），純度均≥99％，購自中國食品藥品檢定研究所。本文中試劑制備均為體積分數(shù)。

1.2 藥材采集及藥物溶液的制備

山楂藥材采自河北省承德市興隆縣，經(jīng)鑒定為山里紅（crataegus pinnatifida Var Major N.E.Br.）的干燥成熟果實和干燥葉。山楂果去核粉碎，75％乙醇加熱回流2 h，得濾液，連續(xù)3次。合并3次濾液減壓濃縮，取適量濃縮液于燒杯中，滴加1 mol／L NaOH溶液調(diào)節(jié)山楂果濃縮液的pH至10左右，抽濾得上清液。選擇717型強堿陰離子交換樹脂濕法裝柱，純水進行洗脫，洗脫液為無色后停止，再選用0.3 mol／L的鹽酸溶液洗脫，洗脫液用水飽和乙酸乙酯等體積萃取6次，無水硫酸鈉脫水后減壓濃縮，真空干燥即得山楂果提取物（hawthorn fruit extract，HOA）。山楂葉采用25％甲醇作為溶劑，加熱回流1.5 h，過濾得濾液，連續(xù)提取3次，合并濾液，減壓濃縮至1 g／mL生藥。使用D101型大孔樹脂，3倍量10％甲醇洗脫后洗脫液棄去;再3倍量70％甲醇進行洗脫，收集洗脫液并減壓濃縮，真空干燥即得山楂葉提取物（hawthorn leaves extract，HLF）。采用《中國藥典》中山楂果、葉項下有機酸和總黃酮的含量測定方法進行測定［4］，建立山楂葉HPLC方法，色譜條件為：DikMA C18色譜柱（柱長50 mm，柱徑4.6 mm， 粒徑5 μm），0.2％乙酸水-乙腈-甲醇-四氫呋喃（80∶12∶5∶3）為流動相，等度洗脫，流速為1.0 mL／min，柱溫35 ℃，檢測波長360 nm，測定山楂葉提取物中主要黃酮成分的含量。山楂果提取物中有機酸含量為60.3％。山楂葉提取物中總黃酮含量為90.5％，其中牡荊素葡萄糖苷含量為596.6 ng／g，牡荊素鼠李糖苷含量為119.6 ng／g，蘆丁含量為12.0 ng／g，牡荊素含量為1.0 ng／g，金絲桃苷含量為49.2 ng／g。

1.3 實驗動物模型的建立及給藥方案

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（150 ± 30）g，購自西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心，許可證號：SCXK（陜西）2012-003。飼養(yǎng)于西北大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（陜）2021-004。溫度（20±2）℃，濕度（50±10）％，明暗交替各12 h。將大鼠分為正常對照（Con.）組、模型（Mod.）組，Con.組給予標準飼料和純凈水，Mod.組給予高脂高糖飼料和葡萄糖溶液進行飲食誘導，4周后，禁食12 h，腹腔注射28 mg／kg STZ（溶于pH=4.4檸檬酸緩沖液中），3 d后測定血糖，血糖值≥11.1 mmol／L的大鼠，認為是造模成功的，同時Con.組按體質(zhì)量腹腔注射檸檬酸緩沖液。篩選的模型鼠隨機分成5組，每組8只，分別為Mod.組、HLF（100 mg／kg）組、HOA（100 mg／kg）組、山楂果、葉提取物混合（FA，100 mg／kg HLF+100 mg／kg HOA）組、陽性對照鹽酸二甲雙胍（MFM，266 mg／kg）組，Mod.組動物繼續(xù)給予高脂高糖飼料，口服灌胃給藥，1次／d，連續(xù)給藥7周。

1.4 檢測方法及指標

給藥結(jié)束后，進行糖耐量實驗。大鼠禁食12 h，尾靜脈采血測定血糖，灌胃葡萄糖溶液（2 g／kg）后于0.5、1、2 h后測定血糖值并繪制糖耐量曲線。腹腔注射濃度為10 mL／kg的烏拉坦溶液麻醉大鼠，測量體質(zhì)量，于頸總動脈插管取血，分離血漿檢測總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、胰島素（INS）、總膽紅素（TNIL）、堿性磷酸酶（ALP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（CREA）、尿酸（UA）、尿素（UREA）;收集腎周脂肪及睪丸周圍脂肪、肝組織，稱其質(zhì)量。取部分脂肪組織保存在4％多聚甲醛溶液中，HE切片觀察脂肪形態(tài)學變化，其余樣本置于-80 ℃的條件中。

