成曉霞 王子見(jiàn) 何鳳琴 成瀛

摘要 紅緣擬層孔菌抗腫瘤作用受到廣泛關(guān)注，但其弱極性化合物對(duì)白血病細(xì)胞的增殖抑制及作用機(jī)制尚缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)。采用MTT法評(píng)價(jià)紅緣擬層孔菌不同極性組分抗腫瘤活性，結(jié)果顯示氯仿組分（FPKc）可顯著抑制U937細(xì)胞的增殖;進(jìn)而結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析FPKc殺傷白血病細(xì)胞的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著提升胞內(nèi)活性氧含量，同時(shí)伴隨細(xì)胞質(zhì)膜電位下降、胞內(nèi)鈣離子濃度上升、線粒體膜電位崩解、細(xì)胞凋亡率增加，而活性氧抑制劑則能明顯緩解細(xì)胞凋亡的發(fā)生，提高細(xì)胞存活率。因此，F(xiàn)PKc可能調(diào)控活性氧的過(guò)量生成促進(jìn)U937細(xì)胞的死亡。

關(guān)鍵詞 紅緣擬層孔菌;人急性單核白血病U937細(xì)胞;活性氧;細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：R932;Q28? DOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2023-01-008

The role of reactive oxygen species （ROS） in Fomitopsis pinicola

（Sw.Ex Fr.m） Karst induced suppression to leukemia cells

CHENG Xiaoxia1， WANG Zijian1， HE Fengqin1， CHENG Ying2

（1.Xian Key Laboratory of Natural Product Development， Anticancer Innovative Drug Research in Qinling，

Genetic Engineering Laboratory in Xian University， College of Biology and Environmental Sciences， Xian University，

Xian 710065， China; 2.School of Life Science and Technology， Xian Jiaotong University， Xian 710049， China）

Abstract Fomitopsis pinicola （Sw. Ex Fr.m） Karst （FPK） is a traditional Chinese herb for treatment of fever， analgesic， anti-inflammatory and especially for antitumor， but the inhibitory effect of active compounds on the proliferation of leukemia cells and its potential mechanism remains unclear. The present study was to evaluate the possible anti-proliferative activity of three organic fractions from F. pinicola on three leukemia cells. MTT assay showed that FPK chloroform extract （FPKc） displayed higher anti-tumor effect on U937 cells than that of ethylacetate and butanol fraction. Flow cytometry studies revealed that FPKc induced ROS accumulation in U937 cells. Loss of plasma and mitochondrial membrane potential， increase of intracellular Ca2+ concentration and the rate of apoptosis were observed clearly after treatment with FPKc. However， NAC as ROS inhibitor， could significantly alleviate the occurrence of cell apoptosis and improve the ratio of viable cells. Therefore， ROS generated in U937 cells played an important role in F. pinicola induced apptosis.

Keywords Fomitopsis pinicola （Sw. Ex Fr. m） Karst; Human acute mononuclear leukemia U937 cells; reactive oxygen species; cell apoptosis