1.5 肝臟組織蛋白測定

將大鼠肝組織加入預冷生理鹽水研磨混勻，離心，去上清，沉淀加入含1％的PMSF和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解30 min，12 kr／min離心10 min，用BCA蛋白測試盒測定蛋白提取液濃度。加入適量蛋白上樣緩沖液，沸水變性。選擇SDS-PAGE凝膠，80～120 V電泳，260 mA轉(zhuǎn)膜，5％脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃孵一抗過夜?？贵w分別為AMPKα、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPKα）、SREBP-1、ACCα、β-actin，按照說明書進行稀釋。37 ℃孵育二抗2 h，最后ELC發(fā)光液發(fā)光，凝膠成像拍照分析蛋白表達。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析來比較各組間差異性，以GraphPad 8和Image J軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以±SD表示。

1.7 網(wǎng)絡藥理學

山楂果葉活性成分基于TCMSP數(shù)據(jù)庫［10］挖掘并結(jié)合山楂果葉化學成分相關文獻，對山楂果葉的活性成分進行篩選，通過SEA在線服務器、Swiss Target數(shù)據(jù)庫預測相關靶點，去除重復靶點。PubChem數(shù)據(jù)庫中收集這些成分的化學信息。Gene Cards數(shù)據(jù)庫搜索T2DM相關靶標，并對活性成分預測靶點和疾病靶點取交集作為潛在靶點。最后，使用Cytoscape 3.7.2軟件［11］建立藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡。String數(shù)據(jù)庫繪制PPI網(wǎng)絡，選擇“Homo species”物種，選取得分大于0.9的高置信度目標蛋白質(zhì)，得出PPI網(wǎng)絡。將交集靶點基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫，對核心靶蛋白的GO功能和KEGG途徑［12］進行富集分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量、血糖、體脂測定結(jié)果

造模前各組大鼠體質(zhì)量比較均勻，無差異。各組大鼠體質(zhì)量處于穩(wěn)定增長，相比Con.組，高脂飼料喂養(yǎng)下的Mod.組大鼠體質(zhì)量快速增長，給藥結(jié)束后各給藥組之間大鼠體質(zhì)量無明顯差異，但相比與Mod.組大鼠有所改善（見圖1A）;各給藥組大鼠空腹血糖值與Mod.組大鼠血糖相比均顯著性下降（P<0.01），見圖1B;相比Mod.組，各給藥組大鼠糖耐量顯著增強（見圖1C）;從圖1D、E可以看出，與Con.組相比，Mod.組大鼠脂肪質(zhì)量和體脂指數(shù)顯著升高（P<0.01），各給藥組大鼠的脂肪質(zhì)量和體脂指數(shù)顯著降低（P<0.01）。各給藥組之間無顯著性差異。

2.2 血液生化指標結(jié)果

經(jīng)過7周給藥后，與Mod.組相比，無論山楂果葉單獨給藥還是配伍給藥均可降低大鼠血清中TC、TG、LDL-C、ALT、AST、TBIL、ALP、CREA、UREA、UA含量，升高大鼠血清中HDL-C和INS含量，有統(tǒng)計學差異，F(xiàn)A調(diào)節(jié)T2DM大鼠血清中TG、AST、ALP、UA指標的作用效果與單獨HLF和HOA有顯著差異，結(jié)果見圖2。

2.3 大鼠脂肪組織形態(tài)學觀察

相比Con.組，喂養(yǎng)高脂飼料的Mod.組大鼠脂肪細胞的排列較為雜亂且細胞體積增大，同一視野下細胞數(shù)量相對于Con.組大鼠數(shù)量減少;與Mod.組相比，各給藥組大鼠脂肪細胞的排列趨于整齊且大小較為一致，相同視野下給藥組大鼠脂肪細胞明顯增多，其中FA組大鼠脂肪細胞輪廓更清晰且細胞體積更為接近Con.組大鼠。結(jié)果表明，給藥組對T2DM大鼠脂組織形態(tài)有一定的改善作用（見圖3）。

2.4 AMPKα／SREBP-1／ACCα信號通路分析

由圖4可知，與Con.組相比，Mod.組肝臟中p-AMPKα活性顯著降低，提示T2DM大鼠肝臟AMPK信號通路可能受到抑制。與Mod.組相比，HLF和FA組p-AMPKα表達顯著升高（P<0.05或P<0.01），表明HLF和FA具有激活AMPK活性的作用。與Mod.組比較，HLF、HOA和FA組大鼠肝臟中SREBP-1和ACCα蛋白的表達均顯著降低（P<0.05或P<0.01），表明SREBP-1和ACCα的活性被抑制。各給藥組對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)FA對于p-AMPKα／AMPKα和ACCα的調(diào)節(jié)作用均強于HLF和HOA。此外，陽性藥二甲雙胍同樣能夠激活AMPK信號通路，但相比其調(diào)節(jié)通路相關蛋白水平的能力，山楂果有機酸提取物和山楂葉總黃酮提取物在調(diào)節(jié)AMPKα／SREBP-1／ACCα具有更好的調(diào)節(jié)作用。

2.5 網(wǎng)絡藥理學分析結(jié)果

網(wǎng)絡藥理學分析從山楂果葉中共篩選14個活性化合物（見表1）。通過查閱文獻共篩選出包括黃酮類成分槲皮素、山奈酚、牡荊素，有機酸類成分綠原酸、山楂酸、咖啡酸，三萜類成分熊果酸等14種在山楂果葉中含量較高的有效成分。從SEA和Swiss Target服務器和數(shù)據(jù)庫中預測到388個經(jīng)過去重的靶點，Gene Cards數(shù)據(jù)庫搜索到T2DM相關靶點9 812個，交集靶點150個。借助Cytoscape軟件構(gòu)建化合物-疾病-靶點多維調(diào)控網(wǎng)絡，共包含165個節(jié)點，802條邊，網(wǎng)絡聚類系數(shù)0.866，網(wǎng)絡中的節(jié)點分別代表著中藥名、化學成分、疾病和作用靶點，連接線代表相互作用（見圖5A）。150個共同靶點從STRINH數(shù)據(jù)庫中得到PPI網(wǎng)絡，經(jīng)過Cytoscape軟件分析并美化得到PPI網(wǎng)絡圖，該網(wǎng)絡圖中根據(jù)Degree值顯示蛋白相互作用的緊密程度，節(jié)點的大小與Degree值呈正相關（見圖5B）。Degree值較大的幾個靶點被認為是在整個山楂果葉調(diào)節(jié)T2DM疾病過程中占據(jù)很重要的位置，如磷脂酰肌醇三激酶調(diào)節(jié)亞單位α（PIK3R1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、蛋白激酶1（AKT1）、核因子-κB亞基1（NFKB1）。GO分析確定了生物學過程258條，細胞組分26條，分子功能50條（見圖5C）。結(jié)果顯示，在生物學過程中，顯著富集的過程有正向血小板激活、凋亡的負調(diào)控、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正向調(diào)控、MAP激酶活性的正調(diào)控等條目;在細胞組分中，顯著富集的有細胞質(zhì)、細胞質(zhì)膜、細胞溶質(zhì)、細胞核等;在分子功能方面，最顯著富集的包括酶結(jié)合、蛋白激酶活性、蛋白結(jié)合等功能。KEGG通路功能富集分析得到95條結(jié)果，從中篩選了與T2DM關聯(lián)較大的且具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）的15條通路，主要包括PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、胰島素抵抗等與糖脂代謝相關的多個信號通路（見圖5D）。