紅緣擬層孔菌Fomitopsis pinicola （Sw. Ex Fr.m） Karst. 屬擔(dān)子菌綱Basidiomycetes、非褶菌目Aphyllophorales、多孔菌科Polyporaceae、擬層孔菌屬Fomes，又名紅緣層孔菌、紅緣多孔菌、松生擬層孔菌、紅緣樹(shù)舌、紅帶菌等，為北半球針葉林區(qū)廣泛分布的木腐真菌，多見(jiàn)于我國(guó)長(zhǎng)白山及秦嶺地區(qū)［1］。《中國(guó)藥用真菌》記載，紅緣擬層孔菌味微苦、性平、無(wú)毒，能祛風(fēng)除濕、解熱、強(qiáng)心、補(bǔ)肺益腎、和胃健脾、安神定志、扶正培本［2］。自1960年至今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明，紅緣擬層孔菌含有多糖、萜類、腦苷脂類、油酸、亞油酸、棕櫚酸等成分，且有抑菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等功效［3-7］。近年來(lái)，有學(xué)者陸續(xù)報(bào)道紅緣擬層孔菌的弱極性化合物也表現(xiàn)出抗腫瘤、抗氧化、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛等生理活性［8-12］，但具體作用機(jī)制研究尚不充分。因此，本研究以體外培養(yǎng)的白血病細(xì)胞為模型，評(píng)價(jià)紅緣擬層孔菌各極性組分的抗腫瘤活性，進(jìn)而分析活性組分對(duì)人急性單核白血病U937細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species， ROS）、線粒體膜電位、細(xì)胞質(zhì)膜電位、Ca2+濃度和細(xì)胞凋亡率的影響，探討ROS造成的膜損傷在紅緣擬層孔菌殺傷U937細(xì)胞中的作用，以期為菌物藥的研究與開(kāi)發(fā)利用積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株人慢性髓系白血病K562細(xì)胞、人急性單核白血病U937細(xì)胞由中國(guó)北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)引進(jìn)，將其培養(yǎng)于含10％（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中;小鼠白血病L1210細(xì)胞、人胚腎上皮HEK-293細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心引進(jìn)，將其培養(yǎng)于含10％（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中;以上細(xì)胞均在5％（體積分?jǐn)?shù)）CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物及制備紅緣擬層孔菌子實(shí)體采自陜西秦嶺平河梁，海拔2 193～2 352 km，33°27′385N～33°27′960N，108°30′087E～108°30′093E。經(jīng)陜西師范大學(xué)肖婭萍教授鑒定為紅緣擬層孔菌Fomitopsis pinicola （Sw. Ex Fr.m） Karst.，標(biāo)本存于西安文理學(xué)院標(biāo)本館（NO.201506001）。將紅緣擬層孔菌子實(shí)體清洗、烘干、粉碎，稱取400 g粉末，加入30倍體積的95％乙醇超聲提取，濾液減壓濃縮得浸膏122.7 g（得率30.68％），用蒸餾水混懸后依次用氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，得到紅緣擬層孔菌氯仿組分（FPKc）、乙酸乙酯組分（FPKe）、正丁醇組分（FPKb），分別相當(dāng)于生藥量的16.98％、1.01％、0.94％。在生物安全柜中用DMSO配制濃度為100 mg／mL的儲(chǔ)存液，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋為工作液。

1.1.3 主要試劑胎牛血清（Gibco公司）;RPMI-1640、DMEM、無(wú)菌PBS、谷氨酰胺、胰酶、雙抗（HyClone公司）;DMSO、MTT、羅丹明123、DCFH-DA、NAC、DiBAC4、Fluo4-AM（Sigma公司）;細(xì)胞凋亡試劑盒（Millipore公司）;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器超純水儀、CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）;生物安全柜（BAKER公司）;酶標(biāo)儀（BioTek公司）;流式細(xì)胞儀（Millipore公司）;高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）;超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞、U937細(xì)胞、L1210細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞，分別制成單細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)／孔接種于96孔培養(yǎng)板，置于5％（體積分?jǐn)?shù)）CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后，分別加入0 ～ 250 μg／mL的FPKc、FPKe、FPKb含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48 h向待測(cè)孔板中避光加入MTT（2.5 mg／mL， 20 μL／孔）溶液，孵育4 h后終止培養(yǎng)，平板離心機(jī)3 kr/min離心15 min后，棄去上清培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床震蕩15 min，待藍(lán)紫色甲瓚完全溶解后，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm吸光度值。以對(duì)照組的吸光值為空白對(duì)照調(diào)零，取至少6孔的平均值計(jì)算細(xì)胞的存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按照公式：細(xì)胞存活率=（藥物組OD570／對(duì)照組OD570）×100％計(jì)算經(jīng)過(guò)藥物處理后的細(xì)胞存活率，結(jié)合藥物的作用劑量，推算出藥物對(duì)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50，以此衡量藥物的抗腫瘤活性。

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)熒光探針DCFH-DA是一種自身無(wú)熒光的親脂性ROS指示劑，其進(jìn)入細(xì)胞可被酯酶水解成無(wú)熒光形式的DCFH，后者可被胞內(nèi)O-2·、OH·、H2O2 等氧化成具有熒光的DCF，在藍(lán)光激發(fā)下產(chǎn)生綠色熒光，熒光的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)組1：U937細(xì)胞經(jīng)不同劑量FPKc處理，分別于1、2、4、8 h收集各組細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)組2：U937細(xì)胞經(jīng)5 mM的活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）預(yù)孵育1 h后，加入40 μg／mL FPKc作用2 h;實(shí)驗(yàn)組3：HEK-293細(xì)胞經(jīng)40 μg／mL FPKc分別作用2、8 h。以上實(shí)驗(yàn)組收集細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌、重懸，加入終濃度為4 μM DCFH-DA 37 ℃避光孵育20 min，在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm條件下利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)CS Express V3軟件分析各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值（mean fluorescence intensity， MFI）。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞線粒體膜電位變化細(xì)胞線粒體具有內(nèi)負(fù)外正的跨膜電位，能夠攝入陽(yáng)離子染料羅丹明123（rhodamine 123， Rh123），發(fā)出綠色熒光，當(dāng)線粒體膜發(fā)生損傷時(shí)，跨膜電位降低或消失，攝入的熒光染料減少，熒光會(huì)減弱。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105cells／mL，向其中加入FPKc（10、20、40 μg／mL），分別于2、4、6、8 h離心收集各組細(xì)胞，PBS洗滌、重懸，加入終濃度為4 μg／mL的Rh123染液，37 ℃避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析各組細(xì)胞MFI。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞質(zhì)膜電位檢測(cè)DiBAC4是一種自身無(wú)熒光的親脂性陰離子熒光染料，當(dāng)細(xì)胞膜去極化時(shí)，膜電位下降，DiBAC4可進(jìn)入細(xì)胞與胞漿蛋白結(jié)合發(fā)出熒光。U937細(xì)胞經(jīng)FPKc（10、20、40 μg／mL）作用4 h后離心收集細(xì)胞，PBS洗滌、重懸，加入終濃度為1 μM的DiBAC4，37 ℃避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析各組細(xì)胞MFI。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測(cè)Fluo-4／AM進(jìn)入細(xì)胞后可被脂解為Fluo-4，后者可與胞內(nèi)游離的Ca2+特異性結(jié)合，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與Ca2+濃度成正比。U937細(xì)胞經(jīng)FPKc（10、20、40 μg／mL）處理4 h，離心收集細(xì)胞，基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌、重懸，加入終濃度為5 μM的Fluo-4／AM，37 ℃避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析各組細(xì)胞MFI。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 細(xì)胞凋亡率測(cè)定FPKc誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡率采用Guava Nexin Assay試劑盒進(jìn)行定量分析。Annexin V-PE用來(lái)檢測(cè)凋亡細(xì)胞的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻，而細(xì)胞膜非通透性染料7-AAD則作為細(xì)胞膜完整性受損導(dǎo)致細(xì)胞壞死的指示劑。密度為1×105cells／mL的U937細(xì)胞經(jīng)FPKc（10、20、40 μg／mL）作用24 h后，收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書要求，將100 μL工作液與100 μL細(xì)胞懸液混勻，37 ℃避光孵育20 min，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。試驗(yàn)重復(fù)3次，F(xiàn)CS Express V3軟件分析流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”表示，采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，選用Duncan法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多重比較結(jié)果用字母法進(jìn)行標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅緣擬層孔菌抗腫瘤活性組分篩選