3 結(jié)語

我國山楂資源豐富，于河北、陜西、山東等地均有種植，價格低廉。傳統(tǒng)中醫(yī)認為山楂果“藥食同源”，具有化濁降脂的功效，而山楂葉近年來研究發(fā)現(xiàn)在心血管保護方面效果優(yōu)異。Aierken等研究發(fā)現(xiàn)，山楂果提取物可以顯著降低T2DM大鼠血清TC、TG及血糖水平，促進血漿INS的釋放［13］。山楂果有機酸參與PI3K-Akt、MAPK等通路恢復H2O2誘導的H9c2心肌細胞損傷，抑制Caspase 3／9活性，降低磷酸化NF-κB蛋白表達，并且可能通過調(diào)節(jié)心肌組織缺氧誘導因子（HIF）1α、B細胞淋巴瘤／白血病2（Bcl-2）、Bcl-2相關蛋白（BAX）表達從而發(fā)揮抗心肌缺血再灌注損傷的作用［14］。Dong等發(fā)現(xiàn)山楂葉總黃酮提取物具有延緩高脂飲食下載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)展，顯著減少動脈粥樣硬化斑塊面積23.1％，通過降低血清TC、LDL-C／HLDL-C，增強SOD1和SOD2、谷胱甘肽過氧化物酶等基因的表達改善小鼠主動脈粥樣硬化［15］。研究結(jié)果顯示，HOA提取物提取率為49.82％，HLF提取率為29.4％，HOA和HLF的100 mg／kg給藥劑量分別相當于1.73 g／kg原藥材和2.93 g／kg原藥材。相比山楂果或葉提取物單獨給藥，聯(lián)合給藥對于T2DM大鼠的糖脂代謝調(diào)節(jié)的效果更好，能夠改善大鼠體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量、體脂指數(shù)、糖耐量水平，顯著降低血糖血脂，提高大鼠INS敏感性，升高HDL-C含量，同時改善肝功能和腎功能。

AMPK信號通路的調(diào)節(jié)在胰島素抵抗及相關代謝綜合癥發(fā)病機制中起著關鍵作用，是研究糖尿病及其他代謝相關疾病的核心。研究認為，激活AMPK信號通路在預防和治療T2DM及其相關代謝疾病發(fā)揮重要的作用［16］。磷酸化的AMPK刺激脂肪酸的代謝，通過抑制AMPK的活性，有助于脂肪生成增加，并且通過增加肝臟中丙二酰輔酶A濃度降低脂肪酸氧化速度，被認為是重要的代謝“總開關”［17］。SREBPs屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸家族，參與脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，在糖尿病、肥胖癥、癌癥的發(fā)病機制中起著關鍵作用［18］。SREBP-1調(diào)控膽固醇與脂肪酸合成中相關酶基因的表達，調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶［19］、低密度脂蛋白受體［20］、ACC［21］、葡萄糖激酶［22］、磷酸烯醇式丙酮酸激酶［23］等。SREBP-1蛋白的過表達會引起肝臟TC和TG的累積而導致脂肪肝、肥胖、胰島素抵抗等代謝性疾?。?4］。乙酰輔酶A羧化酶（ACC）是一種含有生物素的變構(gòu)羧化酶，其中，ACCα主要存在于肝臟、脂肪等組織，參與脂肪酸的合成［25-26］，ACCα水平的變化影響著脂肪的沉積情況和脂質(zhì)代謝。

研究結(jié)果顯示，HLF和HOA可通過上調(diào)T2DM大鼠肝臟p-AMPKα／AMPKα，下調(diào)SREBP-1和ACCα蛋白水平，且FA上調(diào)p-AMPKα／AMPKα效果顯著優(yōu)于單獨使用HLF和HOA，說明HLF和HOA可協(xié)同增效;網(wǎng)絡藥理學分析表明，熊果酸、槲皮素、金絲桃苷、牡荊素鼠李糖苷等14種活性成分，可能作用于PIK3R1、VEGFA、AKT1、NFKB1等靶點，主要涉及正向血小板激活、凋亡的負調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正向調(diào)控等生物學過程，參與到PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、胰島素抵抗等與糖脂代謝相關的多個通路，進一步說明山楂果葉的不同成分配伍后具有多靶點、多通路的治療T2DM作用。本研究為山楂果、葉聯(lián)合治療糖脂代謝疾病的產(chǎn)品開發(fā)提供更詳盡的基礎數(shù)據(jù)支撐。山楂果和山楂葉的化學組成已基本明晰，其中，各自所含的單體成分對山楂提取物調(diào)節(jié)糖脂代謝作用的貢獻和量效關系尚待進一步比較研究。

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（編 輯 張 歡）