將FPKc、FPKe、FPKb分別與小鼠白血病L1210細(xì)胞、人慢性髓系白血病K562細(xì)胞、人急性單核白血病U937細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)條件下共孵育，結(jié)果見(jiàn)表1。藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度與其細(xì)胞毒性呈反比，即IC50值越低，該藥物的細(xì)胞毒性越強(qiáng)。對(duì)FPKb而言，其對(duì)3種白血病細(xì)胞的IC50值均大于100 μg／mL，故FPKc與FPKe的抗腫瘤活性優(yōu)于FPKb。隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)PKc與FPKe對(duì)3種白血病細(xì)胞的增殖抑制能力均呈現(xiàn)不同程度的增加。藥物作用48 h后，F(xiàn)PKc對(duì)U937細(xì)胞的IC50為（12.76±1.27） μg／mL，為供試藥品中最小值，且其對(duì)K562細(xì)胞的殺傷能力也優(yōu)于FPKe，推斷FPKc是紅緣擬層孔菌細(xì)胞毒性成分富集部位。

相同條件下，將FPKc與人胚腎上皮HEK-293細(xì)胞和3種白血病細(xì)胞共孵育（見(jiàn)圖1），10 μg／mL的FPKc作用后，U937、L1210、K562細(xì)胞的存活率分別下降至57.85％、87.85％、78.26％，但HEK-293細(xì)胞的存活率為95.43％;當(dāng)FPKc的劑量增加至40 μg／mL，3種白血病細(xì)胞的存活率均降至半數(shù)以下，而HEK-293細(xì)胞的存活率仍為93.30％;以上結(jié)果提示，白血病細(xì)胞對(duì)FPKc的作用更為敏感。

2.2 FPKc對(duì)U937細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度與ROS含量呈正比，由圖2A可見(jiàn)，F(xiàn)PKc可顯著促進(jìn)U937細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，40 μg／mL作用2 h，ROS的含量逐漸上升接近峰值，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸回落，而當(dāng)作用劑量下降為10 ～ 20 μg／mL時(shí)，藥物作用8 h內(nèi)，ROS生成量穩(wěn)步上升。當(dāng)FPKc作用2 h，U937細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨FPKc劑量的增加逐步上升，差異顯著（P< 0.05），40 μg／mL處理組細(xì)胞內(nèi)ROS含量是對(duì)照組的2.28倍，而活性氧抑制劑NAC則可明顯緩解細(xì)胞內(nèi)ROS的增加（見(jiàn)圖2B）;這一趨勢(shì)可通過(guò)直方圖直觀反映，與對(duì)照組相比，40 μg／mL的FPKc作用可使細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)，表現(xiàn)為峰形右移且峰高上升趨向尖銳，加入NAC后，峰形左移且銳度下降，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度下降（見(jiàn)圖2C）。然而，40 μg／mL 的FPKc作用HEK-293細(xì)胞后，通過(guò)直方圖觀察到，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組峰形重疊，通過(guò)MFI值進(jìn)行分析，組間無(wú)顯著性差異（P> 0.05），說(shuō)明FPKc并未引起HEK-293細(xì)胞內(nèi)ROS水平的波動(dòng)。

2.3 FPKc對(duì)U937細(xì)胞線粒體膜電位的影響

U937細(xì)胞經(jīng)FPKc處理2 h后，與對(duì)照組相比（見(jiàn)圖3），細(xì)胞的熒光強(qiáng)度顯著下降，說(shuō)明藥物處理后細(xì)胞線粒體膜電位快速喪失，外膜發(fā)生去極化;在不同劑量處理組中均能觀察到，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，8 h內(nèi)細(xì)胞熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（見(jiàn)圖3A）。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)直方圖可直觀顯示，隨著FPKc劑量的增加，代表熒光強(qiáng)度的波峰明顯左移，MFI值顯著下降（P< 0.05），意味著細(xì)胞線粒體膜電位的下降與藥物濃度呈正相關(guān)（見(jiàn)圖3B）。

2.4 FPKc對(duì)U937細(xì)胞質(zhì)膜電位的影響

U937細(xì)胞與FPKc共孵育4 h后（見(jiàn)圖4），隨著藥物作用劑量的增加，代表熒光強(qiáng)度的波峰明顯右移，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著增加（P< 0.05）。表明FPKc能夠促使膜電位絕對(duì)值下降，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重去極化，且此趨勢(shì)具有劑量依賴性。

2.5 FPKc對(duì)U937細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量的影響

FPKc作用U937細(xì)胞4 h后（見(jiàn)圖5），與對(duì)照組相比，低劑量藥物并不能影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化，而中高劑量作用后，直方圖中的熒光峰明顯右移，此時(shí)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度顯著上升（P<0.05），說(shuō)明20、40 μg／mL FPKc可顯著提升細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。

2.6 FPKc誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡的分析

細(xì)胞凋亡是受到多基因調(diào)控的復(fù)雜生理過(guò)程，凋亡發(fā)生時(shí)位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的PS外翻至細(xì)胞膜表面，與被熒光素PE標(biāo)記的Annexin V特異性結(jié)合，發(fā)出綠色熒光;而當(dāng)細(xì)胞膜受損則可攝取7-AAD，呈現(xiàn)紅色熒光。圖6中活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整呈現(xiàn)紅綠熒光低染，位于點(diǎn)狀圖的左下角（LL）;當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡的時(shí)候會(huì)表現(xiàn)出綠高紅低，此時(shí)細(xì)胞位于右下角（LR）;隨著細(xì)胞膜受損程度的加劇，細(xì)胞進(jìn)入晚期凋亡，此時(shí)胞內(nèi)紅綠熒光強(qiáng)度均增加，細(xì)胞位于右上角（UR）;當(dāng)胞內(nèi)熒光綠低紅高則表明細(xì)胞已經(jīng)不可逆轉(zhuǎn)地走向死亡（UL）。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果見(jiàn)表2，對(duì)照組細(xì)胞存活率為（97.93±1.17）％，隨著FPKc作用劑量由10 μg／mL增加至40 μg／mL，活細(xì)胞比例降至（83.68±3.83）％、（59.70±0.85）％，此時(shí)凋亡細(xì)胞由（1.11±0.42）％驟增至（15.58±4.66）％、（32.53±6.10）％（P< 0.05）;當(dāng)NAC與高劑量藥物組共孵育后，凋亡細(xì)胞的比例顯著下降至（22.22±3.36）％（P< 0.05），同時(shí)伴隨著細(xì)胞存活率明顯回升到（75.37±1.56）％。

3 討論

腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康，目前臨床施用的手術(shù)、放療、化療等方法可在一定程度上緩解癌癥患者的病情，但伴隨而來(lái)的毒副作用也大大降低了患者的生存質(zhì)量。隨著科技的發(fā)展，層出不窮的分子層面?zhèn)€體化治療方案也將部分患者從死神手中解救出來(lái)，但高昂的醫(yī)療費(fèi)用也讓許多患者及家庭望而卻步［13］。中草藥藥源廣泛、價(jià)格低廉、應(yīng)用歷史悠久，具有不良反應(yīng)少、遺傳毒性低等優(yōu)點(diǎn)，可以在治療癌癥的同時(shí)對(duì)機(jī)體的功能從根本上進(jìn)行恢復(fù)，增強(qiáng)病人免疫力，延長(zhǎng)生存期，是當(dāng)前防治腫瘤新藥研發(fā)的熱點(diǎn)［14］。本研究以體外培養(yǎng)的人慢性髓系白血病K562細(xì)胞、人急性單核白血病U937細(xì)胞、小鼠白血病L1210細(xì)胞為模型，通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，篩選出紅緣擬層孔菌的氯仿組分（FPKc）是抗腫瘤活性物質(zhì)富集部位，這一結(jié)果也與孫雪等的研究［15］相互印證。該研究曾報(bào)道紅緣擬層孔菌氯仿提取物較石油醚和水層提取物而言，對(duì)H22荷瘤小鼠具有較高抑瘤率，且從氯仿提取物中分離出的化合物可顯著抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長(zhǎng)。同時(shí)，本研究提示FPKc對(duì)白血病細(xì)胞的毒性作用較正常組織來(lái)源的HEK-293細(xì)胞敏感。

中草藥次生代謝產(chǎn)物在化合物類型、結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出多樣性和復(fù)雜性，是一個(gè)天然形成的“組合化學(xué)樣品庫(kù)”，因而具有多層次、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的全方位調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，闡明中藥的抗腫瘤機(jī)制可加快新藥研發(fā)的進(jìn)程，成為中藥現(xiàn)代化發(fā)展的有利推手。對(duì)健康人群而言，體內(nèi)低濃度的ROS可作為信號(hào)分子參與各種生理活動(dòng)，但多數(shù)腫瘤患者體內(nèi)的ROS水平升高，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞處于相對(duì)較高的氧化應(yīng)激狀態(tài)［16-18］。因此，靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞成為抗癌新思路，并得到公認(rèn)和應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PKc可顯著提升U937細(xì)胞內(nèi)ROS水平，但未能引發(fā)HEK-293細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。結(jié)合MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，推測(cè)調(diào)節(jié)胞內(nèi)ROS水平的變化是FPKc選擇性殺傷U937細(xì)胞的可能機(jī)制。這與一些天然化合物，如冬凌草甲素［19-21］、木香烴內(nèi)酯［22］等類似，即通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞膜因其磷脂雙分子層的特殊結(jié)構(gòu)易成為ROS攻擊的靶標(biāo)，通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞膜通透性，進(jìn)而影響到細(xì)胞膜對(duì)離子的選擇透過(guò)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜電位發(fā)生改變［23-24］。本研究通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PKc能夠促使U937細(xì)胞膜電位絕對(duì)值下降，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重去極化，導(dǎo)致胞外Ca2+內(nèi)流，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著上升。眾所周知，Ca2+作為重要的第二信使參與細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)、周期調(diào)控、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞凋亡等生理活動(dòng)。當(dāng)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，可激活線粒體合成ATP，該過(guò)程伴隨著ROS的產(chǎn)生，線粒體產(chǎn)生的ROS可通過(guò)特定的通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeablity transition pore， mPTP）釋放至胞質(zhì)，維持線粒體內(nèi)氧化還原平衡［24-27］。當(dāng)線粒體鈣超載時(shí)，高水平的ROS刺激mPTP持續(xù)開(kāi)放，造成線粒體膜電位崩解，釋放大量促凋亡蛋白進(jìn)入胞質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［28-29］。本研究觀察到，經(jīng)FPKc處理后，U937細(xì)胞線粒體膜電位快速喪失，外膜發(fā)生嚴(yán)重去極化現(xiàn)象，同時(shí)細(xì)胞凋亡率顯著上升，但活性氧抑制劑能顯著緩解細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上，F(xiàn)PKc殺傷U937細(xì)胞可能通過(guò)促使白血病細(xì)胞內(nèi)ROS的過(guò)量積累，影響細(xì)胞膜的功能，導(dǎo)致胞內(nèi)維持高濃度Ca2+水平，進(jìn)而繼續(xù)促進(jìn)線粒體過(guò)量生成ROS，刺激線粒體mPTP持續(xù)開(kāi)放，釋放促凋亡蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡;同時(shí)，大量Ca2+流入胞質(zhì)，超載現(xiàn)象加劇，可能啟動(dòng)其他相關(guān)路徑，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，其具體調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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（編 輯 張 歡）